專利名稱：：在變形菌降解整個植物材料過程中糖酶的表達的制作方法在變形菌降解整個植物材料過程中糖酶的表達
背景技術(shù)：
：變形菌菌4朱2-40(在此表示為"S.degradans2-40")是能夠降解復雜多聚津唐(CP)的新興海洋細菌的代表。S.degradans保存在美國菌種4呆藏中心，"保藏編號為ATCC43961。S.degradans2-40是從腐爛的互花米草中分離出來的一種海洋？變形菌，互花米草是在切薩皮克灣流域的一種鹽沼澤中的繩索草。與它從腐爛的植物原料中分離得到的相一致，S.degradans菌4朱2-40能夠降解許多復雜的多聚糖，包括，纖維素，膠質(zhì)，木聚糖，和殼質(zhì)，這些都為高等才直物細月包壁的普遍組成部分。S.degradans菌4朱2-40也能夠解聚海藻細月包壁組分。如，瓊脂，瓊脂壽唐，和海帶多^f唐，以及，蛋白質(zhì)，淀粉，出芽短梗孢糖和海藻酸。除了能降解這種過多的聚合體，S.degradans菌林2-40能夠利用每種多聚糖作為唯一碳源。因此，S.degradans菌林2-40不僅是孩史生物降解不溶性復雜多糖(ICPs)的出色的模型，也能被用作完全代謝這些ICPS的范例。ICPs是聚合的糖類，用于構(gòu)成在動物和植物中的形狀和結(jié)構(gòu)。他們是水不溶的，因此它們不容易被降解。S.degradans菌才朱2-40需要至少1%的海鹽來維持生長，它能夠忍受高達10%的鹽濃度。S.degradans菌才朱2-40是需氧的，通常為棒狀的，通過單一極性鞭毛運動的高多晶的革蘭氏陰性菌。早先的工作已經(jīng)確定2-40能夠降解至少20種不同的碳水化合物聚合物(CP)，包括瓊脂，殼質(zhì)，褐藻酸，碳水化合物曱基纖維素(CMC),P-葡聚糖，海帶多糖，膠質(zhì)，出芽短梗孢糖、淀粉和木聚并唐。此夕卜，它能夠合成正確的酪氨酸酶。16SrDNA分析表明2-40是變形菌門的第三亞綱的成員，有關(guān)于Microbulbiferhydrolyticus和Teridinobactersp，與4§蟲且共生的能K解纖維素的固氮菌。瓊脂水解酶、殼多津唐酶和褐藻酸酶體系已經(jīng)^皮普遍了解了。酶i普活性凝月交表明這三種體系包含多種解聚酶且多種證據(jù)表明這些解聚酶中的至少一些粘附于細i包表面?；钚詫?瞼表明大多邀:S.degradans酶活性在CP上的指數(shù)生長期間，存在于細'胞組分中，而在其后的生長階^殳，大部分的活性存在于表面，而且細胞結(jié)合活性顯著降低(Stotz1994)。在CP的生長也伴隨在細胞形態(tài)上的顯著變化。葡萄糖生長培養(yǎng)的51.degradans具有相對較統(tǒng)一的細胞大小和形狀，而且通常4交平滑和具有無特;f正的細胞表面。然而，當在瓊脂糖、藻朊酸鹽、或幾丁質(zhì)上生長時，S.degradans細胞表現(xiàn)出異常的表面結(jié)構(gòu)和特^正。這里需要確定酶系統(tǒng)，該酶系統(tǒng)能4吏用纖維素作為底物，<吏用適當?shù)妮d體能夠表達編碼蛋白質(zhì)的基因，鑒定和分離氨基酸產(chǎn)物(酶和非酶的產(chǎn)物)，并4吏用這些產(chǎn)物以及包含這些基因的生物體，以達到生產(chǎn)例如乙醇的目的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了生產(chǎn)降解植物材料的混合酶的方法。優(yōu)選的，這種降解不需要對植物材沖牛進行化學預處理。這種方法包括在*合定植物材料存在的條件下，培育變形菌，接著檢測在變形菌中酶的表達。在給定植物材料存在的條件下，酶的表達量將增加，這些酶將組合形成酶的復合物，以降解給定的植物原料。本發(fā)明也提供了一種改進的細菌，這種菌在給定才直物原料存在的條件下，在變形菌中的表達是上調(diào)的，而且這種改進的細菌能夠以增長的速率，不受作用底物濃度的影響而快速合成。這種改進的細菌能夠以比非改進細菌快^艮多的速率降解給定的植物原料。本發(fā)明也^是供了生產(chǎn)乙醇的方法，其中，4吏用一種細菌來降解一種或多種植物原并牛，源于降解過程的單壽唐與一種或多種才直物原泮+形成水混合物，在這種混合物中生成乙醇。本領(lǐng)i或普通^支術(shù)人員已知乙醇可以通過4艮多途徑生成。在一種具體實施方案中，乙醇可以/人酵母菌的孩i生物降解產(chǎn)物中獲得。這種菌可以是變形菌林2-40或是響應給定植物原料存在的條件下，在變形菌中酶的表達量4是高的一種改進菌種。在本發(fā)明的特定具體實施方案中，微生物的含水混合物和一種或多種植物原料包含至少1%鹽和/或至多10%的鹽。