專利名稱：包含優(yōu)良事件ee-gh6的抗蟲棉花植物及其鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物、植物材料及種子，其特征在于包含一個 特定的轉(zhuǎn)化事件，尤其涉及在棉花基因組的特定部位存在編碼可賦予昆蟲 抗性的蛋白質(zhì)的基因。本發(fā)明的棉花植物組合了昆蟲抗性表型、農(nóng)學(xué)性狀、 遺傳穩(wěn)定性以及對不同遺傳背景的適應(yīng)性(等同于非轉(zhuǎn)化棉花品系在無昆 蟲狀況下)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了在生物樣品中鑒定特別包含了轉(zhuǎn)化事件 EE-GH6的才直物材料的存在的方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
植物中轉(zhuǎn)基因的表型表達(dá)取決于基因本身的結(jié)構(gòu)以及其在植物基因 組中的位置。同時，在基因組不同位置的轉(zhuǎn)基因(作為外源DNA)的存在 將以不同的方式影響植物的整體表型。通過遺傳操作，在農(nóng)學(xué)上或工業(yè)上 成功地將商業(yè)上感興趣的性狀引入到植物中是一個長期的過程，這取決于 不同的因素?；蜣D(zhuǎn)化的植物的實際轉(zhuǎn)化和再生僅僅是一 系列選擇步驟的 第一步，選擇步驟包括廣泛的遺傳表征、育種和田間試驗評價，最終實現(xiàn) 優(yōu)良事件(elite event)的選擇。
棉纖維是全 世界最重要的紡織原料。全球每年收獲大約八千萬英畝棉 花。就面積產(chǎn)量而言，棉花是美國第五大作物，2000年其種植超過了一千 五百萬英畝。
以棉花為食的最具破壞性的昆蟲物種有谷實夜蛾(好e/Zcmw/7" (玉米果穗螟蛉或棉鈴蟲))、棉鈴蟲(//Wc"vw/ " tf/wZgem (美洲棉鈴 蟲))、煙芽夜蛾(//e//W/i/s Wr"cw^(煙青蟲))及斑實^M Oye//c<nwp"鑒于對新型食品和新型飼料的關(guān)注，GMO和非GMO產(chǎn)品的分開， 以及對專利材料的鑒別，優(yōu)良事件的明確鑒定正變得愈加重要。理想的是， 該鑒定方法既快捷又簡單，還不需要大量的實驗室設(shè)備。此外，該方法應(yīng) 提供不需專家解釋就能使優(yōu)良事件明確確定的結(jié)果，但是如果必要的話， 在專家仔細(xì)審查下，結(jié)果被證明有效。本文描述了用于在生物樣品中鑒定 優(yōu)良事件EE-GH6的特定工具。
在開發(fā)棉花(GM5y/;/ww A/z^"似/w)過程中，從轉(zhuǎn)基因棉花植物群體中將 EE-GH6鑒定作為優(yōu)良事件，其包含編碼來自蘇云金芽孢桿菌(5fl"7/附 Aw7Vig&附/s)的殺蟲晶體蛋白的基因。轉(zhuǎn)基因棉花植物包含編碼Bt殺蟲 晶體蛋白(如WO02/057664所述)的嵌合基因，其處于植物可表達(dá)啟動子 的控制之下。
包含抗蟲基因的棉花植物已經(jīng)在本領(lǐng)域中公開。但是，并沒有任何現(xiàn) 有技術(shù)公開內(nèi)，導(dǎo)或提示了本發(fā)明。
發(fā)明;f既述
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物，或其種子、細(xì)胞或組織，其包含穩(wěn)定整 合在其基因組中的表達(dá)盒，該表達(dá)盒包含含有cry2Ae基因編碼序列的抗蟲 基因(如本文實施例1.1所述)，其為抗蟲的，在無昆蟲壓力下，該轉(zhuǎn)基 因植物及其種子、細(xì)胞或組織具有與非轉(zhuǎn)基因的同基因系基本上相當(dāng)?shù)霓r(nóng) 學(xué)性能。在有昆蟲壓力下，該轉(zhuǎn)基因植物將具有比非轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)越的農(nóng) 學(xué)表型。
根據(jù)本發(fā)明，棉花植物，或其種子、細(xì)胞或組織包含優(yōu)良事件EE-GH6。 更確切地說，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因棉花植物、其種子、細(xì)胞或組織，其 基因組DNA的特征在于，當(dāng)使用兩個分別針對EE-GH6的5，或3'側(cè)翼區(qū) 和外源DNA的引物，用本文所述的PCR筌定方法分析時，得到EE-GH6 特異的片段。所述引物可以分別針對SEQIDNo: 1或SEQ ID No: 11內(nèi) 的5，側(cè)翼區(qū)和外源DNA，例如引物可以分別包含SEQ ID No: 5和SEQ ID No: 7的核苷酸序列或由其組成，得到100-700 bp的DNA片段，優(yōu)選大約197bp。該引物也可以分別針對SEQ ID No: 2內(nèi)的3，側(cè)翼區(qū)和外源DNA， 例如引物可以分別包含SEQ ID No: 4和SEQ ID No: 3的核苷酸序列或 由其組成，得到100-700 bp的DNA片段，優(yōu)選是大約189 bp。
包含本發(fā)明的優(yōu)良事件的參考種子已經(jīng)保藏在ATCC,保藏號為 PTA-8398。本發(fā)明的一個實施方案是，以ATCC保藏號PTA-8398保藏的 包含優(yōu)良事件EE-GH6的種子，它可以長成對昆蟲(特別是對實夜蛾屬物 種()或鈴夜蛾屬物種(/^//o說/ssp.))有抗性的棉花植 物。ATCC保藏號為PTA-8398的種子是一個種子庫，其中包含的至少大 約95%的轉(zhuǎn)基因籽粒對于所述轉(zhuǎn)基因是純合的，包含本發(fā)明的優(yōu)良事件， 這些種子可以長成抗蟲植物，因而這些植物也可以是草銨膦(glufosinate ) 耐受植物?？刹シN種子，且生長的植物可以用本文所述的草銨膦處理，從 而得到含有本發(fā)明的優(yōu)良事件的百分之百耐受草銨膦的植物。本發(fā)明進(jìn)一 步涉及由以保藏號PTA-8398保藏在ATCC的種子長成的包含本發(fā)明的優(yōu) 良事件的禕物而來的細(xì)胞，組織及子代和后代。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過以 保藏號PTA-8398保藏在ATCC的種子長成的包含本發(fā)明的優(yōu)良事件的棉 花植物的繁殖和/或育種可以得到的植物。本發(fā)明也涉及包含優(yōu)良事件 EE-GH6的棉花才直物。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定包含優(yōu)良事件EE-GH6的轉(zhuǎn)基因植物、或其細(xì) 胞或組織的方法，該方法是基于對轉(zhuǎn)基因植物、細(xì)胞或組織中的特征DNA 序列或由該DNA序列編碼的氮基酸的存在進(jìn)行鑒定。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的 實施方案，這樣的特征DNA序列是15bp的序列，優(yōu)選是20bp,最優(yōu)選 是30bp或更多，這些序列包含該事件的插入位點，即部分外源DNA和部 分與之相鄰的棉花基因組(5，或3，側(cè)翼區(qū))，這使得優(yōu)良事件可以被特別 鑒定。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及在生物樣品中鑒定優(yōu)良事件EE-GH6的方法，該方 法基于可以特異識別EE-GH6的5，和/或3'側(cè)翼序列的引物或探針。
更確切地說，本發(fā)明涉及包括擴(kuò)增生物樣品中存在的核酸序列的方法， 該方法使用至少兩條引物進(jìn)行聚合i^式反應(yīng)， 一條引物識別EE-GH6的5，或3'側(cè)翼區(qū)，另 一條引物識別外源DNA內(nèi)的序列，優(yōu)選得到一個100-500 bp的DNA片段。該引物可以分別識別EE-GH6的5，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列(SEQ ID No.l的1-140位的序列，或SEQ ID No.ll的1-463位的序列)或EE-GH6 的3，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列(SEQ ID No.2的113-438位的互補(bǔ)序列)，以及外 源DNA內(nèi)的序列(SEQ ID No.l的141-192位的互補(bǔ)序歹'J ，或SEQ ID No.2 的1-112位的序列)。識別5'側(cè)翼區(qū)的引物可以包含SEQ ID No.7的核苷 ,列，識別外源DNA內(nèi)的序列的引物可以包含本文所述的SEQ ID No.5 的核苷酸序列。識別3，側(cè)翼區(qū)的引物可以包含本文所述的SEQIDNo.3或 SEQ ID No.6的核普,列，識別外源DNA內(nèi)的序列的引物可以包含本文 所述的SEQ ID No.4的核苷酸序列。
本發(fā)明更特別地涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH6的方法，該 方法包括利用分別具有SEQ ID No.3和SEQ ID No，4的核苷酸序列的兩條 引物通過聚合酴漣式反應(yīng)擴(kuò)增生物樣品中的核酸序列，得到大約189bp的 DNA片段；或利用分別具有SEQ ID No.5和SEQ ID No.7的核苷紗列的 兩條引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增生物樣品中的核酸序列，得到大約 197bp的DNA片段。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及本文所述的EE-GH6的特異側(cè)翼序列，其可以用來 開發(fā)特定的鑒定方法來鑒定生物樣品中的EE-GH6。此類特定的側(cè)翼序列 在鑒定試驗中也可以用作參考對照材料。更特別的是，本發(fā)明涉及可以用 來開發(fā)如本文進(jìn)一步所述的特異引物和探針的EE-GH6的5，和/或3'側(cè)翼 區(qū)。也適合作為參考材料的是優(yōu)選為大約180-200 bp的核酸分子，其包含 可以被具有SEQ ID No.7和SEQ ID No.5，或SEQ ID No.4和SEQ ID No.3 的核苷酸序列的引物擴(kuò)增的序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及，基于這些特異引物和探針的使用，從而對生物樣 品中EE-GH6的存在進(jìn)行鑒定的方法。引物可以由17至大約200個連續(xù) 核苷酸的核苷酸序列組成，其選自SEQ ID No.l的1-140位核苷酸的核苷 酸序列、SEQ ID No.ll的1-463位核苷酸的核苷酸序列、或者SEQ ID No.2 的113-438位核普酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列；與由17至大約200個連續(xù)核苷酸的核苷^列組成的引物相組合，所述引物選自SEQ ID No.l的 141-192位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，及SEQ ID No.2的1-112位核 苷酸的核苷酸序列。引物也可以包含定位在3，末端的核苷酸序列，進(jìn)一步 包含無關(guān)序列，或來源于所述核苷酸序列但包含錯配的序列。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH6的試劑盒，所 述試劑盒包含至少一個可以特異識別EE-GH6的5，或3，側(cè)翼區(qū)或者可以特 異識別EE-GH6中外源DNA序列內(nèi)的特異重排的引物或探針。
