專利名稱：變體激活素受體多肽及其用途的制作方法
變體激活素受體多肽及其用途 與相關(guān)申請(qǐng)的交叉參照
本申請(qǐng)要求于2008年2月11日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào) 61/065,474,和于2007年3月6日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)序列號(hào)參考。
本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域涉及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-|3 (TGF-p)家族成員和可溶 性TGF-p受體，以及調(diào)節(jié)TGF-p家族成員的活性、用于治療各種病癥 的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子p (TGF-p)家族包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-(3 (TGF-p)、激活素、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGFs)、 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、和生長(zhǎng)/分化因子(GDFs)。這些家族成 員涉及廣泛范圍的生物過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、分化和其他功能的調(diào)節(jié)。
生長(zhǎng)/分化因子8 (GDF-8)也稱為肌抑素(myostatin),是大多數(shù)情 況下在發(fā)育中的和成人骨骼肌組織的細(xì)胞中表達(dá)的TGF-13家族成員。 肌抑素看起來(lái)在負(fù)控制骨骼肌生長(zhǎng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用(McPherron等人， Nature (London) 387， 83-90 ( 1997 ))。拮抗肌抑素已顯示增加動(dòng)物 中的無(wú)脂肪肌肉量(McFerron等人，同上，Zimmers等人，Science 296: 1486 (2002))
蛋白質(zhì)的TGF-p家族的另一個(gè)成員是相關(guān)生長(zhǎng)/分化因子GDF-ll。 GDF-11具有肌抑素氨基酸序列約90%的同一性。GDF-ll在發(fā)育中的動(dòng) 物的軸向才莫式中具有作用(Oh等人，Genes Devil: 1812-26 ( 1997 ))， 并且看起來(lái)也在骨骼肌發(fā)育和生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。
激活素A、 B和AB分別是具有兩條多肽鏈M和朋的同二聚體和 異二聚體(Vale等人Nature 321, 776-779 ( 1986 ), Ling等人，Nature321, 779-782 ( 1986 ))。激活素最初作為涉及濾泡刺激激素合成調(diào)節(jié)的性腺肽而發(fā)現(xiàn)，并且目前被認(rèn)為涉及許多生物活性的調(diào)節(jié)。激活素A是占優(yōu)勢(shì)形式的激活素。
激活素、肌抑素、GDF-11和TGF-(3超家族的其他成員結(jié)合激活素II型和激活素IIB型受體且通過(guò)所述受體的組合發(fā)信號(hào)，所述2種受體都是跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶(Harrison等人，J. Biol. Chem. 2",28036-28044 ( 2004 ))。交聯(lián)研究已測(cè)定肌抑素能夠在體外結(jié)合激活素II型受體ActRIIA和ActRIIB( Lee等人，PNAS USA 98: 9306-ll( 2 001 ))。還存在GDF-11與ActRIIA和ActRIIB結(jié)合的證據(jù)(Oh等人，Genes Dev16: 2749-54 ( 2002 ))。
已知TGF-卩蛋白質(zhì)表達(dá)與各種疾病和病癥相關(guān)。因此，能夠拮抗幾種TGF-p蛋白質(zhì)的治療分子同時(shí)可能是對(duì)于這些疾病和病癥特別有效的。
此外，蛋白質(zhì)治療的產(chǎn)生可能合并在蛋白質(zhì)表達(dá)和純化過(guò)程中發(fā)生的問(wèn)題。 一個(gè)問(wèn)題是在表達(dá)或純化過(guò)程中蛋白質(zhì)的聚集。在細(xì)胞培養(yǎng)條件過(guò)程中高水平蛋白質(zhì)的積累可能導(dǎo)致聚集。純化過(guò)程可能使蛋白質(zhì)暴露于促進(jìn)進(jìn)一步聚集的另外因素(Cro歸ell, M.E.M.等人，TheAAPS Journal 8: E572-E579, 2006 )?？梢試L試減輕引起聚集的因素，然而，存在蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)為具有減少形成聚集物的傾向的需要。本發(fā)明滿足了對(duì)治療分子的需要，所述治療分子與多種配體結(jié)合，并且具有減少的聚集且因此具有改善的可制造性，以便有效產(chǎn)生對(duì)于治療TGF-卩相關(guān)疾病狀態(tài)有用的蛋白質(zhì)。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了包含變體人激活素受體IIB (命名為vActRIIB)多肽的分離蛋白質(zhì)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)vActRIIB多肽指人vActRIIB多肽和人vActRIIB5多肽兩者。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含具有SEQIDNO: 2或18的氨基酸序列的多肽，其中在位置E28或R40或者位置E28和R40兩者處的氨基酸由另一非天然氨基酸取代，并且其中所述多肽能夠結(jié)合肌抑素、激活素A或GDF-ll。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含具有SEQ ID NO: 2或18的氨基酸序列的多肽，其中在位置E28或R40或者位置E28和R40兩者處的氨基酸由非天然氨基酸取代，并且其中信號(hào)肽被去除，并且其中所述多肽能夠結(jié)合肌抑素、激