本發(fā)明的這些實施方案還可以用于生產(chǎn)#唐，通過省略步-驟將^f唐轉(zhuǎn)化為乙醇。本發(fā)明也4是供了生產(chǎn)乙醇的方法，其中，混合酶一皮用于降解給定的才直物原料，在降解過程中生成的單并唐4皮用于生產(chǎn)乙醇。4吏用本領(lǐng)i或內(nèi)已知的4壬意方法生產(chǎn)乙醇知道，乙醇可以通過多種途徑生產(chǎn)。在一種具體實施方案中，乙醇通過酵母菌的孩丈生物降解產(chǎn)物中生成?；旌厦笧轫憫o定植物原料的存在而在變形菌抹2-40中表達量才是高的兩種或更多種酶。這些酶可以通過在此領(lǐng)域熟知的任何方法從變形菌林2-40中獲得。在本發(fā)明的特定具體實施方案中，蛋白質(zhì)和一種或多種才直物原并牛的含水混合物包含至少1%鹽和/或至多10%的鹽。在其他特定具體實施方案中，變形菌林2-40在第一份植物原料中生長直到OD,值從大約0.3增加到大約0.5。在其他特定具體實施方案中，變形菌4朱2-40生長直到OD6oo值/人大約5增加到大約10。在其他特定具體實施方案中，變形菌林2-40生長直到OD,值大于10。這些具體實施方案可以通過不添力口酵母而用于生產(chǎn)并唐。在一皮用于降解*會定植物原并牛的混合酶的更多特定具體實施方案中，該發(fā)明包括含有Cel5H和Cel5I—種配方。在其他特定具體實施方案中，該發(fā)明包括含有Cel5H和Cel5F的配方。在一皮用于降解,會定才直物原并牛的混合酶的可^辦4戈的具體實施方案中，該發(fā)明包括含有Cel5F，Cel5H,Cel51,Cep94A和Cep94B的配方。在更多特定的具體實施方案中，本發(fā)明包4舌進一步含有Cel6A,Bgl3C和Cel9B的配方。在更多特定的具體實施方案中，本發(fā)明包括進一步含有Cel5A、Cel5B、Cel5C、Cel5D、Cel5E、Cel5G、Cel5J、Cel9A、BgllA、BgHB、Ced3A和Ced3B的配方。在附加的具體實施方案中，本發(fā)明的組成物進一步包含酵母。在被用于降解給定植物原料的混合酶的可替代具體實施方案中，本發(fā)明包括含有Cel5E、Cel51、Cel9A、BgllA和Ced3B的配方。在更多特定具體實施方案中，本發(fā)明包括進一步含有Cel5B、Cep94A和Cep94B的配方。在附力口的具體實施方案中，本發(fā)明的組成物進一步含有酵母。在被用于降解給定植物原料的混合酶的可替代具體實施方案中，本發(fā)明包括含有Cel5F、Cel9A、BgllA和Ced3B的配方。在更多特定的具體實施方案中，本發(fā)明包括進一步含有Cel5B、Cel5E、Cel51、BgllB、BgBC、Cep94A和Cep94B的配方。在附加的具體實施方案中，本發(fā)明的組成物進一步包含酵母。在被用于降解給定植物原料的混合酶的可替代具體實施方案中，本發(fā)明包括含有Cel51、BgllA、BgllB、Ced3B和Cep94B的配方。在更多特定的具體實施方案中，本發(fā)明包括進一步含有Cel5A、Cel5G、Cel9A、Bgl3C和Cep94A的配方。在附加的具體實施方案中，本發(fā)明的組成物還進一步包括酵母。在被用于降解給定植物原料的混合酶的可替代具體實施方案中，9本發(fā)明包括含有Cel5E、Cel5F、Cel5H、Cel(3A和Cel9B的配方。在更多特定的具體實施方案中，本發(fā)明包凌舌進一步含有Cel51，Bgl3C和Cep94A的配方。在其4也特定具體實施方案中，本發(fā)明包4舌進一步含有Cel5C，Cel5D和Ced3A的配方。在附加的具體實施方案中，本發(fā)明的組成物進一步包括酵母。在一皮用于降解纟會定植物原料的混合酶的可替代具體實施方案中，本發(fā)明包括含有Xynl0a,Xynl0b和Xynlla的配方。在更多的特定具體實施方案中，本發(fā)明包4舌進一步含有XynlOD和XynllB的配方。在附加的具體實施方案中，本發(fā)明的組成物進一步包4舌酵母。圖1為柱狀圖，顯示在不同的底物下，S.degradans的生長率。圖2表示從在0.1%大麥p-葡聚糖或者HE纖維素上生長的S.degradans中提取的蛋白質(zhì)的SDS凝膠圖，該凝膠圖通過剛果紅染色。圖3顯示的柱狀圖示在葡萄糖，谷類，艾維素和新聞紙存在的條件下培養(yǎng)的S.degradans中纖維素分解酶的相對表達量。柱形脫離圖的比例尺寸，以它們上面的標號表示。圖4是線形圖，表示當在纖維素上超時生長時，在變形菌林2-40中cel5A,cel5H和cel51的表達倍-凄丈變化<直。圖5為線性圖，表示當在纖維糊精，纖維二糖,cellotraose和艾維素上生長時，在變形菌林2-40中cel5H的相對表達水平。