除了可以特異識別EE-GH6的5，或3'側(cè)翼區(qū)的引物外，本發(fā)明的試劑 盒可以包含特異識別EE-GH6的外源DNA內(nèi)的序列的第二條引物，以便 用在PCR鑒定方案中。本發(fā)明的試劑盒可以包含至少兩個特異引物， 一個 識別EE-GH6的5，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，另一個識別外源DNA內(nèi)的序列。識 別5'側(cè)翼區(qū)的引物可以包含SEQIDNo.3的核苷^列，識別轉(zhuǎn)基因的引 物可以包含SEQ ID No.4的核苷酸序列或本文所述的任何其他的引物或引 物組合。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH6的試劑盒。所 述的試劑盒包含具有SEQ ID No.3和SEQ ID No.4的核苷酸序列的PCR 引物，用于本文所述的EE-GH6PCR鑒定方案中。
本發(fā)明也涉及鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH6的試劑盒。該試劑 盒包含特異探針，其具有相應(yīng)于(或互補(bǔ)于)與EE-GH6的特定區(qū)域具有 80-100%序列同一性的序列。優(yōu)選地，該探針的序列相應(yīng)于包含EE-GH6 的5，或3，側(cè)翼區(qū)的部分的特定區(qū)域。最優(yōu)選地，該特異探針具有(或互補(bǔ) 于)與SEQ ID No.l的120-160位核苷酸序列或SEQ ID No.2的102-123 位核苷酸序列有80-100%的序列同一性的序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，所公開的DNA序列包含了事件的插入位點， 以;SJL夠長的棉花基因組DNA和外源DNA (轉(zhuǎn)基因)的多核苷酸，以至 于可以用作引物或探針來檢測EE-GH6。此類序列在插入位點的每一側(cè)可 以分別包含棉花基因組DNA的至少9個核苷酸以及EE-GH6的外源DNA (轉(zhuǎn)基因)的相似數(shù)量的核苷酸。最優(yōu)選地，此類DNA序列包含棉花基因組DNA的至少9個核苷酸以及外源DNA的相似數(shù)量的核苷酸(與SEQ ID No.l或2的插入4立點相鄰)。
本發(fā)明所包括的方法和試劑盒可以用在不同的目的，例如但不僅限于 下列鑒定植物，植物材料或產(chǎn)品(例如但不僅限于包含或源于植物材 料的新鮮或加工的食品或飼料)中是否存在EE-GH6;另外地或備選地， 本發(fā)明的方法和試劑盒可用來鑒定轉(zhuǎn)基因植物材料，目的在于將轉(zhuǎn)基因或 非轉(zhuǎn)基因材料分離；另外地或備選地，本發(fā)明的方法和試劑盒可以用來確 定包含EE-GH6的植物材料的品質(zhì)(即純材料的百分比)。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及EE-GH6的5，和/或3'側(cè)翼區(qū)，還涉及從EE-GH6 的5，和/或3'側(cè)翼序列開發(fā)的特異引物和探針。
本發(fā)明也涉及從包含優(yōu)良事件EE-GH6的植物中得到的基因組DNA。 該基因組DNA可在本文所述的鑒定試驗中用作參考對照材料。
附圖簡述
下面的實施例，不是為了將本發(fā)明限制于所述的特定實施方案，而是 可以結(jié)合著附圖(并入本文作為參考)來理解。這些圖中


圖1圖示了引用的核苷酸序列與引物之間的關(guān)系。黑色條形外源 DNA;帶條紋的黑色條形EE-GH6特異的外源DNA中的重排；淺色條 形植物來源的DNA;帶條紋的淺色條形預(yù)插入乾位點缺失；箭頭寡 核普酸引物，條形下的數(shù)字代表核苷酸位置；(c)代表的是所指的核苷, 列的互補(bǔ)序列；NA:未使用。
圖2顯示為EE-GH6開發(fā)的PCR鑒定方案的結(jié)果。凝膠的上樣順序 泳道l:分子量標(biāo)記(100 bp序列梯)；泳道2-5:來自包含轉(zhuǎn)基因事件 EE-GH6的棉花植物的DNA樣品；泳道6和7:來自不包含優(yōu)良事件 EE-GH6但包含類似抗蟲基因的轉(zhuǎn)基因棉花植物的DNA樣品；泳道8:無 才莫板DNA對照；泳道9:分子量標(biāo)記。
圖3顯示為EE-GH6開發(fā)的接合性評分PCR方案得到的結(jié)果。凝膠 的上樣順序泳道l:分子量標(biāo)記(100 bp序列梯)；泳道2和3:來自包含純合形式的轉(zhuǎn)基因事件EE-GH6的棉花植物的DNA樣品；泳道4-6: 來自包含雜合形式的轉(zhuǎn)基因事件EE-GH6的棉花植物的DNA樣品；泳道 7:來自野生型棉花植物的對照DNA樣品；泳道8:無模板DNA對照；泳 道9:分子量標(biāo)記。
發(fā)明詳述
在植物基因組中摻入重組DNA分子典型地是由細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)化實 現(xiàn)的。摻入的特定位點通常是由于"隨機(jī)"整合決定的。
通過用重組DNA或"轉(zhuǎn)化DNA"轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織而引入到植物基 因組中并源于該轉(zhuǎn)化DNA的DNA在下文中稱為"外源DNA"，它包含一 個或多個"轉(zhuǎn)基因"。本發(fā)明文中的"植物DNA"指的是源于被轉(zhuǎn)化植物的 DNA。植物DNA通常見于相應(yīng)野生型植物的相同的基因座。外源DNA可 通過在植物基因組中重組DNA分子的摻入位點處的位置和結(jié)構(gòu)來表征。 植物基因組中重組DNA插入的位點也稱為"插入位點"或"靶位點"。重組 DNA插入到凈皮稱為"預(yù)插入植物DNA"的植物基因組的區(qū)域與植物DNA的 缺失相關(guān)，稱之為"耙位點缺失"。本文使用的"側(cè)翼區(qū)"或"側(cè)翼序列，，指的 是不同于引入的DNA的至少20 bp的DNA序列，優(yōu)選是至少50 bp，多 可至5000 bp;優(yōu)選地，源于植物基因組的DNA，它要么位于外源DNA 的緊上游區(qū)并與^目鄰，要么位于外源DNA的緊下游區(qū)并與"M目鄰。導(dǎo) 致外源DNA隨機(jī)整合的轉(zhuǎn)化程序會產(chǎn)生具有不同側(cè)翼區(qū)的轉(zhuǎn)化體，這些 側(cè)翼區(qū)對每個轉(zhuǎn)化體而言是特征性的且是獨特的。當(dāng)通過傳統(tǒng)雜交將重組 I)NA引入到植物中時，其在植物基因組中的插入位點，或其側(cè)翼區(qū)一般不 再改變。本文使用的"插入?yún)^(qū)"所指的區(qū)域?qū)?yīng)于至少40 bp的區(qū)域，優(yōu)選 是至少100 bp，多可至10000 bp，該區(qū)域包含在包含植物基因組中外源 DNA的上游和/或下游側(cè)翼區(qū)的序列內(nèi)?？紤]到由于種內(nèi)突變而引起的微 小差異，插入?yún)^(qū)當(dāng)雜交到同種植物中時將會保持與轉(zhuǎn)化植物中包含外源 DNA的上游和下游側(cè)翼區(qū)的序列有至少85%的序列同一性，優(yōu)選是卯％， 更優(yōu)選是95%，最優(yōu)選是100%序列同一性。事件的定義是(人工)基因座，由于基因工程方法，其攜帶了包含 至少一個拷貝的目的基因的轉(zhuǎn)基因。事件的典型的等位狀態(tài)是外源DNA 的存在或不存在。事件在表型上的特征是轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在基因水平上， 事件是植物的基因組成的一部分。在分子水平上，事件的特征在于限制圖 i普(比如可以通過Southern印跡法確定)，轉(zhuǎn)基因的上游和/或下游側(cè)翼 區(qū)，以及轉(zhuǎn)基因的分子標(biāo)記的位置和/或分子結(jié)構(gòu)。通常，用包含至少一個 目的基因的轉(zhuǎn)化DNA轉(zhuǎn)化植物可以得到一個轉(zhuǎn)化體群體，其包含大量獨 立的事件，其中每個都是獨特的。
本文使用的優(yōu)良事件，是選自一組事件的事件。該事件的獲得是基于 轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和穩(wěn)定性以及與包含優(yōu)良事件的植物的最優(yōu)農(nóng)學(xué)性狀的相容 性，用相同的轉(zhuǎn)化DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化或用轉(zhuǎn)化得到的植物進(jìn)行回交。因此， 優(yōu)良事件選擇標(biāo)準(zhǔn)為一個或多個，優(yōu)選地兩個或多個，優(yōu)選地所有下列標(biāo) 準(zhǔn)
a) 外源DNA的存在不損害植物的其他期望的特征，例如那些與農(nóng)學(xué) 性能或商業(yè)價值相關(guān)的特征；
b) 事件的特征在于穩(wěn)定遺傳的明確的分子結(jié)構(gòu)，并可為其開發(fā)出合適 的鑒定對照的工具；
c) 在事件的雜合的(或半合子的)和純合的條件下，并在環(huán)境條件范 圍內(nèi)的商業(yè)可接受的水平上(其中攜帶該事件的植物可能用在正常的農(nóng)業(yè) 環(huán)境中)，目的基因顯示出正確的，適當(dāng)?shù)暮头€(wěn)定的時空表型表達(dá)。
外源DNA優(yōu)選與植物基因組中的一個位置相關(guān)，這可允許其輕易地 漸滲入到期望的商業(yè)性遺傳背景中。
作為優(yōu)良事件的事件狀態(tài)，通過將優(yōu)良事件漸滲入到不同的相關(guān)遺傳 環(huán)境中并觀察其與上述標(biāo)準(zhǔn)(例如a, b， c)中的一個，兩個或所有的符合 來進(jìn)行確認(rèn)。
因此，"優(yōu)良事件，，指的是一個包含外源DNA的基因座，其符合上述 標(biāo)準(zhǔn)。植物，植物材料或其子代(例如種子)在其基因組中含有一個或多 個優(yōu)良事件。開發(fā)出來用于鑒定優(yōu)良事件，或包含優(yōu)良事件的植物，植物材料，或 由包含優(yōu)良事件的植物材料生產(chǎn)的產(chǎn)品的工具，是基于優(yōu)良事件的特定基
因組特征，例如包含外源DNA的基因組區(qū)、分子標(biāo)記或外源DNA的側(cè)翼 區(qū)序列特定的限制性圖譜。
一旦外源DNA的一個或兩個側(cè)翼區(qū)已經(jīng)測序，借助分子生物學(xué)才支術(shù)， 可以設(shè)計出特異識別樣品的核酸(DNA或RNA)中的這個(些)序列的引物 和探針。例如，可開發(fā)PCR方法鑒定生物樣品(例如植物，植物材料，或 包含植物材料的產(chǎn)品)中的優(yōu)良事件。這種PCR方法是基于至少兩個特異 "引物"， 一個識別優(yōu)良事件的5，或3，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，另一個識別外源 DNA內(nèi)的序列。優(yōu)選地，引物具有一個15-35個核苷酸的序列，其在優(yōu)化 的PCR條件下，分別可以"特異識別"優(yōu)良事件的5，或3'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列 和該優(yōu)良事件的外源DNA，從而可以從包含該優(yōu)良事件的核酸樣品中擴(kuò)增 出特異片段("整合片段"或鑒別擴(kuò)增子)。這意味著，在優(yōu)化PCR條件下， 只可以擴(kuò)增出靶向整合片段，而不會擴(kuò)增出植物基因組內(nèi)的其他序列或外 源DNA。