7活素A或GDF-11。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含具有SEQ ID NO: 2或18的氨基酸序列的多肽，其中在位置E28或R40或者位置E28和R40兩者處的氨基酸由另一氨基酸取代，其中信號(hào)肽被去除，并且其中成熟多肽的N末端被截短，并且其中所述多肽能夠結(jié)合肌抑素、激活素A或GDF-ll。在一個(gè)實(shí)施方案中，N末端成熟截短的vActRIIB多肽缺乏成熟序列的N末端4個(gè)氨基酸或N末端6個(gè)氨基酸，其中所述多肽能夠結(jié)合肌抑素、激活素A或GDF-11。在一個(gè)實(shí)施方案中，在位置E28處的取代選自W、 Y和A。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在位置E28處的取代選自氨基酸A、 F、 Q、 V、 I、 L、 M、 K、 H、 W和Y。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在位置E40處的取代選自氨基酸G、 Q、 M、 H、 K和N。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在位置E28處的取代選自氨基酸A、 F、 Q、V、 I、 L、 M、 K、 H、 W和Y,并且在位置E40處的取代選自氨基酸A、 G、Q、 M、 H、 K和N。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，多肽進(jìn)一步包含異源蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源蛋白質(zhì)是Fc結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域是人IgG Fc結(jié)構(gòu)域。
在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含具有SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 70、 72、 87、 88、 91、 93、95和97中所示氨基酸序列的多肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含由具有SEQ IDNO: 3、 5、 7、 9、11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94、 96中所示序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸編碼的多肽。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含編碼vActRIIB多肽的多核苷酸的分離核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子包含具有SEQ ID NO:3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 69、 71、 92、94、 96中所示核酸序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸分子包含編碼多肽的多核苷酸，所述多肽由SEQ IDNO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97中所示氨基酸序列組成。
8在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，核酸分子進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)序
列。在另一個(gè)方面，提供了包含vActRIIB核酸分子的重組載體。在另一個(gè)方面，提供了包含重組載體的宿主細(xì)胞，并且提供了生產(chǎn)vActRIIB多肽的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步提供了包含本發(fā)明的至少一種vActRIIB多肽或蛋白質(zhì)的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物是包含與藥學(xué)上可接受的載體混合的vActRIIB多肽或蛋白質(zhì)的藥物組合物。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)給受試者施用包含vActRIIB多肽或蛋白質(zhì)的治療組合物，治療或預(yù)防患有肌肉消耗疾病的受試者中的此種病癥的方法。肌肉消耗疾病包括或起因于，但不限于下述狀況癌癥惡病質(zhì)、肌營(yíng)養(yǎng)不良、肌萎縮性側(cè)索硬化、充血性阻塞性肺疾病、慢性心力衰竭、化學(xué)性惡病質(zhì)、來(lái)自HIV/AIDS的惡病質(zhì)、腎衰竭、尿毒癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、老年性骨骼肌減少癥(age-relatedsarcopenia)、老年性脆性(age-related fragility )、器官萎縮、腕管綜合征、雄激素剝奪、和由于長(zhǎng)期臥床休息導(dǎo)致的不活動(dòng)引起的肌肉消耗、脊髓損傷、中風(fēng)、骨折和衰老。