圖6為^主狀圖，表示在木聚并唐存在下i咅養(yǎng)的S.degradans中的hemicelIul水解酶的表達倍數(shù)變化值。圖7為柱狀圖，表示在木聚糖存在的條件下，在不同時間上，在S.degradans中hemicellullytic酶的表達^f咅凄t變^HM直。具體實施例方式變形菌2-40是一種海洋細菌，能夠使用分泌的和表面連接的酶降解存在于高等植物細J包壁的所有的聚合體。這種細菌具有特殊的能力能夠在不做化學預處理的條件下糖基化所有植物原料。例如，這種細菌能夠以如下原^H乍為p舉一碳源(在相同濃度下的細月包增代時間，h):葡萄外唐(2.6),艾維素(2.25),燕麥斯《風爾特小麥木聚糖(1.6),新聞紙(>6)，整體和粉石卒的谷類葉片(>6),和磨碎的黍?qū)賤igatum葉片(>6),這種細菌表明能夠協(xié)同有效生產(chǎn)半纖維素酶，膠質(zhì)酶，纖維素酶，和可能地木質(zhì)素酶?；蚪M序列分析預測這種細菌能夠生產(chǎn)至少12種內(nèi)切葡聚糖酶，1種外切酶，2種纖維糊4青酶，3種纖維二4唐酶，7種木聚4唐酶，IO種"阿拉伯樹膠酸酶"，5種甘露聚糖酶，和14種力交質(zhì)酶。酶語分析和培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)組學分析表明這些酶的子集是在每種上述底物上生長期間一皮i秀導生成的。特定酶的i秀導生成通過qRT-PCR評定。這些特定酶的命名在美國專利申請?zhí)枮?1/121,154的申請中有進一步的詳細解釋，該專利于2005年4月4號遞交，7>開號為2006/0105914，該申i青通過引i正在ot匕全部并入本文。S.degradans能有效的降解植物原料，因此，產(chǎn)物由植物原料構(gòu)成。因而，在特殊植物原料存在下，在S.degradans中混合酶的誘導表達表明單個酶和酶的混合物在S.degradans存在的條件下，都能有效的降解植物原料。這個意思是指響應特定的植物原泮+,在SI.degradans中兩種或多種酶的才是高的或維持不變的高表達，將^皮用于形成酶的混合物，用以降解才直物原并牛。通過S.degradans有效降解為單并唐的兩種才直物原沖+類型為富含纖維素和半纖維素的才直物原沖+。降解這兩種-友水4b合物的酶系統(tǒng)在下面僻:了更詳細地描述。纖維素S.degradans2-40為了降解纖維素成單4唐而表達了許多酶。例如，在谷類葉片存在的條件下，纖維素分解酶列于表l中，下面是增加的。表1予貞觀'JS.degradans菌才朱2-40白勺纟千纟t素酵和W十屬酵，禾口支持他們鑒定的證據(jù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在谷類葉片存在的條件下，由S.degradans產(chǎn)生的表達量增加的酶可能是分解谷類葉片生成糖所必須的。因此，酶的表達量增加超過20倍，即，cel5F，cel5h在降解谷類葉片方面是有效的。進一步地，在表1中列出的所有或任4可4交少量的纖維素分解酶的混合物與表l中列出的表達量的增加成正比或反比，或與圖3中的相對表達量成正比或反比，用于形成一種有歲文的酶復合物，以降解谷類葉片。使用表l提供的信息，針對葡萄糖，新聞紙或艾維素生成對應的混合物。更進一步的，降解其他才直物原并+的混合物的生成是通過暴露S.degradans于該一直物原^H得來的，通過檢測降解酶的RNA,蛋白質(zhì)或活性程度來測定降解酶的表達。此外，在表2中列出的酶是當暴露于化學純形式的艾維素10個小時后，在S.degradans中"i秀導生成的酶。表2在艾維素上，S.degradans菌4朱2-40經(jīng)過10個小時生長后，酶的倍凄t增加。在艾維素上生長10個小時后的倍數(shù)增加基礎(chǔ)表達低中高(<5)(5-25)(>25)低(<1%GK)ce膨中(2-10%)，C高(>10%)，A，S看來好像cel5A、cel5G、cel9A、cel5B、ced3B、bgllA和cep94B在S.degradans2-40中不受底物;農(nóng)度影響而#1表達。在艾維素上生長2個小時后，cel9A的表達增加。4妄著在4個小時后，cel5F表達增力。，在10個小時后cel5H和cel5I表達增加。在艾維素上培養(yǎng)24小時，Cel51將繼續(xù)被過量表達。已經(jīng)表明Cel51和Cel5H對降解纖維素尤為重要。當SI.degradans2-40暴露于纖維素(圖4)時，Cel5I將"i秀導表達超過500倍，cel5H超過1004咅。ot匕夕卜，當S.degradans2畫40暴露于纖維糊^f青，例如纖維二if唐，cellotraose和纖維糊^青(圖5)時，cel5H表達超過500倍。