適于本發(fā)明的PCR引物可以是下面的
-具有17 nt至大約100 nt長度的寡核苷酸，在其3，末端包含至少17 個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其選自5'側(cè)翼序列 (SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的核苷酸序列，或SEQ ID No 11的1-463 位核苷酸的核普酸序列)(識別5'側(cè)翼序列的引物)；或
-具有17 nt至大約200 nt長度的寡核苷酸，在其3，末端包含至少17 個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，其選自3'側(cè)翼區(qū)(SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列)(識別3'側(cè)翼序列
的引物)；或
-具有17 nt至大約200 nt長度的寡核苷酸，在其3，末端包含至少17 個連續(xù)核苷酸，優(yōu)選20個核苷酸的核苷酸序列，其選自插入DNA序列 (SEQ ID No 1的141-192位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列)(識別外 源DNA的引物)；或-具有17 nt至大約40 nt長度的寡核苷酸，包含至少17個連續(xù)核苷酸， 優(yōu)選20個核苷酸的核普酸序列，其選自插入DNA序列(SEQIDNo2的 1-112位核苷酸的核普酸序列)。
引物當(dāng)然可以比提到的17個連續(xù)核苷酸更長，例如，可以是20，21，30， 35， 50， 75， 100， 150,200 nt的長度或更長。引物可以完全由選自提到的側(cè)翼 序列和外源DNA序列的核苷酸序列所組成。但是，引物的核苷酸序列在5， 末端(即位于3，端的17個連續(xù)核苷酸之外)是不太關(guān)鍵的。所以，引物的 5'序列可以由選自側(cè)翼序列或外源DNA的核苷酸序列所組成，但是還可以 適當(dāng)?shù)匕恍?例如1, 2， 5， 10個)錯配。引物的5，序列甚至可以完全由 與側(cè)翼序列或外源DNA無關(guān)的核苷酸序列所組成，例如，代表限制性酶 識別位點的核苷酸序列。優(yōu)選地，這種具有錯配的不相關(guān)序列或側(cè)翼DNA 序列應(yīng)該優(yōu)選不長于IOO個核苷酸，更優(yōu)選地，不長于50或甚至25個核 普酸。
此外，如果所述的3，末端的17個連續(xù)核苷酸不只是源自外源DNA或 SEQ ID No 1或2中的植物衍生序列，則合適的引物在其3，末端可以包含 跨越植物DNA衍生序列和外源DNA序列之間的連接區(qū)域(位于SEQ ID No 1的140-141位核苷酸和SEQ ID No 2的112-113 4立核苷酸)的核苷酸 序列或由該核苷*列組成。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，立刻就可以明白的是，適當(dāng)選擇的PCR引 物對不應(yīng)該包含互相互補(bǔ)的序列。
出于本發(fā)明的目的，"SEQ ID No: X代表的核苷酸序列的互補(bǔ)序列，，是 這樣的核苷酸序列，其是根據(jù)Chargaff規(guī)則將核苷酸用互補(bǔ)核苷酸替換 (AOT; G^C)而從所代表的核苷酸序列得到的核苷酸序列，并沿著5，-3， 的方向閱讀，即所代表的核苷酸序列的反方向。
合適的引物的例子有SEQ ID No 7的寡核苷酸序列(識別5，側(cè)翼序列 的引物)，SEQ ID No 5的寡核苷酸序列(識別外源DNA的引物，與識別5， 側(cè)翼序列的引物一起使用)，SEQ ID No 4的寡核苷酸序列(識別外源DNA 的引物，與識別3'側(cè)翼序列的引物一起使用)，SEQIDNo3、 SEQ ID No 6 18的寡核苷酸序列(識別3，側(cè)翼序列的引物)。
合適的寡核苷酸引物的其他例子在其3，末端包括下列序列或由這些序 列組成
a.識別5，側(cè)翼序列的引物
-SEQI關(guān)o -SEQIDNo -SEQI關(guān)o -SEQIDNo -SEQI關(guān)o -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo -SEQIDNo
的111-130位核苷酸的核苷酸序列 的104-123位核苷酸的核苷酸序列 的106-125位核苷酸的核苷酸序列 的112-130位核苷酸的核苦酸序列 的103-123位核苷酸的核苷酸序列 的109-125位核苷酸的核苦酸序列 的109-130位核苷酸的核苷酸序列 的113-130位核香酸的核普酸序列 的99-116位核苷酸的核苷酸序列 的102-123位核苷酸的核苷酸序列 的104-125位核苷酸的核香酸序列 的108-130位核苷酸的核苷酸序列 的114-130位核苷酸的核苷酸序列 的100-116位核苷酸的核普酸序列 的101-123位核苷酸的核苷酸序列 的103-125位核苷酸的核苷酸序列 的110-129位核苷酸的核苷酸序列 的109-129位核苷酸的核苷酸序列 的111-129位核苷酸的核苦酸序列 的108-129位核苷酸的核苷酸序列 的112-129位核苷酸的核苷酸序列 的107-129位核苷酸的核苷酸序列 的113-129位核苷酸的核苷酸序列 的287-306位核苷酸的核苷酸序列-SEQ ID No 1的288-306位核苷酸的核苷酸序列 -SEQ ID No 1的289-306位核香酸的核苷酸序列 -SEQ ID No 1的290-306位核苷酸的核苦酸序列 -SEQ ID No 1的264-281位核苷酸的核苷酸序列 -SEQ ID No 1的265-281位核苷酸的核苷酸序列
b. 識別外源DNA序列的引物，與識別5，側(cè)翼序列的引物一起使用: -SEQ ID No 1的140-159位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
-SEQ ID No 1的140-158位核苷酸的核香酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的139-158位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的140-160位核苷酸的核普酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的167-184位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的136-157位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的139-157位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的140-157位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的139-159位核苷酸的核普酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的140-161位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的140-156位核苷酸的核普酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的139-156位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的136-158位核苷酸的核普酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的139-160位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的139-155位核香酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 1的139-161位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列
c. 識別3，側(cè)翼序列的引物
-SEQ ID No 2的366-385位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 2的366-384位核苷酸的核苦酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 2的366-386位核苷酸的核苦酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 2的366-383位核苷酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 -SEQ ID No 2的366-387位核苷酸的核普酸序列的互補(bǔ)序列畫SEQ ID No 2的125-142位核苷酸的核苷,列的互補(bǔ)序列
-SEQ ID No 2的366-382位核苷酸的核普酸序列的互補(bǔ)序列
-SEQ ID No 2的94-115位核普酸的核苷酸序列的互補(bǔ)序列 d.識別外源DNA序列的引物，與識別3'側(cè)翼序列的引物一起使用
-SEQIDNo2的95-114位核香酸的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的96-115位核苷酸的核苷酸序列
-SEQIDNo2的95-115位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的96-114位核苷酸的核苷酸序列
-SEQIDNo2的97-115位核普酸的核苷酸序列
-SEQIDNo2的93-114位核苷酸的核香酸序列
-SEQIDNo2的94-115位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的98-115位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的92-114位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的93-115位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的98-114位核苷酸的核苷酸序列
-SEQ ID No 1的99-115位核苷酸的核苷酸序列 本文所用的"SEQ ID No. Z的X-Y位核苷酸的核苷酸序列"表示的是 包括兩個核普酸端點在內(nèi)的核苷酸序列。