肌肉消耗還可以起因于太空飛行引起的失重、胰島素抵抗、由于燒傷引起的肌肉消耗、雄激素剝奪、和其他病癥。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療與激活素A表達(dá)相關(guān)的疾病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，疾病是癌癥。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療代謝紊亂的方法，其包括給需要此種治療的受試者施用治療組合物，其中代謝紊亂選自骨丟失、糖尿病、肥胖、葡萄糖耐受不良、高血糖癥、雄激素剝奪、和代謝綜合征。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了治療組合物在制備用于治療上述病癥的藥物中的用途。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了基因治療方法，其包括給有需要的受試者施用編碼本發(fā)明的vActRIIB多肽或蛋白質(zhì)的載體，其中載體能夠在受試者中表達(dá)vActRIIB多肽或蛋白質(zhì)。
附圖簡(jiǎn)述


圖1。圖1顯示野生型可溶性ActRIIB-人IgGlFc的氨基酸序列(SEQID NO: 98)。信號(hào)肽序列是粗體的，隨后為成熟的ActRIIB細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，以及斜體的人IgGl Fc,包括部分鉸鏈區(qū)。氨基酸E28和R40是有下劃線的。接頭序列GGGGS (SEQ ID NO: 75 )是4牛體且有下劃線的。
9圖2。圖2顯示可溶性ActRIIB5-人IgGlFc的氨基酸序列(SEQ IDNO: 99)。信號(hào)肽序列是粗體的，隨后為成熟的ActRIIB5可溶性結(jié)構(gòu)域，并且人IgGl Fc,包括部分鉸鏈區(qū)是斜體的。E28和R40是有下劃線的。接頭序列GGGGS (SEQ ID NO: 75)是斜體且有下劃線的。
圖3。圖3顯示可溶性vActRIIB-Fc E28W處理對(duì)抑制素-a敲除小鼠中的睪丸(圖3A)和卵巢(圖3B)的影響。
圖4。圖4顯示可溶性vActRIIB-Fc E28W處理對(duì)雄性(圖4A )和雌性(圖4B)抑制素-a敲除小鼠中的存活率的影響。
圖5。圖5顯示可溶性vActRIIB-Fc E28W處理對(duì)攜帶結(jié)腸26肺瘤
的小鼠中的體重的影響。
圖6。圖6顯示可溶性vActRIIB-FcE28W處理對(duì)攜帶結(jié)腸26胂瘤
的小鼠中的存活的影響。
詳述
公開(kāi)了包含變體人激活素IIB受體(vActRIIB)多肽的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)和多肽的特征在于它們與3種TGF-(3蛋白質(zhì)，即肌抑素
(GDF-8)、激活素A和GDF-11中的至少一種結(jié)合，且抑制這些蛋白質(zhì)的活性的能力。與不包含本文公開(kāi)的修飾的多肽比較，這些蛋白質(zhì)和多肽還顯示出減少的聚集傾向。參照登記號(hào)NP —001 097 (SEQ ID NO:47 )的野生型ActRIIB、以及ActRIIB ( SEQ ID NO: 18)或ActRIIB5
(SEQ ID NO: 2)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，修飾由在位置28、 40或28和40這兩者處的氨基酸取代組成。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"TGF-p家族成員"或"TGF-p蛋白質(zhì)"指轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子家族的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的生長(zhǎng)因子，包括激活素，以及生長(zhǎng)和分化因子(GDF)蛋白質(zhì)(Kingsley等人Genes Dev. 8: 133-146 ( 1994 ),McPherron 等人 Growth factors and cytokines . in health anddisease,第IB巻，D. LeRoi th和C. Bondy. 編輯，JAI Press Inc.,Greenwich, Conn, USA:第357-393頁(yè))。
GDF-8也稱為肌抑素，是骨骼肌組織的負(fù)調(diào)節(jié)物(McPherron等人PNAS USA 94: 12457-12461 ( 1997 ))。肌抑素作為長(zhǎng)度約375個(gè)氨基酸的無(wú)活性蛋白質(zhì)復(fù)合物合成，對(duì)于人具有GenBank登記號(hào)AAB86694
(SEQ ID NO: 49)。前體蛋白質(zhì)通過(guò)在四石咸基加工位點(diǎn)處的蛋白酶解切割激活，以產(chǎn)生N末端無(wú)活性前結(jié)構(gòu)域和約109個(gè)氨基酸的C末端蛋白質(zhì)，其二聚化以形成約25 kDa的同二聚體。這種同二聚體是成熟的、生物活性蛋白質(zhì)(Zimmers等人，Science 296, 1486 ( 2002 ))。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"前結(jié)構(gòu)域"或"前肽"指無(wú)活性的N末端蛋白質(zhì)，其進(jìn)行切割以釋放活性C末端蛋白質(zhì)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"肌抑素"或"成熟的肌抑素"指單體、二聚體或其他形式的成熟的、生物活性C末端多肽，以及生物活性片段或相關(guān)多肽，包括等位基因變體、剪接變體、以及融合肽和多肽。已報(bào)告成熟的肌抑素在許多物種，包括人、小鼠、雞、豬、火雞和大鼠中具有100%序列同一性(Lee等人，PNAS 98， 9306 ( 2001 ))。