因此，這些蛋白質(zhì)的任何一個都能用來有效的降解纖維素生成單4唐。更進一步的，當暴露于特定的植物原料時，在S.degradans中高表達的降解作用酶可能不受底物濃度影響和/或在工程菌中過量表達，因此，可以制備一種工程菌，該菌能夠有效的降解特定的植物原料。例如，在表l中的，在谷類葉片存在的條件下，在S.degradans中誘導生成的蛋白質(zhì)混合物，可以被這種菌釆用，以便使它們能夠不受底物濃度影響而被表達。這些蛋白質(zhì)也可以被引入，所以它們能夠高速的表達。這些工程菌可以用來降解植物原#牛，在這個例子中，為谷類葉片。在一種具體實施方案中，被工程化的菌為S.degradans。在另一種具體實施方案中，在大腸桿菌中，菌^皮工程化。半纖維素S.degradans2-40表達許多降解半纖維素生成單#唐的酶。半纖維素為糖單體的短分支鏈。組成半纖維素的糖包括戊醛糖，甘露糖，半乳糖，和/或阿拉伯糖。半纖維素與纖維素和果膠形成一系列的交^:,而形成堅固的細胞壁。不同于纖維素，半纖維素主要是無定形的，相對不牢固的和易發(fā)生水解的。S.degradans生產(chǎn)i午多半纖維素酶，該酶能夠3皮用于降解半纖維素生成單糖。如圖6所示，在包含半纖維素的木聚糖上生長的S.degradans2-40中的xynlOA、xynlOB、xynlOD、xynllA和xynllB的表達3皮omduced。此夕卜，如在圖7中顯示的，在木聚糖上培養(yǎng)S.degradans2-4010個小時后，將有xynlOA，xynlOB，xynlOD,xynllA禾口xynllB的表達。，然而，在2個小曰于，表達量i曾力口最大的為xynllA和xynllB，而在4個小時，在木聚糖上培養(yǎng)的S.degradans2-40中表達量i曾力口最大^i為xynlOA。因jt匕，XynlOa,XynlOb,XynlOd，Xynlla和Xynllb只于于降解半纖維素生成單#唐都是重要的。然而，需要特別重點強調(diào)的是XynlOa,XynlOb,Xynlla和Xynllb的重要性。S.degradans蛋白質(zhì)在大腸菌中的克隆和表達基本的克隆和表達系統(tǒng)為，使用pET28B(Novagen)作為載體，大腸桿菌DH5a(invitrogen)作為克隆菌4朱，和大腸桿菌BL-21(DE3)ROSETTATM細胞(Novagen)作為蛋白表達菌才朱。這個系統(tǒng)允許克隆有毒或相當困難的基因，因為該載體在T7lac啟動子控制下表達，在克隆沖朱DH5a缺失該啟動子，,人而在質(zhì)粒篩選和增殖期間，能夠消除較低水平的表達。在通過藍/白斑篩選后，質(zhì)粒從DH5a純化，并轉(zhuǎn)染到宿主中表達。ROSETTATM菌4朱具有T7lac啟動子，允許IPTG誘導表達載體編碼的蛋白質(zhì)，并缺失Lon和Omp蛋白酵。基因才莫型的核苷酸序列是,人DOEJGI'sS.degradans基因組網(wǎng)絡(luò)服務器中獲得，并且進入PRIMERQUESTTM設(shè)計工具。設(shè)計參數(shù)最佳Tm為60，最佳引物長度為20nt，最佳GC。/。50,選定產(chǎn)物大小范圍，所以選擇的引物在每個ORF的第一個和最后IOO個核苷酸之內(nèi)，以4更能夠盡量克隆出更多的基因?？寺『捅磉_載體，pET28B，提供C末端6x組氨酸融合以及起始和終止蛋白質(zhì)表達的密碼子。因此，載體的設(shè)計要小心注意，當增力口5'限制酶切位點到PCR引物時，插入序列是需要的。形成的"加尾引物"要在26到30nt長之間，它們的序列要通過"有效的克隆"分析使用PDRAW程序包^皮核實。這一i殳計要允許載體和插入脫氧核糖核酸順序能夠凈皮標準限制性內(nèi)切酶切割和一皮連接在一起。檢測目標序列的氨基酸翻譯以便檢測由于引物設(shè)計錯誤所造成的4壬<可讀才匡移4立。通過才企測后，引凈勿可以乂人Invitrogen購買(Frederick,Md.)。PCR反應的5(H效升反應體系包含10pMol的正反向引物，1孩i升的10mMDNTPs，1.5孩i升的100mMMgCl2，和1樣￡升PROOFPROPfu聚合酶和0.5孩丈升作為才莫一反的2-40基因組DNA。PCRs條件使用針對加尾引物的標準參數(shù)和PfuDNA聚合酶。PCR產(chǎn)物通過QIAGENQIAquickPCR純化試劑盒而一皮純化，通過0.8。/。瓊脂糖凝膠7見察。在純化和大小證實后，PCR產(chǎn)物和pET28B被適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化，通常為Ascl和CIaI在37。