優(yōu)選地，擴(kuò)增的片段具有50-500個核苷酸的長度，例如100-350個核 苷酸的長度。特異引物可以具有分別與優(yōu)良事件的5，或3，側(cè)翼區(qū)及其外源 DNA內(nèi)的序列有80-100%的同 一性的序列，條件是在優(yōu)化的PCR條件下 利用這些引物，錯配仍可以使優(yōu)良事件得到特異鑒定。但是，允許錯配的 范圍可以容易地通過實驗確定并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。
整合片段的檢測可以通過各種方式進(jìn)行，例如凝膠分析后的大小估計。 整合片段也可以直接測序。其他檢測擴(kuò)增DNA片段的序列特異性方法也 是本領(lǐng)域/>知的。
因為引物的序列及其在基因組中的相對位置對于優(yōu)良事件而言是獨特 的，所以只在包含優(yōu)良事件(的核酸)的生物樣品中才能發(fā)生整合片段的擴(kuò)增。優(yōu)選地，當(dāng)進(jìn)行PCR以鑒定未知樣品中EE-GH6的存在時，在一 組引物中應(yīng)包含對照引物，用對照引物可以擴(kuò)增含有該事件的植物品種的 "持家基因"內(nèi)的序列。持家基因是一些在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)并參與所 有細(xì)胞共同的基本代謝活動的基因。優(yōu)選地，從持家基因擴(kuò)增得到的片段 是比擴(kuò)增整合片段更大的片段。根據(jù)所分析的樣品，還可以包括其他對照。 本領(lǐng)域中描述了標(biāo)準(zhǔn)PCR方案，例如"PCR應(yīng)用手冊，，(Roche Molecular Biochemicals，第2版，1999)和其他參考書。PCR的優(yōu)化條件， 包括特異引物的序列，在每個優(yōu)良事件的"PCR鑒定方案"中進(jìn)行了規(guī)定。 但是，可以理解的是，PCR鑒定方案的許多M可能需要根據(jù)特定的實驗 室條件進(jìn)行調(diào)整，并進(jìn)行些許修改以得到相似的結(jié)果。例如，采用不同制 備DNA的方法可能需要調(diào)節(jié)下列參數(shù)，例如引物的用量，聚合酶，以及 使用的退火條件。類似地，其他引物的選擇可能支配PCR鑒定方案的其他 優(yōu)化條件。但是，這些調(diào)整對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，此夕卜， 在現(xiàn)有的PCR應(yīng)用手冊(例如上面引用的之一)中對此也進(jìn)行了詳述。
備選地，特異引物可以用來擴(kuò)增用作鑒定生物樣品中EE-GH6的"特 異探針"的整合片段。在允許探針與核酸中其對應(yīng)的片段雜交的條件下，將 生物樣品的核酸與探針接觸，導(dǎo)致形成核^/探針雜合體。雜合體的形成可 以進(jìn)行檢測(例如標(biāo)記核酸或探針)，其中雜合體的形成表明存在 EE-GH6?；谂c特異探針進(jìn)行雜交(在固相載體上或在溶液中)的此類 鑒定方法在本領(lǐng)域已有描述。優(yōu)選地，特異探針是在優(yōu)化條件下能與位于 優(yōu)良事件的5，或3，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的區(qū)域和(優(yōu)選地)也包含與^M目鄰的部分外 源DNA的區(qū)域(下文中稱之為"特異區(qū)域")特異雜交的序列。優(yōu)選地， 特異探針包含50-500 bp、優(yōu)選100-350 bp的序列，其與特定區(qū)域的核苷 酸序列有至少80%，優(yōu)選為80-85%，更優(yōu)選為85-90%,特別優(yōu)選為 卯-95%，最優(yōu)選為95-100%同一性(或互補(bǔ)性)。優(yōu)選地，特異探針將包 含與優(yōu)良事件的特異區(qū)域相同(或互補(bǔ))的大約15-100個連續(xù)核苷酸的序 列。
適合于作為檢測優(yōu)良事件EE-GH6的PCR引物的寡核苷酸也可以用來開發(fā)基于PCR的方案來確定優(yōu)良事件的接合性狀態(tài)。為此，兩個識別野生 型(wt)基因座的引物是這樣設(shè)計的它們互相指向并在其間有插入位點。 這些引物可以是分別特異識別包含在SEQ ID No l( SEQ ID No 11 )或SEQ ID No 2內(nèi)的5，和3，側(cè)翼序列的引物。這些引物也可以是特異識別5'或3， 側(cè)翼序列的引物(例如具有SEQIDNo7或SEQIDNo6的核苷酸序列的 引物)。這組引物，連同互補(bǔ)于轉(zhuǎn)化DNA序列的第三條引物(例如具有 SEQ ID No 5的核苷*列的引物) 一起允許診斷性PCR方法同時擴(kuò)增 EE-GH6特異的基因座和wt基因座。如果植物的轉(zhuǎn)基因基因座或相應(yīng)的 wt基因座是純合的，則診斷PCR將產(chǎn)生針對轉(zhuǎn)基因基因座或wt基因座典 型的、優(yōu)選典型長度的單一PCR產(chǎn)物。如果植物對于轉(zhuǎn)基因基因座是半合 子的，則將出現(xiàn)兩個基因座特異的PCR產(chǎn)物，這反映了轉(zhuǎn)基因基因座和 wt基因座均得到了擴(kuò)增。
此外，利用本文提供的優(yōu)良事件特異的序列信息，也可以開發(fā)不同于 基于PCR的擴(kuò)增方法的特異于優(yōu)良事件EE-GH6的檢測方法。這些備選 的檢測方法包括基于特殊核酸結(jié)構(gòu)的侵襲性切割的線性信號擴(kuò)增檢測法， 也叫做InvaderTM 4支術(shù)(例如記載于美國專利5,985,557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 和 6,001,567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage",此處將二者并入作為參考)。為 此，耙序列可以與包含SEQ ID No 1的141-148位核苷酸的核苷酸序列或 其互補(bǔ)序列的標(biāo)記的第一寡核苷酸或者包含SEQ ID No 2的95-112位核苷 酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的所述標(biāo)記核酸探針進(jìn)行雜交，或可以與包 含SEQ ID No 1的123-140位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的第二寡 核苷酸或者包含SEQ ID No 2的113-130位核苦酸的核苷酸序列或其互補(bǔ) 序列的所述的標(biāo)記核酸探針進(jìn)行進(jìn)一步雜交，其中，第一和第二寡核苷酸 至少重疊一個核苷酸。通過雜交獲得的雙鏈體或三鏈體結(jié)構(gòu)可以用酶 (Cleavase⑧)進(jìn)行選擇性探針切割，以留下完整的耙序列。切割的標(biāo)記探針 隨后凈皮檢測，并可能通過中間步驟產(chǎn)生進(jìn)一步的信號增強(qiáng)。
本文使用的"試劑盒"指的是用于完成本發(fā)明的方法的一組試劑，更特別地，是用于進(jìn)行生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH6的鑒定或者對包含 EE-GH6的植物材料的接合性狀態(tài)進(jìn)行確定的一組試劑。更特別地，本發(fā) 明的試劑盒的一個優(yōu)選實施方案包括上述的用于鑒定優(yōu)良事件的至少一個 或兩個特異引物，或者用于確定接合性狀態(tài)的三個特異引物。備選地，該 試劑盒進(jìn)一步包括在PCR鑒定方案中提到的任何其他試劑。備選地，根據(jù) 本發(fā)明的另一個實施方案，該試劑盒可以包括上面提到的特異探針，它可 以特異地與生物樣品的核酸雜交以鑒定EE-GH6的存在。備選地，該試劑 盒進(jìn)一步可以包括用特異探針對生物樣品中的EE-GH6進(jìn)行鑒定所用到的 任何其他試劑(例如〗旦不僅限于雜交緩沖液，標(biāo)記物)。
為了進(jìn)行質(zhì)量控制(例如種子批次的純度)、檢測植物材料或包含或 源自植物材料的材料(例如但不僅限于食物產(chǎn)品或伺料產(chǎn)品)中是否存 在優(yōu)良事件，可4吏用本發(fā)明的試劑盒，并可對其成分進(jìn)行特別地調(diào)節(jié)。
本文使用的有關(guān)核苷酸序列(DNA或RNA)的"序列同一性"指是用具有 相同核苷酸的位置數(shù)除以兩個序列中較短的那個序列的核苷酸數(shù)目。兩個 核苷酸序列的比對根據(jù)Wilbur-Lipmann算法(Wilbur and Lipmann， 1983， Proc. Nat. Acad. Sci, USA 80:726)進(jìn)行，該算法使用20個核苷酸的窗口大 小，4個核苷酸的字長，空位罰分為4 。對序列數(shù)據(jù)(包括上述的序列比 對)進(jìn)行計算機(jī)輔助分析和解釋可以采用，例如Genetics Computer Group 的序歹'J分才斤軟件包(GCG, University of Wisconsin Biotechnology center)方 便地進(jìn)行。分析的序列被認(rèn)為"基本上相似"是基于這些序列具有至少大 約75。/。的序列同一性，特別是至少大約80%,更特別是至少大約85%， 非常特別是大約90%，特別是大約95%，更特別是大約100%同一性。當(dāng) 將RNA序列表述為與DNA序列基本上相似或具有一定的序列同一性時， DNA序列的胸腺嘧啶(T)被認(rèn)為等同于RNA序列中的尿嘧啶(U),這一點 是清楚的。
本文使用的術(shù)語"引物"包含在模板依賴的方法(如PCR)中能夠引發(fā) 新生核酸合成的任何核酸。典型地，引物是含有10-30個核苷酸的寡核苷 酸，但也可以用更長的序列。盡管優(yōu)選使用單鏈形式的引物，但引物也可以是雙鏈的形式。探針可以用作引物，但其是被設(shè)計用來結(jié)合靶DNA或 RNA,并且不必用在擴(kuò)增過程中。
當(dāng)提及特異引物時本文使用的術(shù)語"識別"，是指這樣一個事實特異 引物在該方法中給出的條件下(例如PCR鑒定方案的條件)與優(yōu)良事件中 的核酸序列特異地雜交，其中，特異性是由陽性和陰性對照的存在來確定 的。
當(dāng)提及特異探針時，本文使用的術(shù)語"雜交"是指這樣一個事實在標(biāo) 準(zhǔn)的嚴(yán)緊性條件下，探針結(jié)合到優(yōu)良事件的核酸序列中的特異區(qū)域。本文 所述的標(biāo)準(zhǔn)的嚴(yán)緊性條件是指本文所述的雜交條件，或常規(guī)的雜交條件(見 Sambrook等人,1989， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY )。例如，所述雜交可 以包括以下步驟1)固定植物基因組DNA片段于濾紙上，2)在42。C下于 50%甲酰胺，5 X SSPE， 2 X Denhardt，s試劑和0.1% SDS中預(yù)雜交濾紙1-2 小時，或在68。C下于6 X SSC， 2 X Denhardt，s試劑和0.1% SDS中預(yù)雜交 濾紙1-2小時，3)加入已標(biāo)記的雜交探針，4)孵育l6-24小時，5)在室 溫下于IX SSC， 0.1 %SDS中洗涂濾紙20分鐘，6)在68。C下于0.2 X SSC， 0,1 。/。SDS中洗滌濾紙三次，每次20分鐘，7)使用一個增感屏在-70。C下 將濾紙暴露于X-射線膠片24-48小時。