如本文所使用的，GDF-11指具有Swissprot登記號(hào)O95390(SEQ IDNO: 50)的BMP (骨形態(tài)發(fā)生蛋白)，以及那種蛋白質(zhì)的變體和物種同源物。GDF-ll在氨基酸水平上與肌抑素具有約90%同一性。GDF-11涉及中軸骨駱的前/后沖莫式形成的調(diào)節(jié)(McPherron等人，Nature Genet.22 ( 93 ): 260-264 ( 1999 ); Gamer等人,Dev. Biol. 208 ( 1 ), 222-232(1999 )),但出生后功能未知。
激活素A是多肽鏈PA的同二聚體。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"激活素A，，指具有GenBank登記號(hào):NM—002192 (SEQ ID NO: 48)的激活素蛋白質(zhì)，以及那種蛋白質(zhì)的變體和物種同源物。
激活素受體
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)激活素II B型受體(ActRIIB)指具有登記號(hào)NP-001097 ( SEQ ID NO: 47 )的人激活素受體。術(shù)語(yǔ)可溶性ActRIIB包含ActRIIB ( SEQ ID NO: 18)、 ActRIIB5 ( SEQ ID NO: 2)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，以及其中在位置64處的精氨酸由丙氨酸取代的這些序列。
變體可溶性ActRIIB多肽
本發(fā)明提供了包含人變體可溶性ActIIB受體多肽(本文稱為vActRIIB多肽、或變體多肽)的分離蛋白質(zhì)。如本文所4吏用的，術(shù)語(yǔ)"vActRIIB蛋白質(zhì)"指包含vActRIIB多肽的蛋白質(zhì)。如本文所4吏用的，術(shù)語(yǔ)"分離的"指由內(nèi)源材料純化至一定程度的蛋白質(zhì)或多肽分子。這些多肽和蛋白質(zhì)的特征在于具有結(jié)合且抑制激活素A、肌抑素或GDF-11中的任何一種的活性的能力。在某些實(shí)施方案中，與野生型多肽比較，
激活素A、肌抑素或GDF-11的變體多肽的結(jié)合親和力得到改善。
在一個(gè)實(shí)施方案中，vActRIIB多肽具有SEQ ID NO: 2或18的氨 基酸序列，其中在位置E28或R40或者位置E28和R40兩者處的氨基 酸由另一非天然氨基酸取代，并且其中所述多肽能夠結(jié)合肌抑素、激 活素A或GDF-11。在另一個(gè)實(shí)施方案中，vActRIIB多肽是這些序列的 成熟形式、或截短的成熟形式。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"成熟的vActRIIB 多肽"指氨基酸信號(hào)序列被去除的多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，成熟序列 是例如SEQ ID NO: 2的氨基酸19-160,和SEQ ID NO: 18的氨基酸 19-134，其中在位置28和40處的一個(gè)或全部?jī)蓚€(gè)氨基酸由另一非天 然氨基酸取代，并且多肽保留與激活素A、肌抑素或GDF-11結(jié)合的能 力。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)截短的成熟的vActRIIB多肽指具有信號(hào)序 列并且來(lái)自成熟多肽的N末端的氨基酸被去除的多肽。在一個(gè)實(shí)施方 案中，成熟多肽的成熟的N末端4個(gè)氨基酸或N末端6個(gè)氨基酸被去 除。在這個(gè)實(shí)施方案中，截短的成熟序列是例如SEQ ID NO: 2的氨基 酸23-160,或SEQ ID NO: 2的氨基酸25-160;和SEQ ID NO: 18的 氨基酸23-134,或SEQ ID NO: 18的氨基酸25-134,其中在位置28 和40處的一個(gè)或全部?jī)蓚€(gè)氨基酸由非野生型氨基酸取代，其保留與激 活素A、肌抑素或GDF-11結(jié)合的能力。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"位置 28"和"位置40"(即，E28和R40)指參照包括18個(gè)氨基酸的信號(hào)序列 的序列SEQ ID NO: 2和18而言的氨基酸位置。為了一致性，如果針 對(duì)成熟的或截短的成熟序列，成熟的vActRIIB多肽具有在位置10和/ 或位置22處的取代，或截短的成熟多肽具有在位置6和/或位置18處 的取代，或在位置4和/或位置16處的取代，那么這些變體仍將針對(duì) 全長(zhǎng)SEQ ID NO: 2和18而言，或如圖1或2中所示，即在位置E28 和/或R40處的氨基酸取代。此種成熟的實(shí)施方案或N末端截短的實(shí)施 方案在下文例示。
在一個(gè)實(shí)施方案中，在位置E28處的取代選自氨基酸W、 Y和A。 在一個(gè)實(shí)施方案中，在位置28處的取代是W。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方 案中，在位置28處的取代選自氨基酸A、 F、 Q、 V、 I、 L、 M、 K、 H、 W 和Y。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在位置40處的取代選自氨基酸G、 Q、 M、 H、 K和N。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在位置28處的取代選