C反應1到4小時，使用QIAquick試劑盒純化，通過瓊脂糖凝膠觀察。純化的消化物通過使用T4DNA連接酶在室溫下的黑暗處連接反應至少2個小時。連接產(chǎn)物通過電穿孔的方式轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a中。轉(zhuǎn)化細胞在37'C非選擇性的培養(yǎng)基中孵育1個小時，才妄著涂布于含有氨千青霉素和X-gal的LB瓊脂上。作為pET28B載體，Ampr基因和插入物被克隆到lacZORF中，白色群體包含插入序列。白色菌落通過牙簽^兆取，涂布在新的LB/Amp/X-gal平皿上，同時三個插入碼菌落也被用于過夜接種到3ml的肉湯中。從對應于插入碼菌落的肉湯中制備質(zhì)粒，該菌落在過夜生長后然保持白色。這些質(zhì)粒的制備通過適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶各自地消化，通過瓊脂^唐電泳進^f于大小確定。接著質(zhì)粒^皮熱激轉(zhuǎn)化到ROSETTATm菌抹中。轉(zhuǎn)化細胞在非選擇性的拯救培養(yǎng)基中，37。C培養(yǎng)1個小時，接著涂布在含有Amp和Cm(ROSETTAi咅養(yǎng)基)的LB瓊月旨上，37。Ci告養(yǎng)過夜。因此選擇的任何菌落都應包含載體和插入物。這個通過插入三個菌落到ROSETTATM培養(yǎng)板中和過夜接種到對應3ml的肉湯中來16確定。次日早晨肉湯被用于接種到25ml的肉湯中，培養(yǎng)到OD600值大約為0.6(2-3個小時)。此時，從培養(yǎng)物中取出lml,離心和重懸于1/10體積IxSDS-PAGE上樣緩沖液中。這種預處理的樣品凍存于陽20°C中，以<更后來的Westernblots的4吏用。余下的肉湯加入1mMIPTG,37。Ci咅養(yǎng)4個小時。i秀導生成的沉淀才羊本以每小時間隔收集。這些樣品和預誘導的空白樣本同時經(jīng)過標準SDS-PAGE凝膠分離，電轉(zhuǎn)移到PVDF薄膜或硝化纖維薄膜上。這些薄膜4吏用1/5000稀釋的小鼠a-HISTAG單克隆一抗進行免疫印跡反應，，接著與HRP標記的山羊a-小鼠IgG作為二抗進4亍雜交。條帶通過使用BioRad'sOpti-4CN底物試劑盒進行顯色。在誘導樣品中存在His標記的條帶，而在空白對照中沒有相應條帶，這將證明表達的成功，同時通過每小時的時點條帶的比較來最佳化在隨后大規(guī)模純化中的誘導參數(shù)。重纟且蛋白質(zhì)的生產(chǎn)和純4匕表達菌4朱在500ml或1升ROSETTATM培養(yǎng)基的肉湯中生長至)JOD6o。為0.6至'J0.8。it匕日寸，3一"i秀導才羊口口口尋皮j]欠集，通過力口入100mMIPTG到余下的培養(yǎng)基中，使終濃度為1mM而進4亍誘導培養(yǎng)。誘導在37。C進行4個小時或者在25。C進行16個小時。培養(yǎng)物沉淀被收集，過夜凍存于-20。C儲存，以便幫助細胞溶解。然后沉淀物在)水上解凍10分4中，轉(zhuǎn)移到預稱重的falcon離心管中，并稱量重量。接著樣品在4ml裂解液/濕粒料重量(g)中(8M尿素，100mMNaH2P04，25mMTris，pH8.0)中，25。C〉、昆懸1個小時。裂解物在15,000g條件下離心30分鐘，除去細胞石爭片。澄清的溶解產(chǎn)物(浮在表面的)吸入干凈的falcon管中，其中，在每4ml澄清裂解物中加入1mlQIAGEN50%Nickel誦NTA樹脂。這些混合物在室溫下，輕輕攪動以促進N廣2離子和重組體蛋白質(zhì)的His標簽之間的結(jié)合。結(jié)合完成后，懸浮液轉(zhuǎn)移到一次性微型柱中，流過物(結(jié)合后余下的溶解產(chǎn)物)；陂收集，保存以便隨后的評定。樹脂通過裂解緩沖液洗兩次，纟爰沖液的pH值要調(diào)到7.0;每次洗液的體積等于原始澄清裂解物的體積。兩次清洗的流過物也要收集，用于后來的免疫印跡實驗，來估計純化效率。此時柱中包含相對純化的重組體蛋白質(zhì)，這些重組體蛋白質(zhì)由它們C末端的His標簽而被固定。這對于重折疊是理想狀況，所以將柱子移入4。C的房間，并用一系列復性纟爰沖劑沖洗該柱，復性緩沖劑中含有不斷降低濃度的尿素。復性緩沖劑包含變化量的尿素溶于25mMTrispH7.4,500mMNaCl和20%甘油。這種纟爰沖劑可制備包含6M,4M,2M和IM尿素的^f諸液。耳又出^f諸液的一部分4艮容易能混合形成5M和3M尿素溶液，因此能夠以1M為梯度的，一系列降低濃度的尿素溶液。