本文使用的"生物樣品，，是植物，植物材料或包含植物材料的產(chǎn)品的樣 品。術(shù)語"植物"包含在任意成熟階段的棉花(C7仍^/7/"附Zi/M/7w附)植物組織， 也包含采自或源于此類植物的任何細(xì)胞，組織或器官，包括但不限于種 子，葉，莖，花，根，單細(xì)胞，配子，細(xì)胞培養(yǎng)物，組織培養(yǎng)物或原生質(zhì) 體。本文使用的"植物材料"是指從植物得到的材料。包含植物材料的產(chǎn)品 涉及食物，飼料，或用植物材料制造的或者可以被植物材料污染的其他產(chǎn) 品?？梢岳斫獾氖牵诒景l(fā)明上下文中，測試這些生物樣品中特異于 EE-GH6的核酸的存在，表明樣品中存在核酸。因此，這里涉及到的鑒定 生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH6的方法，涉及鑒定生物樣品中包含所述優(yōu) 良事件的核酸。本文使用的"包含"可以解釋為明確所表述的特征，整數(shù)，步驟，試 劑或成分的存在，但不排除一個或多個特征，整數(shù)，步驟，成分或其組的 存在或加入。因而，舉例說，包含某核苷酸或M酸序列的核酸或蛋白質(zhì) 可以包含比實際引用的更多的核苷酸或氨基酸，即包含于更大的核酸或蛋 白質(zhì)。包含功能上或結(jié)構(gòu)上確定的DNA序列的嵌合基因可以包含額外的 DNA序列等。
本發(fā)明還涉及將棉花中的優(yōu)良事件EE-GH6發(fā)育成包含該事件的植物， 從這些植物得到的子代，植物細(xì)胞，或源自該事件的植物材料。包含優(yōu)良 事件EE-GH6的植物可以按照實施例1所述得到。
包含EE-GH6的棉花植物或植物材料可以按照實施例2中關(guān)于 EE-GH6所述的PCR鑒定方案來確定。簡言之，存在于生物樣品中的棉花 基因組DNA通過PCR擴(kuò)增，使用的引物分別是特異識別EE-GH6的5， 或3，側(cè)翼序列中序列的引物(例如具有序列SEQIDNo:3的引物)，以及 識別外源DNA中序列的引物(例如具有序列SEQIDNo: 4的引物)。擴(kuò) 增部分內(nèi)源棉花序列的DNA引物可以用作PCR擴(kuò)增的陽性對照。如果進(jìn) 行PCR擴(kuò)增時，材料產(chǎn)生了預(yù)期大小的片段，則該材料包含來自含有優(yōu)良 事件EE-GH6的棉花植物的植物材料。
含有EE-GH6的植物的特征在于其昆蟲抗性，及其草銨膦耐受性。含 有EE-GH6的植物的特征還在于其農(nóng)學(xué)性狀(與美國商業(yè)上可獲得的品種 在無昆蟲壓力下的農(nóng)學(xué)性狀相當(dāng))。已經(jīng)觀察到，本文所述的在棉花植物 基因組的插入?yún)^(qū)域中外源DNA的存在可以賦予包含該事件的植物尤其感 興趣的表型和分子特征。
下面的實施例描述了優(yōu)良事件EE-GH6的鑒定以及在生物樣品中對優(yōu) 良事件EE-GH6進(jìn)行特異鑒定的工具的開發(fā)。
除非在實施例中另有說明，所有重組技術(shù)都是依照記載于"Sambrook J and Russell DW (編)(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，，和"Ausubel FA， Brent R, Kingston RE， Moore DD， Seidman JG， Smith JA和Stnihl K(eds.) (2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, New York"的標(biāo)準(zhǔn)程序完成的。
標(biāo)準(zhǔn)材料和參考文獻(xiàn)記栽于"Croy RDD (編)(1993) Plant Molecular Biology LabFax， BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford和Blackwell Scientific Publications, Oxford，，和"Brown TA， (1998) Molecular Biology LabFax,第2版，Academic Press, San Diego"。聚合^M式反應(yīng)(PCR) 的標(biāo)準(zhǔn)材料和方法見"McPherson MJ和M0ller SG (2000) PCR (The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford"和"PCR Applications Manual, 第 3版 (2006)， Roche Diagnostics GmbH, Mannheim 或 www,roche-applied-science.com "。
在詳述和實施例中，參考下列序列
SEQ ID No.1包含EE-GH6的5'側(cè)翼區(qū)的核苦酸序列
SEQ ID No.2'包含EE-GH6的3'側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列
SEQ ID No.3引物GHI058
SEQ ID No.4'引物GHI059
SEQ ID No.引物DPA286
SEQ ID No.6: 引物NEL115
SEQ ID No.: 引物NEL117
SEQ ID No.8: 用于擴(kuò)增對照片段的引物l
SEQ ID No.9: 用于擴(kuò)增對照片段的引物2
SEQ ID No.10: EE-GH6插入之前植物基因組耙序列的核苷*列
SEQIDNo. 11: 包含EE-GH6的5'側(cè)翼區(qū)的核苷酸序列(長)
實施例
1.優(yōu)良事件EE-GH6的鑒定
用包含處于花椰菜花葉病毒35S啟動子控制下，與Rubisco小亞基轉(zhuǎn) 運肽有效連接的經(jīng)修飾cry2Ae基因的編碼序列的載體轉(zhuǎn)化棉花得到的抗蟲棉花。
優(yōu)良事件EE-GH6是通過基于抗蟲基因的良好表達(dá)和穩(wěn)定性的廣泛的 選捧程序而篩選出來的，它與最佳的農(nóng)學(xué)性狀(例如植物高度、節(jié)高、棉
鈴保持力、直立能力、活力、纖維長度、纖維強(qiáng)度和棉絨產(chǎn)量)之間的相 容性也經(jīng)過了評價。
將篩選的事件引入到了不同的商業(yè)遺傳背景，并對不同地區(qū)的田間試 驗的結(jié)果進(jìn)行了比較。通過不同的處理方式，用害蟲攻擊植物。植物表現(xiàn) 出良好的昆蟲控制力。
另外，所述事件具有正常的葉，花和棉鈴形態(tài)，優(yōu)秀的繁殖力，而且 在多種遺傳背景中沒有表現(xiàn)出疾病或異常的昆蟲易感性。在漸滲入到多種 遺傳背景的過程中，沒有發(fā)現(xiàn)異常問題或異常狀況。 2.優(yōu)良事件EE-GH6的側(cè)翼區(qū)域的鑒定
利用Liu等介紹的熱不對稱交錯(TAIL-) PCR方法(1995， Plant J. 8(3):457-463)對位于優(yōu)良事件EE-GH6中的外源DNA兩側(cè)的區(qū)域序列進(jìn) 行了測定。該方法在連續(xù)的反應(yīng)中使用三種嵌套引物和一種較短的任意簡 并引物，從而特異和非特異產(chǎn)物的相對擴(kuò)增效率可以進(jìn)行熱控制。特異引 物被選擇出來用于在外源DNA的邊界發(fā)生退火反應(yīng)并基于其退火條件。 少量(5pl)未純化的二級和三級PCR產(chǎn)物在1。/。瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。對 三級PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并測序。 2.1右(5，)側(cè)翼區(qū)域
鑒定為包含5，側(cè)翼區(qū)的片段進(jìn)行了測序(SEQ ID No. 1)。核苷酸1-140 的序列對應(yīng)于才直物DNA，而核苷酸141-192的序列對應(yīng)于外源DNA。對 一個包含5，側(cè)翼區(qū)的更長的片段也進(jìn)行了測序(SEQ ID No. 11)。核苷酸 1-463之間的序列對應(yīng)于才直物DNA,而464-555之間的序列對應(yīng)于外源 DNA。
2.2左(3，)側(cè)翼區(qū)
對通過TAIL-PCR方法得到的鑒定為包含3，側(cè)翼區(qū)的片段進(jìn)行了測序 (SEQ ID No. 2)。核苷酸l-40之間的序列對應(yīng)于外源DNA，而核苷酸41-452之間的序列對應(yīng)于植物DNA。2.3鑒定預(yù)插入植物DNA
使用寡核苷酸NEL115(SEQIDNo6)和NEL117 (SEQ ID No 7)，利用PCR擴(kuò)增來擴(kuò)增預(yù)插入植物DNA。鑒定擴(kuò)增的片段的核苷酸序列(SEQIDNo. 10)。當(dāng)與優(yōu)良事件EE-GH6的5，和3，側(cè)翼區(qū)中的植物來源的核苷酸序列進(jìn)行比較時，可以鑒定141-148位核苷酸之間的區(qū)域為被重排(靶位點缺失)。
3. EE-GH6的聚合ilM式反應(yīng)鑒定方案的開發(fā)3丄引物
開發(fā)特異引物，其識別優(yōu)良事件內(nèi)的序列。
開發(fā)了識別EE-GH6的3，側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列的引物。之后在外源DNA的序列內(nèi)選擇第二條引物，以便該引物跨越大約189個核苷酸的序列。下列引物4皮證實在EE-GH6 DNA的PCR反應(yīng)中產(chǎn)生特別清晰和可再現(xiàn)的結(jié)果
GHI058: 5，- gAA.ATT.gCg.TgA.CTC.AAA.TTC.C -3, (SEQ ID No.: 3)
(耙序列植物DNA)GHI059: 5，- ggT.TTC.gCT.CAT.gTg.TTg.AgC-3，(SEQ ID No.: 4)
(耙序列插入DNA)耙向內(nèi)源序列的引物優(yōu)選被包括在PCR混合物中。這些引物作為未知樣品和DNA陽性對照中的內(nèi)部對照。用內(nèi)源引物對得到陽性結(jié)果(存在445bp的PCR擴(kuò)增片段)，表明在用于生成PCR產(chǎn)物的基因組DNA制備物中含有足夠的具有適當(dāng)質(zhì)量的DNA。選擇內(nèi)源引物以識別棉花中的持家基因
GHI001: 5，-AAC.CTA.ggC.TgC.TgA.Agg.AgC畫3， (SEQ ID No.: 8)GHI002: 5，-CAA.CTC.CTC.CAg.TCA.TCT.CCg誦3，(SEQ ID No.: 9)3.2擴(kuò)增的片段
PCR反應(yīng)中預(yù)期的擴(kuò)增片段為對于引物對GHI001-GHI002: 445bp(內(nèi)源對照)對于引物對GHI058-GHI059: 189bp (EE-GH6優(yōu)良事件)3.3模板DNA
根據(jù)Edwards等(Nucleic Acid Research, 19， 1349頁，1991)，由葉打孔法制備模板DNA。當(dāng)使用由其他方法制備的DNA時，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行使用不同量的模板的測試。通常50 ng的基因組模板DNA可以得到最好的結(jié)果。3.4指定的陽性和陰性對照
為了避免假陽性或陰性，應(yīng)當(dāng)將下列陽性和陰性對照包括在PCR程序
中
-主混合物對照(DNA陰性對照)。進(jìn)行PCR反應(yīng)時，其中不加入任何DNA。當(dāng)觀察到預(yù)期的結(jié)果——無PCR產(chǎn)物時，這表明PCR反應(yīng)混合物沒有被耙DNA污染。