12自氨基酸A、 F、 Q、 V、 I、 L、 M、 K、 H、 W和Y,并且在位置40處的取 代選自氨基酸A、 G、 Q、 M、 H、 K和N。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包 含具有選自SEQ ID N0: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97的氨基酸序列的多肽。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含由具有SEQ IDNO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94、 96中所 示序列或其互補(bǔ)序列的多核苷酸編碼的多肽。
在一個(gè)實(shí)施方案中，信號(hào)序列從vActRIIB多肽中去除，留下成熟 的變體多肽。各種信號(hào)肽可以在本申請(qǐng)的多肽制備中使用。信號(hào)肽可 以具有圖l和2中所示的序列(SEQIDN0: 73)或可替代的信號(hào)序列， 例如SEQ ID NO: 74,即SEQ ID NO: 2和18的信號(hào)序列?？梢允褂脤?duì) 于表達(dá)vActRIIB或vActRIIB5多肽有用的任何其他信號(hào)肽。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，vActRIIB多肽具有與SEQ ID NO: 2和18 基本上相似的序列。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"基本上相似的"指與SEQ ID NO: 2和18中所示的氨基酸序列具有至少約80%同一性、至少約85 %同一性、至少約90%同一性、至少約95%同一性、至少約98%同一 性或至少約99%同一性的多肽，并且其中在位置28和/或40處的一個(gè) 或全部?jī)蓚€(gè)氨基酸由非野生型氨基酸取代，其中多肽保留SEQ ID NO: 2和18的多肽的活性，即結(jié)合且抑制肌抑素、激活素A或GDF-11的能 力。此外，術(shù)語(yǔ)vActRIIB多肽包含SEQ ID NO: 2或18的片段，例如 包含本文描述的在位置28和/或40處的取代的N和C末端截短，其中 所迷多肽能夠結(jié)合且抑制肌抑素、激活素A或GDF-11。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)vActRIIB和vActRIIB5多肽的"書(shū)f生物"指 至少一種另外的化學(xué)部分、或至少一種另外的多肽的連接，以形成共 價(jià)或聚集綴合物例如糖基、脂質(zhì)、乙酰基、或者C末端或N末端融合 多肽、與PEG分子的綴合、和下文更充分地描述的其他修飾。變體 ActRIIB受體多肽(vActRIIB)也可以包括另外的修飾和衍生物，包括 對(duì)于C和N末端的修飾，其來(lái)源于由于在各種細(xì)胞類型中表達(dá)的加工， 所述細(xì)胞類型例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、大腸桿菌、酵母和其他重組宿主細(xì) 胞。另外包括的是vActRIIB多肽片4殳以及包含SEQ ID NO: 4、 6、 8、10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97中所示多肽序列的滅活的N糖基化位點(diǎn)、滅活的蛋白 酶加工位點(diǎn)、或保守氨基酸取代的多肽。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"vActRIIB或vActRIIB5多肽活性"或"可溶 性ActRIIB或ActRIIB5多肽的生物活性"指vActRIIB和vActRIIB5多 肽的 一種或多種體外或體內(nèi)活性，其包括但不限于下文實(shí)施例中證實(shí) 的那些。vActRIIB多肽的活性包括但不限于與肌抑素或激活素A或 GDF-11結(jié)合的能力，以及減少或中和肌抑素或激活素A或GDF-11的活 性的能力。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"能夠與肌抑素、激活素A或GDF-ll 結(jié)合"指通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，例如下文實(shí)施例2中描述的Biacore 法測(cè)量的結(jié)合。此外，在實(shí)施例2中，基于pMARE C2C12細(xì)胞的測(cè)定 方法測(cè)量激活素A中和活性、肌抑素中和活性、和GDF-ll中和活性。 體外活性包括但不限于增加體重、增加無(wú)脂肪月幾肉量(lean muscle mass)、增加骨骼肌肉量、減少脂肪量，如下文動(dòng)物;^莫型中證實(shí)的和如 本領(lǐng)域已知的。生物活性進(jìn)一步包括減少或預(yù)防由某些類型的癌癥引 起的惡病質(zhì)、防止某些類型的肺瘤生長(zhǎng)、且增加某些動(dòng)物模型的存活。 vActRIIB多肽活性的進(jìn)一步討論在下文提供。