相當于原始裂解物體積的6M緩沖劑流洗過柱，接著為等體積的5M緩沖劑，然后再接著1M的緩沖劑，其中1M的緩沖劑沖洗兩次，以保證在1M尿素中柱子的平衡。此時，重折疊蛋白經(jīng)過8次1/10原始體積的抽才是液進4亍才是耳又，其中4由^是液為1M尿素，25mMTrispH7.4，500mMNaCl,20%甘油并包含250mM。米唑。。米唑用來斷裂4臬離子和His標簽的相互作用，從而釋》文柱中的蛋白質(zhì)。免疫印跡反應用來評估His標簽蛋白質(zhì)在消耗的裂解物，兩次洗液，和4由才是組分中的量。如果重組體蛋白質(zhì)在消一毛的裂解物和/或洗液中含量豐富時，那么就可能要重復上述過程從而得到更多的蛋白質(zhì)。抽提液組分包含目的蛋白質(zhì)，要將它們合并，富集并使用centricon離心超濾裝置(Millipore),將它們保存于儲存緩沖液中(20mMTrispH7.4,lOmMNaCl,10%甘油)。4妻著分出一部分，凍存于-80。C，以1更用于酶活性;險測試—驗。實施例下列例子進一步的支持，并不是專門的展現(xiàn)本發(fā)明的較優(yōu)選的具體實施方案。酶的電泳分布圖流程所有活性凝月交都制備為標準SDS-PAGE;疑月交，并含有適當?shù)腃P底物，它們一起用分離凝膠分離。酶色譜使用8%聚丙烯酰胺濃度，底物溶于dH20和/或凝l交緩沖溶液，使終濃度為0.1%(HE-纖維素)，0.15%(大麥P-葡聚糖)，或0.2%(木聚糖)。樣品溶于終濃度包含2%SDS和100mM二好^蘇糖醇(DTT)的上樣緩沖液中，并與95。C煮沸8分鐘，接著凝月交按照Laemmli的程序，在非連續(xù)的條件下進行電泳分離。電泳完成后，凝膠在室溫80ml的復性緩沖液中浸泡1小時，復性緩沖液為20mMPIPES緩沖劑pH6.8,其中包含2.5%TritonX國100,2mMDTT和2.5mMCaC12。鈣離子用來幫助潛在的鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域的重折疊，例如LamlA的tsp3s。l個小時浸泡后，凝膠放于80ml的復性緩沖液中，4。C過夜并伴隨溫和震蕩。次日早晨。凝"交在室溫的條件下，；故于80ml的20mMPIPESpH6.8溶液中平衡1個小時，然后轉(zhuǎn)入干凈的容器中，用最少量的PIPES緩沖劑覆蓋，37。C孵育4個小時。聘育完后，凝膠使用0.25。/。剛果紅的水溶液(HE-纖維素，(3-葡聚糖和木聚糖)或者0.01曱苯胺藍的7%乙酸溶液進行染色30分鐘。對于剛果紅染色，凝』交-使用1M的NaCl脫色，對于^f吏用曱苯胺藍染色的凝月交，-使用dH20脫色，直到相對于背景色，能看見清楚的蛋白條帶為止。19實施例1:基因型分型的方法在不同底物上培養(yǎng)的S.degradans的生長速率(圖1)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基含有(2.3%速溶海鹽，0.05%酵母抽提物，0.05%NH4C1,15mMTris,pH6.8)。對于葡萄并唐，戊醛#唐，纖維二糖，阿4立伯糖，木聚糖，艾維素，其中每種碳源的終濃度為0.2%,而對于新聞用紙，柳沖支牙菱，和谷類葉片終濃度為1.0%。S.degradans生長于所有它生長的才直物原并牛上。酶的電泳分布圖的方法用于發(fā)現(xiàn)哪種葡聚糖酶在不同的細胞壁聚合體(圖2)上會被誘導生成。細胞在含有葡萄糖作為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長到OD,為0.3-0.5,收獲細胞，轉(zhuǎn)移到含有同樣體積的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基包含指定的誘導物。在指定的時間收集樣品，樣品中的蛋白質(zhì)規(guī)3各化到OD600,接著使用標準SDS-PAGE分離，其中在分離月交中含有0.1%大麥P-葡聚糖或HE纖維素。凝膠在復性緩沖液(20mMPIPES[哌。秦-N,N'-雙(2-乙烷磺酸基酸)]緩沖劑[pH6.8]，2.5%TritonX誦100,2mM二碌b蘇4唐醇,2.5mMCaCl2)中室溫孵育1小時，沖妄著在4"C新鮮復性纟爰沖液中孵育過4艾。凝月交4妄著轉(zhuǎn)入PIPES緩沖液中，37。C孵育，在0.25%剛果紅中染色。計算分子量(kDa)在左邊給出。使用不同植物原料或不同糖源的條件下，不同的葡聚糖酶被表達。在葡萄糖和細胞壁聚合體上生長時，纖維素水解酶的表達被確定(圖3)。S.degradans在葡萄并唐上i咅養(yǎng)到OD60。0.3-0.4，收獲細胞，轉(zhuǎn)到包含指定底物的等體積培養(yǎng)基。