-DNA陽性對照(已知包含轉(zhuǎn)基因序列的基因組DNA樣品)。該陽性對照的成功擴(kuò)增表明PCR反應(yīng)是在允許把序列擴(kuò)增的條件下進(jìn)行的。-野生型DNA對照。進(jìn)行PCR反應(yīng)時，提供的模板DNA是由非轉(zhuǎn)基因植物制備的基因組DNA。當(dāng)觀察到預(yù)期的結(jié)果——無轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增但有內(nèi)源PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增時，這表明在基因組DNA樣品中，沒有可檢測到的轉(zhuǎn)基因背景擴(kuò)增。3.5 PCR條件
在下列條件下得到最佳的結(jié)果-用于25|til反應(yīng)物的PCR混合物含有2.5 |il模板DNA
2.5 pi 10x擴(kuò)增緩沖液(由Taq聚合酶的生產(chǎn)商提供)
0.5 |ul 10 mM dNTP
0.4 pi GH1001 (10pmoles/pl)
0.4 pi GHI002 (10pmoles/|il)
0.7 jal GHI058 (lOpmoles輛
0.7 pi GH1059 (10pmoles/|il)
0.1 pi T叫DNA聚合酶(5單位/pl)加水至25 |al
用得到最佳結(jié)果而遵循的熱循環(huán)程序是
95。C下4分鐘
接著95。C下1分鐘
57。C下1分鐘
72。C下2分鐘
5個循環(huán)
接著92。C下30秒
57°C下30秒
72°C下1分鐘
25個循環(huán)
接著72°C下10分鐘
3.6瓊脂糖凝膠分析
為了能最好地觀察PCR結(jié)果，應(yīng)當(dāng)將10-20 的PCR樣品上樣于1.5%瓊脂糖凝膠(Tris-硼酸鹽緩沖液)，并使用適當(dāng)?shù)姆肿恿繕?biāo)記(例如100bp序列梯PHARMACIA)。3.7結(jié)果的驗證
經(jīng)過單一的PCR程序和單一的PCR混合物從轉(zhuǎn)基因植物DNA樣品得到的數(shù)據(jù)不應(yīng)該^皮接受，除非1) DNA陽性對照表現(xiàn)出預(yù)期的PCR產(chǎn)物(轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源片段)；2) DNA陰性對照的PCR擴(kuò)增是陰性的(無片段)；3)野生型DNA對照表現(xiàn)出預(yù)期的結(jié)果(內(nèi)源片段擴(kuò)增)。
當(dāng)按照上述EE-GH6的PCR鑒定方案時，泳道顯示可見量的預(yù)期大小的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源PCR產(chǎn)物，表明用于制備基因組模板DNA的對應(yīng)植物遺傳了 EE-GH6優(yōu)良事件。泳道沒有顯示可見量的轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物而顯示可見量的內(nèi)源PCR產(chǎn)物，表明用于制備基因組模板DNA的對應(yīng)植物不包含優(yōu)良事件。泳道顯示均不存在可見量的內(nèi)源和轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的，表明基因組DN A的質(zhì)量和/或數(shù)量不允許產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。這些植物不能被評分。基因組DNA的制備應(yīng)當(dāng)重復(fù)，并利用適當(dāng)對照進(jìn)行新的PCR程序。3.8使用鑒別PCR方案鑒定EE-GH6
在試圖篩選未知物前，必須進(jìn)行利用所有適當(dāng)對照的測試程序。開發(fā)方案可能需要為實驗室間不同的組分(模板DNA制備物，Taq DNA聚合酶，引物質(zhì)量，dNTP，熱循環(huán)儀等)進(jìn)行優(yōu)化。
內(nèi)源序列的擴(kuò)增在方案中起著關(guān)鍵作用。實驗人員必須確定PCR和熱循環(huán)的條件。運用這些條件，可以對已知轉(zhuǎn)基因基因組DNA模板的內(nèi)源和轉(zhuǎn)基因序列進(jìn)行等摩爾量的擴(kuò)增。只要靶內(nèi)源片段未被擴(kuò)增，或耙序列未能擴(kuò)增到相同的溴化乙錠染色強(qiáng)度(如根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行判斷)，則PCR條件就需要優(yōu)化。
根據(jù)上述方案，測試了來源于許多棉花植物的葉材料，其中一些含有EE-GH6。來源于優(yōu)良事件EE-GH6和棉花野生型的樣品分別用作陽性和陰性對照。
圖2顯示的是對許多棉花植物樣品按照EE-GH6的優(yōu)良事件PCR鑒定方案1得到的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)泳道2-5的樣品含有檢測為189 bp的條帶的優(yōu)良事件；而泳道6和7的樣品不包含EE-GH6。泳道6和7包含其他棉花優(yōu)良事件(包括包含不同抗蟲嵌合基因的植物)；泳道8代表陰性對照樣品(水)，泳道1和9代表分子量標(biāo)記(100 bp序列梯)。
4. 使用特異整合片段作為檢測含有EE-GH6的材料的探針
利用特異引物GHI058 (SEQ ID No. 3)和GHI059 (SEQ ID No. 4)通過PCR擴(kuò)增，或通過化學(xué)合成，得到EE-GH6的特異整合片段，并對其進(jìn)行標(biāo)記。該整合片段用作檢測生物樣品中EE-GH6的特異探針。按照標(biāo)準(zhǔn)程序從樣品中提取核酸。然后在經(jīng)優(yōu)化以允許形成雜交體的雜交條件下，將核酸與特異探針接觸。然后檢測雜交體的形成，以表明在樣品中存在EE-GH6核酸。任選地，在與特異探針接觸之前，先利用特異引物擴(kuò)增樣品中的核酸。備選地，在與特異探針(而非整合片段)接觸之前，標(biāo)記核酸。任選地，在接觸樣品之前，將特異探針附著于固體載體(例如但不僅限于濾紙，測試條或珠子)。
5. 基于PCR的用于確定EE-GH6棉花植物材料的接合性狀態(tài)的方案5.1引物
在插入優(yōu)良事件前識別野生型基因座的核苷^列的兩條引物是這樣設(shè)計的它們互相方向相對并在其間有插入位點。這組引物與互補(bǔ)于外源DNA序列并針對側(cè)翼DNA的第三條引物一起，進(jìn)行EE-GH6基因座和wt基因座的PCR擴(kuò)增。
發(fā)現(xiàn)下列引物在對EE-GH6 DNA進(jìn)行接合性評分PCR反應(yīng)中得到特別清晰和可再現(xiàn)的結(jié)果
NEL115 5，- ACT.gAT.ggC.TCA.ACg.gTT.AC-3， (SEQ ID No.: 6)
(乾序列5，側(cè)翼序列上游的植物DNA)DPA286 5，- gAT.CgC.CAT.ggA.gCC.ATT3,(SEQ ID No.: 5)
(粑序歹'J:插入DNA)NEL117 5， - AAA.TCA.CAg.gCA.gAg.ggA.Ag-3，(SEQ ID No.: 7)
(把序列3，側(cè)翼序列的植物DNA)
5.2擴(kuò)增片段
PCR反應(yīng)中預(yù)期的擴(kuò)增片段是對于引物對GHI065 - GHI066: 451 bp(野生基因座)對于引物對GHI057 —GHI065: 197bp (EE-GH6基因座)5.3模板DNA
根據(jù)Edwards等人(Nucleic Acid Research, 19， 1349頁，1991),才莫板DNA由葉打孔法制備。當(dāng)使用由其他方法制備的DNA時，應(yīng)當(dāng)使用不同量的模板進(jìn)行測試程序。通常50 ng的基因組模板DNA可以產(chǎn)生最好的結(jié)果。
5.4指定的陽性和陰性對照
為了避免假陽性或陰性結(jié)果，應(yīng)當(dāng)將下列陽性和陰性對照包括在PCR程序中
-主混合物對照(DNA陰性對照)。進(jìn)行PCR反應(yīng)時，其中不加入任何DNA。當(dāng)觀察到預(yù)期的結(jié)果——無PCR產(chǎn)物時，這表明PCR混合物沒有被靶DNA污染。-DNA陽性對照(已知包含轉(zhuǎn)基因序列的基因組DNA樣品)。該陽性對照的成功擴(kuò)增表明PCR是在允許乾序列擴(kuò)增的條件下進(jìn)行的。-野生型DNA對照。進(jìn)行PCR反應(yīng)時，提供的模板DNA是由非轉(zhuǎn)基因植物制備的基因組DNA。當(dāng)觀察到預(yù)期的結(jié)果——無轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增但有內(nèi)源PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增時，這表明在基因組DNA樣品中沒有可檢測到的轉(zhuǎn)基因背景擴(kuò)增。5.5 PCR條件
最佳的結(jié)果是在下列條件下得到的-用于25^1反應(yīng)物的PCR混合物含有x pl模板DNA (150 ng)
2.5 |Lil 10x擴(kuò)增緩沖液(由生產(chǎn)商隨T叫聚合酶一起提供)
0.5 pi 10 mM dNTP
0.5 |ul NEL115 (lOpmoles/pl)
0.5 pi NEL117 (10pmoles/|Lil)
0.2 pi DPA286 (lOpmoles,
0.1 pi T叫DNA聚合酶(5單位/nl)
加水至25 pi
-為達(dá)到最佳結(jié)果遵循的熱循環(huán)程序是
95。C下4分鐘
接著95。C下l分鐘
57。C下1分鐘
72。C下2分鐘
5個循環(huán)
接著92°C下30秒
57°C下30秒
72°C下1分鐘
25個循環(huán)
接著72 °C下10分4中5.6瓊脂糖凝膠分析
為了能最好地觀察PCR結(jié)果，應(yīng)當(dāng)將10-20 pl的PCR樣品上樣于 1.5%瓊脂糖凝膠(Tris-硼酸鹽緩沖液)，并使用適當(dāng)?shù)姆肿恿繕?biāo)記(例如 100bp序列梯PHARMACIA)。
5.7結(jié)果的^
經(jīng)單一的PCR程序和單一的PCR主混合物從轉(zhuǎn)基因植物DNA樣品中 得到的數(shù)據(jù)不應(yīng)該被接受，除非
-陽性對照表現(xiàn)出預(yù)期的PCR產(chǎn)物(轉(zhuǎn)基因乾序列擴(kuò)增)
-野生型陽性DNA對照表現(xiàn)出預(yù)期的結(jié)果(野生型耙序列擴(kuò)增)
-陰性對照的PCR擴(kuò)增是陰性的(無片段)。
存在可見量的預(yù)期大小的轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物而不存在可見量的野生型 PCR產(chǎn)物的泳it^明對應(yīng)的用于制備基因組DNA模板的植物對于轉(zhuǎn)基因 基因盒是純合的。
存在可見量的預(yù)期大小的轉(zhuǎn)基因和野生型PCR產(chǎn)物的泳a明對應(yīng)的 用于制備基因組模板DNA的植物對于轉(zhuǎn)基因基因盒是半合子的。存在可 見量的野生型PCR產(chǎn)物而不存在可見量的轉(zhuǎn)基因PCR產(chǎn)物的泳道表明對 應(yīng)的用于制備基因組模板DNA的植物沒有遺傳待檢測的轉(zhuǎn)基因序列，并 且對于野生型基因座是純合的。