本發(fā)明的多肽進(jìn)一步包含直接或通過(guò)接頭序列與vActRIIB多肽連 接，以形成融合蛋白的異源多肽。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"融合蛋白" 指具有經(jīng)由重組DNA技術(shù)連接的異源多肽的蛋白質(zhì)。異源多肽包括但 不限于Fc多肽、his標(biāo)記、和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，以促進(jìn)變體ActRIIB 多肽的寡聚化和穩(wěn)定化，如例如引入本文作為參考的WO 00/29581中 描述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，異源多肽是Fc多肽或結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí) 施方案中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域選自人IgGl、 IgG2和IgG4 Fc結(jié)構(gòu)域。這些在 SEQ ID NO: 80、 82和84中提供。vActRIIB可以進(jìn)一步包含與其各自 的IgG Fc區(qū)域鄰近的IgGl、 IgG2或IgG4的鉸鏈序列的全部或部分。 IgGl、 IgG2和IgG4的完整鉸鏈序列分別在SEQ ID NO: 76、 77和78 中提供。
vActRIIB多肽可以任選進(jìn)一步包含"接頭"序列。接頭主要充當(dāng)多 肽和第二種異源多肽或其他類型的融合物之間或者兩個(gè)或更多變體
ActRIIB多肽之間的間隔物。在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭由通過(guò)肽4建連接在一起的氨基酸組成，優(yōu)選通過(guò)肽鍵連接的1-20個(gè)氨基酸，其中氨基 酸選自20種天然存在的氨基酸。這些氨基酸中的一個(gè)或多個(gè)可以是糖 基化的，如本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的。在一個(gè)實(shí)施方案中，1-20個(gè)氨基 酸選自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和賴氨酸。優(yōu) 選地，接頭由非空間位阻的大部分氨基酸例如甘氨酸和丙氨酸組成。 示例性接頭是聚甘氨酸(特別是(Gly) 5、 (Gly) 8、聚(Gly-Ala)和 聚丙氨酸。如下文實(shí)施例中所示的一種示例性合適的接頭是(Gly )4Ser (SEQ ID NO: 75)。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，vActRIIB可以包含 鉸鏈接頭，這是提供與鉸鏈區(qū)鄰近的接頭序列，如SEQ ID NO: 79中 例示的。
接頭也是非肽接頭。例如，可以使用烷基接頭例如-麗-(CH2) s-C (0)-,其中s = 2-20。這些烷基接頭可以進(jìn)一步由任何非空間位阻 基團(tuán)取代，所述基團(tuán)例如低級(jí)烷基(例如d-")、低級(jí)?；⒇账?例 如C1、 Br)、 CN、麗2、苯基等。
在一個(gè)實(shí)施方案中，vActRIIB多肽可以直接或經(jīng)由接頭或經(jīng)由4交 鏈接頭與Fc多肽連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c是人IgG Fc。與Fc連 接的vActRIIB包括例如vActRIIB-IgGlFc、 E28A (SEQ ID NO: 60); vActRIIB-IgGlFc、 E28W(SEQ ID NO: 62)、 vActRIIB-IgGlFc、 E28Y (SEQ ID NO: 64)、 vActRIIB-IgG Fc 、 R40G (SEQ ID NO: 66 vActRIIB5-IgGlFc、 E28A ( SEQ ID NO: 70 )和vActRIIB5-IgGlFc E28W (SEQ ID NO: 72),如表1和2中所示，以及在本文實(shí)施例中描述。 進(jìn)一步的實(shí)施方案包括vActRIIB-IgG2 Fc、 E28W (SEQ ID NO: 91)、 vActRIIB-IgG2 Fc、 E28Y ( SEQ ID NO: 93 )和vActRIIB-IgG2 Fc ( SEQ ID NO: 95)。如下文實(shí)施例中證實(shí)的，與野生型ActRIIB-IgG2 IgG2 比較，變體已證實(shí)產(chǎn)生更少的聚集。
本文公開(kāi)的vActRIIB多肽還可以與非多肽分子連接用于賦予所需 性質(zhì)的目的，所述性質(zhì)例如減少降解和/或增加半衰期、減少毒性、減 少免疫原性、和/或增加ActRIIB多肽的生物活性。示例性分子包括但 不限于線性聚合物例如聚乙二醇(PEG)、聚賴氨酸、葡聚糖；脂質(zhì)； 膽固醇基團(tuán)(例如類固醇)；碳水化合物、或寡糖分子。
在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包含編碼本發(fā)明的vActRIIB多肽 多核普酸的分離核酸分子。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"分離的"指由內(nèi)源材料純化至一定程度的核酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分
子包含編碼SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97的多肽的多核苷酸。 由于已知的遺傳密碼簡(jiǎn)并性(其中超過(guò)一個(gè)密碼子可以編碼相同氨基 酸)，DNA序列可以與SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94和96中所示的那種，或SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94和96的互補(bǔ)鏈不同，并且仍編碼具有SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97的氨基酸序列的多肽。此種變體DNA序列可以起因于 在生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生的沉默突變，或可以是這些序列的有意誘變的產(chǎn)物。