10個小時后，使用RNAprotect菌i式劑(Qiagen)和RNEASYMiniKit(Qiagen)分離RNA。使用QIANTITECT反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。每種指定基因的120-200bp片,殳或者兩個作為對照基因的鳥芬酸激酶和二氫葉酸還原酶4吏用SYBRGreen標準混合試劑盒(Roche)和LIGHTCYCLER480(Roche)進行擴增。在它們上面標有號碼的柱圖按照1/10比例顯示。不同的纖維素分解酶通過不同的植物原料或糖源誘導表達。實施例2S.degradans在木聚并唐上生長時，XynlOA,XynlOB,XynllA和Xynl舊表達量增力口的測定為六個目標基因i殳計引物xynlOA-D和xynllA-B,和兩個看家基因二氫葉酸還原酶和鳥苷酸激酶。S.degradans在葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到OD,達到0.370-0.400。記為0小時點，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到木聚糖培養(yǎng)基中進行10小時的實驗。秒計的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移回來作為對照。從木聚糖和葡萄糖培養(yǎng)物中在0,2,4和10小時耳又才羊品。每個才羊品的RNA4吏用RNAprotect菌i式劑(Qiagen)禾口RneasyMiniKit進4亍4是純。分離得到的mRNA4吏用QuantiTech反轉(zhuǎn)錄酶進4亍轉(zhuǎn)4匕，4吏用LightCyclerPropRT-PCR分才斤表達圖i普。如在圖6中戶斤示，所有的xynlOA,xynlOB,xynlOD,xynllA禾口xynl舊在暴露于木聚糖2，4，和IO小時后，都有mRNA的高表達。xynlOAxynlOB,xynllA和xynl舊表達增加最多。如在圖7中所示，S.degradans在木聚糖上培養(yǎng)，在2小時時，xynllA和xynUB具有最高的mRNA表達倍數(shù)變化。XynlOA在4小時時，達到最大表達倍數(shù)。在10個小時時，xynlOA,xynlOB，xynllA和xynUB都有較高的"i秀導表達4咅凄t。當培養(yǎng)物含有木聚糖時，S.degradans能夠增加這些蛋白質(zhì)的表達量，根據(jù)這些蛋白質(zhì)的序列同源性可以知道它們?yōu)榘肜w維素酶基因，XynlOA,XynlOB，Xynl0D,XynllA和XynllB是功能性的半纖維素酶，能用于降解半纖維素。同等物和通過引i正并入本領(lǐng)域普通才支術(shù)人員能夠但J又通過常*見實馬全而識另'j或確定在此描述的特定多肽，核香酸，方法，試-瞼和試劑的許多等同物。這些等同物^皮i人為包含于本發(fā)明的范疇內(nèi)，這些等同物包含在下列的權(quán)利要求書中。本申請包括許多已知文本，發(fā)表的文章，和專利申請以及在u.s.發(fā)行和外國發(fā)行的專利的引證，所有這些引i正的全部內(nèi)容通過引述在此全部并入本文。權(quán)利要求1.包含Cel5H和Cel5I的組合物。2.包含Cel5H和Cel5F的組合物。3.包含Cel5F、Cel5H、Cel51、Cep94A和Cep94B的組合物。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組合物，進一步包含CelA,Bgl3C和Cel9B。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的組合物，進一步包含Cel5A、Cel5B、Cel5C、Cel5D、Cel5E、Cel5G、Cel5J、Cel9A、BgllA、Bgl舊、Ced3A和Ced3B。6.才艮據(jù)4又利要求3所述的組合物，進一步包含酵母菌。7.包含Cel5E、Cel51、Cel9A、BgllA和Ced3B的組合物。8.4艮據(jù)4又利要求7所述的組合物，進一步包含Cel5B、Cep94A和Cep94B。9.才艮據(jù)4又利要求7所述的組合物，進一步包含酵母菌。10.包含Cel5F、Cel9A、BgllA和Ced3B的組合物。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，進一步包含Cel5B、Cel5E、Cel51、BgHB、Bgl3C、Cep94A和Cepp94B。12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，進一步包含酵母菌。