均不存在可見量的轉(zhuǎn)基因和野生型PCR產(chǎn)物的泳道表明基因組DNA 的質(zhì)量和/或數(shù)量不允許生成PCR產(chǎn)物。這些植物不能被評分?；蚪MDNA 的制備應(yīng)當(dāng)重復(fù)，必須利用適當(dāng)對照進(jìn)行新的PCR程序。 5.8使用接合性評分方案對包含EE-GH6的植物中的接合性狀態(tài)進(jìn)行鑒定
圖3顯示的是對許多棉花植物樣品進(jìn)行EE-GH6的接合性評分PCR所 得到的結(jié)果。發(fā)現(xiàn)泳道2和3的樣品包含優(yōu)良事件EE-GH6特征性的PCR 片段(197 bp),而泳道4-7的樣品包含wt基因座存在的特征性片段。泳道 4-6包含兩個片段。泳道2和3因此包含純合形式的EE-GH6，泳道4-6包 含半合子形式的EE-GH6，泳道7包含純合形式的wt基因座(即對于EE-GH6不成對)。泳道8代表陰性對照樣品(水)，泳道1和9代表分
子量標(biāo)記(100bp序列梯)。
6. EE-GH6向優(yōu)選栽培種中的漸滲
通過反復(fù)回交，優(yōu)良事件EE-GH6被引入到商業(yè)的棉花栽培種，例如 但不僅限于FM5013, FM5015, FM5017, FM989， FM832， FM966和 FM958, FM989, FM958, FM832, FM991, FM819, FM800, FM960, FM966， FM981, FM5035, FM5044, FM5045, FM5013, FM5015, FM5017或 FM5024。
觀察的結(jié)果是，優(yōu)良事件基因漸滲到這些栽培種沒有明顯影響它們的 任何期望的表型或農(nóng)學(xué)特征(沒有連鎖拖曳)，而轉(zhuǎn)基因的表達(dá)(通過草 銨膦耐受確定)達(dá)到了商業(yè)上可接受的水平。這證實了事件EE-GH6作為 優(yōu)良事件的狀態(tài)。
優(yōu)良品系可以有利地與市場上可得到的其他優(yōu)良事件聯(lián)合，特別是為 了抗蟲管理目的的其他優(yōu)良事件抗蟲基因，例如但不僅限于事件 3006-210-23 (USDA aphis petition 03-036-02p);事件281-24-236 (USDA aphis petition 03-036-Olp);事件MON158985 (USDA aphis petition 00-342-Olp);事件MON531 (USDA aphis petition 94-308-01p)，事件 COT102 (=Syngenta vip3A)， USDA aphis petition 03-155-01p,事件 EE-GH5描述于歐洲專利申請07075299.3。 優(yōu)良事件EE-GH6也可以聯(lián) 合耐受除草劑的優(yōu)良事件，例如，事件MON1445 (USDA aphis petition 95-045-01p)，或事件MON88913 (USDA aphis petition 04畫086-01p)。
除非另外進(jìn)行了明確的說明，用在下文權(quán)利要求中的術(shù)語"植物"意在 包含處于任意成熟階段的植物組織，以及取自或源自任何這類植物的任何 細(xì)胞、組織或器官，包括但不限于任何種子、葉、莖、花、根、單細(xì)胞、 配子、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。
包含優(yōu)良事件EE-GH6的參考種子于2007年4月19日以名稱EE-GH6 保藏在ATCC (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209)， ATCC 保藏號PTA-8398。 EE-GH6的備用名稱是GBH119。除非另外進(jìn)行了明確的說明，用在下文權(quán)利要求中的術(shù)語"植物"意在 包含處于任意成熟階段的植物組織，以及取自或源自任何這類植物的任何
細(xì)胞、組織或器官，包括但不限于任何種子、葉、莖、花、根、單細(xì)胞、 配子、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織培養(yǎng)物或原生質(zhì)體。 本發(fā)明的上述說明旨在進(jìn)行說明而非限制。
所描述的實施方案的各種改變或修改是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到的。 在不偏離本發(fā)明主旨或范圍的前提下，可以做出這些改變或修改。
權(quán)利要求
1.鑒定生物樣品中優(yōu)良事件EE-GH6的方法，該方法包括用特異識別EE-GH6的5’或3’側(cè)翼區(qū)的特異引物或探針檢測EE-GH6特異性區(qū)域。
2. 權(quán)利要求l的方法，所述方法包括利用聚合酴漣式反應(yīng)用至少兩種 引物從存在于所述生物樣品中的核酸擴(kuò)增100到500bp的DNA片段，所 述引物中一種識別EE-GH6的5'側(cè)翼區(qū)或EE-GH6的3，側(cè)翼區(qū)，所述5， 側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID No 1的1-140位核普酸的核苷酸序列或SEQ ID No 11 的1-463位核苷酸的核苷酸序列；所述的3'側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID No 2的 113-438位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷,列，所述引物中的另 一種識別外源 DNA內(nèi)的序列，該外源DNA具有SEQ ID No 1的141-192位核苷酸的互 補(bǔ)序列的核普酸序列或SEQ ID No 2的1-112位核苷酸的核苷酸序列。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中所述的識別5，側(cè)翼區(qū)的引物由17-200個 連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，所述17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列選 自SEQ ID No 1的1-140位核普酸的核苷酸序列或SEQ ID No 11的1-463 位核苷酸的核苷酸序列；或者所述識別EE-GH6的3'側(cè)翼區(qū)的引物由 17-200個連續(xù)核普酸的核普酸序列組成，所述17-200個連續(xù)核苷酸的核苷 酸序列選自SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列； 所述的識別外源DNA內(nèi)的序列的引物由17-200個連續(xù)的核苷酸組成，所 述17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列選自SEQ ID No 1的141-192位核苷 酸的互補(bǔ)序列的核苦酸序列或SEQ ID No 2的1-112位核苷酸的核苷^ 列。
4. 權(quán)利要求2的方法，其中所述識別5，側(cè)翼區(qū)的引物在其3，末端包含 至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述5，側(cè)翼區(qū)選自SEQ ID No 1的1 - 140位核苷酸的核苷酸序列，或者所述識別EE-GH6的3'側(cè)翼區(qū)的引物 在其3，末端包含至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述3，側(cè)翼區(qū)選自 SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列；所述的識別 外源DNA內(nèi)的序列的引物在其3，末端包含至少17個連續(xù)核苷酸，所述外源DNA選自SEQ ID No 1的141-192位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或 SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的核苷酸序列。
5. 權(quán)利要求4的方法，其中所述的引物分別包含SEQIDNo3和4的 序列，或SEQIDNo5和7的序列。
6. 4又利要求5的方法，該方法包括利用EE-GH6 PCR鑒定方案擴(kuò)增 大約189或197 bp的片段。
7. 用于鑒定生物樣品中優(yōu)良事件EE-GH6的試劑盒，所述試劑盒包含 一種識別EE-GH6的5'側(cè)翼區(qū)的引物，或者一種識別EE-GH6的3，側(cè)翼 區(qū)的引物，以及一種識別外源DNA內(nèi)的序列的引物，所述的5，側(cè)翼區(qū)具 有SEQ ID No 1的1-140位核普酸的核苷酸序列或SEQ ID No 11的1-463 位核苷酸的核苷酸序列；所述的3，側(cè)翼區(qū)具有SEQIDNo2的113-438位 核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列；所述的外源DNA具有SEQ ID No 1的 141-192位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQ ID No2的l-112位核苷 酸的核苷酸序列。
8. 權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述的識別5，側(cè)翼區(qū)的引物由17-200 個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，所述17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列 選自SEQ ID No 1的1-140位核香酸的核苷酸序列或SEQ ID No 11的 1-463位核苷酸的核苷酸序列；或者所述的識別EE-GH6的3，側(cè)翼區(qū)的引 物由17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列組成，所17-200個連續(xù)核苷酸的 核苷酸序列選自SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷, 列；所述的識別外源DNA內(nèi)的序列的引物由17-200個連續(xù)的核苷酸組成， 所述17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列選自SEQ ID No 1的141-192位核 苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQ ID No 2的1-112位核苷酸的核苷酸 序列。