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子包含具有SEQ ID NO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94和96中所示的多核普酸序列，或SEQIDNO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、 23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、 59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94和96的互補(bǔ)鏈的 多核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了這樣的核酸分子，其 在嚴(yán)格或中等條件下與SEQ IDNO: 3、 5、 7、 9、 11、 13、 15、 19、 21、
23、 25、 27、 29、 31、 33、 35、 37、 39、 41、 43、 45、 51、 53、 55、
59、 61、 63、 65、 67、 69、 71、 92、 94和96的多肽編碼區(qū)雜交，其中 所編碼的多肽包含SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、
24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、
60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97中所示的氨 基酸序列，并且其中所編碼的多肽保持vActRIIB多肽的活性。
本發(fā)明的核酸分子包含單鏈和雙鏈形式的DM,及其RM互補(bǔ)序列。 DM包括例如cDNA、基因組DNA、合成DNA、由PCR擴(kuò)增的DNA、及其 組合。基因組DNA可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行分離，例如通過(guò)使用SEQ IDNO:1或17的DNA或其合適的片段作為探針。編碼ActRIIB多肽的基因組 DNA得自對(duì)于許多物種可用的基因組文庫(kù)。合成DNA可以這樣獲得重 疊寡核普酸片段的化學(xué)合成，隨后為片段的組裝，以重構(gòu)編碼區(qū)和側(cè) 翼序列的部分或全部。RNA可以得自指導(dǎo)mRNA的高水平合成的原核生 物表達(dá)載體，例如使用T7啟動(dòng)子和RM聚合酶的載體。cDNA得自由 mRNA制備的文庫(kù)，所述mRNA從表達(dá)ActRIIB的各種組織中分離。本發(fā) 明的DNA分子包括全長(zhǎng)基因以及其多核普酸和片段。全長(zhǎng)基因也可以 包括編碼N末端信號(hào)序列的序列。
在本發(fā)明的另一個(gè)方面，還提供了包含核酸序列的表達(dá)載體，并 且還提供了用此種載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞和產(chǎn)生vActRIIB多肽的方法。 術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"指用于由多核苦酸序列表達(dá)多肽的質(zhì)粒、噬菌體、病毒 或載體。用于表達(dá)vActRIIB多肽的載體最少包含對(duì)于載體繁殖和克隆 的插入片段表達(dá)所需的序列。表達(dá)載體包含轉(zhuǎn)錄單位，所述轉(zhuǎn)錄單位 包含(1)在基因表達(dá)中具有調(diào)節(jié)作用的遺傳元件，例如啟動(dòng)子或增強(qiáng) 子，(2 )編碼待轉(zhuǎn)錄成mRM且翻譯成蛋白質(zhì)的vActRIIB多肽的序列， 和(3)合適的轉(zhuǎn)錄起始和終止序列的組裝。這些序列可以進(jìn)一步包括 選擇標(biāo)記。適合于在宿主細(xì)胞中表達(dá)的載體可容易獲得，并且核酸分 子使用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)插入載體內(nèi)。此種載體可以包括在特定組織 中起作用的啟動(dòng)子，和用于在祐:耙定的人或動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)vActRIIB 的病毒載體。適合于表達(dá)vActRIIB的示例性表達(dá)載體是包含vActRIIB 多核苷酸的pDSRa (在引入本文作為參考的W0 90/14363中描述)及其 衍生物，以及本領(lǐng)域已知的或下文描述的任何另外合適的載體。
本申請(qǐng)進(jìn)一步提供了制備vActRIIB多肽的方法?？梢岳酶鞣N其 他表達(dá)/宿主系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包括但不限于微生物例如用重組噬菌體轉(zhuǎn) 化的細(xì)菌、質(zhì)?；蛘沉NA表達(dá)載體；用酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母； 用病毒表達(dá)載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；用病毒表 達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)轉(zhuǎn)染的 或用細(xì)菌表達(dá)載體(例如，Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)； 或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。