13.包含Cel51,BgllA、Bgl舊、Ced3B和Cep94B的纟且合物。14.才艮據(jù)4又利要求13所述的組合物，包含Cel5A、Cel5G、Cel9A、Bgl3C和Cep94A。15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，進一步包含酵母菌。16.包含Cel5E、Cel5F、Cel5H、CelA和Cel9B的組合物。17.才艮據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，進一步包含Cel51、BgBC和Cep94A。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的組合物，進一步包含Cel5C、Cel5D和Ced3A。19.才艮據(jù)4又利要求16所述的組合物，進一步包含酵母菌。20.包含Xynl0a、XynlOb和Xynlla的組合物21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，進一步包含XynlOD和XynllB22.生產(chǎn)乙醇的方法，該方法包括-l是供變形菌一朱2_40;存在于水相混合物中的一種或多種才直物原坤+和酵母菌，/人而生產(chǎn)乙醇。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，水相混合物進一步包含至少1%的鹽。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中，水相混合物進一步包含至多10%的鹽。25.生產(chǎn)糖的方法，包括纟是供變形菌4朱2_40;存在于水相混合物中的一種或多種才直物原料，乂人而生產(chǎn)并唐。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，水相混合物進一步包含至少1%的鹽。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中，水相混合物進一步包含至多10%的鹽。28.從植物原料生產(chǎn)乙醇的方法，包括a.提供變形菌抹2-40;b.變形菌抹2-40生長在第一份的植物原料中；c.從變形菌抹2-40中提取蛋白質(zhì)；和d.將蛋白質(zhì)與第二份植物原料和酵母菌在J^容液中混合，乂人而生產(chǎn)乙醇。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，水相混合物進一步包含至少1%的鹽。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，水相混合物進一步包含至多10%的31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，變形菌株2-40在第一份植物原料中生長，直到OD綱從大約0.3增加到大約0.5。32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中，變形菌抹2-40在第一4分才直物原術(shù)+中生長，直到OD6卯乂人大約5增加到大約10。33.從植物原料生產(chǎn)糖的方法，包括a.提供變形菌林2-40;b.變形菌抹2-40生長在第一份的植物原料中;c.從變形菌林2-40中提取蛋白質(zhì)；和d.將蛋白質(zhì)與第二份植物原料在水溶液中〉、昆合，/人而生產(chǎn)#唐。34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，水相混合物進一步包含至少1%的鹽。35.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中，水相混合物進一步包含至多10%的36.^4居^L利要求33所述的方法，其中，變形菌4朱2-40在第一份植物原料中生長，直到OD6o。從大約0.3增加到大約0.5。37.才艮據(jù)4又利要求33所述的方法，其中，變形菌4朱2-40在第一份植物原料中生長，直到OD,從大約5增加到大約10。全文摘要本發(fā)明涉及細胞壁降解系統(tǒng)，尤其涉及到包含結(jié)合和/或解聚纖維素，半纖維素和其他碳水化合物的酶系統(tǒng)。這些系統(tǒng)已經(jīng)有了許多的應用。文檔編號C12N9/14GK101688189SQ200880022015公開日2010年3月31日申請日期2008年4月30日優(yōu)先權(quán)日2007年4月30日發(fā)明者R·威內(nèi)爾,S·赫特切桑,張海濤申請人:馬里蘭大學