9. 權(quán)利要求7的試劑盒，其中所述的識別5，側(cè)翼區(qū)的引物在其3，末端 包含至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述5'側(cè)翼區(qū)選自SEQ ID No 1 的1-140位核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID Noll的1-463位核苷酸的核苷 酸序列；或者所述的識別EE-GH6的3，側(cè)翼區(qū)的引物在其3，末端包含至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，所述3，側(cè)翼區(qū)選自SEQ ID No 2的113-438 位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列；所述的識別外源DNA內(nèi)的序列的引 物在其3，末端包含至少17個連續(xù)核苷酸，所述識別外源DNA選自SEQ ID Nol的141-192位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQ ID No 2的1-112 位核苷酸的核苷酸序列。
10. 權(quán)利要求7的試劑盒，其包含由SEQ ID No 4的序列組成的引物 和由SEQ ID No 3的序列組成的引物，或包含由SEQ ID No 5的序列組成 的引物和由SEQ ID No7的序列組成的引物。
11. 適合用于EE-GH6特異檢測的引物，其序列在優(yōu)化的檢測條件下 特異識別EE-GH6的5，或3'側(cè)翼區(qū)內(nèi)的序列，所述的5'側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID No 11的1-463位核苷酸的 核苷酸序列；所述的3'側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的互 補(bǔ)序列的核苷酸 列。
12. 權(quán)利要求ll的引物，其中所述的引物由17-200個連續(xù)核普酸的核 苷酸序列組成，所述17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列選自SEQ ID No 1 的1-140位核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID No 11的1-463位核苷酸的核苷 酸序列，或者17-200個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列選自SEQ ID No 2的 113-438位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苦#列。
13. 權(quán)利要求11的引物，其中所述的引物在其3，末端包含至少17個 連續(xù)核苷酸的核普酸序列，選自SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的核苷酸 序列或SEQ ID No 11的1-463位核苷酸的核苷,列，或者在其3，末端包 含至少17個連續(xù)核苷酸的核苷酸序列，選自SEQ ID No 2的113-438位核 苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列。
14. 引物，其在其3，末端包含SEQIDNo3的序列。
15. 引物，其在其3，末端包含SEQIDNo7的序列。
16. 4又利要求1的方法，所述方法包括將生物樣品的核酸與EE-GH6 的特異探針雜交。
17. 權(quán)利要求16的方法，其中所述特異探針的序列與下述序列有至少80%序列同一性包含EE-GH6的5，或3，側(cè)翼序列和與^f目鄰的外源DNA序列的部分的序列。
18. 權(quán)利要求17的方法，其中所述特異探針的序列與SEQ ID No 1的120-161位核普酸序列或SEQ ID No 2的92-123位核苷酸序列或所述_序列的互補(bǔ)序列有至少80%序列同一性。
19. 用于鑒定生物樣品中優(yōu)良事件EE-GH6的試劑盒，所述試劑盒包含能夠特異雜交EE-GH6的特定區(qū)域的特異探針。
20. 權(quán)利要求19的試劑盒，其中所述特異探針的序列與下述序列有至少80%序列同一性包含EE-GH6的5，側(cè)翼序列或3'側(cè)翼序列和與^目鄰的外源DNA序列的部分的序列。
21. 權(quán)利要求20的試劑盒，其中所述特異探針的序列與SEQIDNol的130-151位核苷酸序列或SEQ ID No 2的102-123位核苷酸序列或所述序列的互補(bǔ)序列有至少80%序列同一性。
22. 用于鑒定生物樣品中的優(yōu)良事件EE-GH6的特異探針。
23. 權(quán)利要求22的探針，其與包含EE-GH6的5，側(cè)翼序列或3，側(cè)翼序列和與"M目鄰的外源DNA序列的部分的序歹'J,或其互補(bǔ)序列有至少80y。序列同一性。
24. 斥又利要求23的探針，其與SEQ ID No. 1的120-161位核苷酸或SEQ ID No. 2的92-123位核苷酸或所述序列的互補(bǔ)序列有至少80%序列同一性。
25. 用于鑒定生物樣品中優(yōu)良事件EE-GH6的特異探針，其序列與SEQ ID No 1的120-161位核苷酸序列或SEQ ID No 2的92-123位核苷酸序列或所述序列的互補(bǔ)序列基本上相似。
26. 確iL種子純度的方法，所述方法包括用特異識別EE-GH6的5，或3，側(cè)翼區(qū)的特異引物或探針檢測種子樣品中EE-GH6特異性區(qū)域。
27. 篩選種子中EE-GH6的存在的方法，所述方法包括用特異識別EE-GH6的5，或3'側(cè)翼區(qū)的特異引物或探針檢測種子批次的樣品中EE-GH6特異性區(qū)域。
28. 確定包含優(yōu)良事件EE-GH6的植物，植物材料或種子的接合性狀態(tài)的方法，所述方法包括利用至少三種引物通過聚合膝逸式反應(yīng)從存在于所述生物樣品中的核酸擴(kuò)增100-500 bp的DNA片段，所述引物的兩種特異識別預(yù)插入的植物DNA，例如EE-GH6的5，側(cè)翼區(qū)或EE-GH6的3，側(cè)翼區(qū)或預(yù)插入DNA，所述5，側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID No 1的1-140位核苷酸的核苷酸序列或SEQ ID No 11的1-463位核苷酸的核苷i^f列，所述3，側(cè)翼區(qū)具有SEQ ID No 2的113-438位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或所述的預(yù)插入DNA具有SEQ ID No 10的核苦酸序列或其互補(bǔ)序列，所述引物的第三種識別外源DNA內(nèi)的序列，該外源DNA具有SEQ ID No 1的141-192位核苷酸的互補(bǔ)序列的核苷酸序列或SEQ ID No 2的1-112位核香酸的核普酸序列。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述的第一種引物包含SEQIDNo7的核苷酸序列，所述的第二種引物包含SEQIDNo6的序列，所述的第三種引物包含SEQ ID No 5或SEQ ID No4的序列。
30. 通過與基本上互補(bǔ)的經(jīng)標(biāo)記核酸探針雜交來檢測生物樣品中優(yōu)良事件EE-GH6的存在的方法，其中探針與耙核酸的比值通過耙核酸序列的回收而增大，所述方法包括a) 將所述的靶核酸序列與包含SEQIDNol的141-158位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的第一核酸寡核苷酸雜交，或與包含SEQ ID No 2的95-112位核苷酸的核香酸序列或其互補(bǔ)序列的所述的第一核酸寡核苷酸雜交；b) 將所述的靶核酸序列與包含SEQIDNo 1的123-140位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的第二核酸寡核苷酸雜交，或與包含SEQ ID No 2的113-130位核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的所迷經(jīng)標(biāo)記的核酸探針雜交；其中所述的第一和第二寡核苷酸至少重疊一個核苷酸，并且其中所述第一或第二寡核苷酸被標(biāo)記為所述經(jīng)標(biāo)記的核酸探針；c) 用酶僅僅切割探針:乾核*列雙鏈體內(nèi)經(jīng)標(biāo)記的探針，所述酶引起選擇性探針切割，導(dǎo)致雙鏈體解離，留下完整的乾序列；d) 通過重復(fù)步驟(a)到(c)回收乾核^f列；和e) 檢測被切割的經(jīng)標(biāo)記探針，從而確定所述乾核酸序列的存在。
31. 轉(zhuǎn)基因棉花植物、或其細(xì)胞、部分、種子或子代，每個均在其基因組中包含優(yōu)良事件EE-GH6，包含所述事件的參考種子以保藏號PTA-8398保藏在ATCC。
32. 權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)基因棉花植物、種子、細(xì)胞、部分或子代，其基因組DNA，當(dāng)用EE-GH6的優(yōu)良事件鑒定方案與分別包含SEQ ID No 3和SEQ ID No 4的核苷酸序列的兩種引物分析時，產(chǎn)生大約189 bp的DNA片段。
33. 以保藏號PTA-8398保藏在ATCC的包含優(yōu)良事件EE-GH6的種子，或其衍生物。
34. 從權(quán)利要求33的種子得到的棉花植物或其部分、或其種子。
35. 棉花植物、或其種子、細(xì)胞或組織，每個均在其基因組中包含優(yōu)良事件EE-GH6，所述棉花植物、或其種子、細(xì)胞或組織由以保藏號PTA-8398保藏在ATCC的種子長成的棉花植物繁殖和/或育種得到。
36. 包含優(yōu)良事件EE-GH6的棉花種子，包含所述事件的參考種子已經(jīng)以保藏號PTA-8398保藏在ATCC。
37. 從權(quán)利要求36的種子生產(chǎn)的包含優(yōu)良事件EE-GH6的轉(zhuǎn)基因棉花植物、細(xì)胞或組織。
38. 產(chǎn)生包含優(yōu)良事件EE-GH6的棉花植物或種子的方法，包括將權(quán)利要求31-37中任一項的植物與另一棉花植物雜交，并種植從所述雜交得到的種子。
39. 包含優(yōu)良事件EE-GH6的棉花基因組DNA。
40. 由根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項的棉花植物、植物細(xì)胞或種子產(chǎn)生的基因組DNA
41. 分離的核酸分子，其包含與SEQ ID No 1的130-151位核苷酸的核普酸序列，或所述序列的互補(bǔ)序列
42，權(quán)利要求41的分離的核酸分子，其包含與SEQ ID No 1的120-161位核普酸的核苷酸序列或SEQ ID No 2的82-133位核苷酸的核苷酸序列基本上相似的核苷酸序列，或所述序列的互補(bǔ)序列。
全文摘要
本發(fā)明提供特定的轉(zhuǎn)基因棉花植物、植物材料和種子，其特征在于這些產(chǎn)品在棉花基因組的特定位置包含特定優(yōu)良轉(zhuǎn)化事件。本發(fā)明也提供允許快速和明確鑒定生物樣品中的該事件的工具。
文檔編號C12Q1/68GK101680000SQ200880019547
公開日2010年3月24日 申請日期2008年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月11日
發(fā)明者D·佩林克, E·貝格曼, L·特落林德爾, S·莫昂, V·哈貝克斯 申請人:拜爾生物科學(xué)公司