在重組蛋白質(zhì)產(chǎn)生中有用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括但不 限于VER0細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系、或其衍生 物例如在無(wú)血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的Veggie CH0和相關(guān)細(xì)胞系(參見(jiàn)Rasmussen等人，1998, Cytotechnology 28: 31)、或DHFR缺陷的CHO 抹DX-Bll (參見(jiàn)Urlaub等人，1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-20 ), COS細(xì)胞例如猴腎細(xì)胞的COS-7系(ATCC CCL 1651 )(參見(jiàn) Gl謹(jǐn)an等人，1981, Cell 23: 175 ), W138, BHK, HepG2， 3T3(ATCC CCL 163), RIN, MDCK， A549， PC12, K562， L細(xì)月包，C127細(xì)月包，BHK (ATCC CRL 10)細(xì)胞系，衍生自非洲綠猴腎細(xì)胞系CV1的CV1/EBNA 細(xì)胞系(ATCC CCL 7G)(參見(jiàn)McMahan等人,1991， EMB0 J. 10: 2821 ), 人胚腎細(xì)胞例如293、 293 EBNA或MSR 293,人表皮A431細(xì)胞，人Co1()205 細(xì)胞，其他轉(zhuǎn)化的靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞系，正常二倍體細(xì)胞，衍生自原代 組織的體外培養(yǎng)的細(xì)胞株，原代外植體，HL-60, U937 , HaK或Jurkat
溶性多肽。
使用合適的宿主-載體系統(tǒng)，vActRIIB多肽通過(guò)在允許產(chǎn)生的條件 下培養(yǎng)宿主細(xì)胞來(lái)重組產(chǎn)生，所述宿主細(xì)胞用包含本發(fā)明的核酸分子 的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可以用于長(zhǎng)期、高產(chǎn)率多肽生產(chǎn)。 一種此 種細(xì)胞用包含選擇標(biāo)記以及所需表達(dá)盒的載體轉(zhuǎn)化，可以允許該細(xì)胞 在其轉(zhuǎn)換到選擇培養(yǎng)基前在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天。選擇標(biāo)記設(shè)計(jì) 為允許成功表達(dá)引入序列的細(xì)胞的生長(zhǎng)和回收。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗性 簇可以使用適合于所采用的細(xì)胞系的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行增殖。重組蛋 白質(zhì)表達(dá)的概述在Methods of Enzymology,第185巻，Goeddell, D. V., 編輯，Academic Press ( 1990 )中發(fā)現(xiàn)。
在某些情況下，例如在使用原核系統(tǒng)的表達(dá)中，本發(fā)明的表達(dá)多 肽可能需要"重折疊，，且氧化成合適的三級(jí)結(jié)構(gòu)并且產(chǎn)生二硫鍵，以便成 為生物活性的。重折疊可以使用本領(lǐng)域眾所周知的許多操作來(lái)實(shí)現(xiàn)。 此種方法包括例如在離液劑的存在下使溶解的多肽暴露于通常超過(guò)7 的pH。離液劑的選擇類似于用于包含體溶解的選擇，然而，離液劑一 般以較低濃度使用。示例性離液劑是胍和尿素。在大多數(shù)情況下，重 折疊/氧化溶液也將包含特定比例的還原劑加其氧化形式，以產(chǎn)生允許 二硫化物改組發(fā)生的特定氧化還原電位，用于形成半胱氨酸橋。某些 常用的氧化還原偶包括半胱氨酸/胱胺、谷胱甘肽/二^5克代雙GSH、氯化 銅、二硫蘇糖醇DTT/二p塞烷DTT、和2-巰基乙醇(bME ) /二硫代-bME。 在許多情況下，共溶劑可以用于增加重折疊的效率。常用的共溶劑包括甘油、各種分子量的聚乙二醇和精氨酸。
此外，可以根據(jù)常規(guī)技術(shù)在溶液中或在固體支持物上合成多肽。 各種自動(dòng)合成儀是商購(gòu)可得的，并且可以根據(jù)已知方案進(jìn)行使用。參
見(jiàn)例如，Stewart和Young, Solid Phase Peptide Synthesis,第2 版，Pierce Chemical Co. ( 1984 ); Tarn等人，J Am Chem Soc, 105: 6442, ( 1983 ); Merrifield, Science 232: 341-347 ( 1986 ); Barany 和Merrifield, The Pept ides, Gross和Meienhofer,編輯，Academic Press, New York, 1-284; Barany等人,Int J Pep Protein Res , 30: 705-739 ( 1987 )。
本發(fā)明的多肽和蛋白質(zhì)可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的蛋白 質(zhì)純化技術(shù)進(jìn)行純化。這些技術(shù)在一個(gè)水平上涉及蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì) 級(jí)分的粗分級(jí)分離。使肽多肽與其他蛋白質(zhì)分開(kāi)后，目的肽或多肽可 以使用層析和電泳技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步純化，以達(dá)到部分或完全純化(或 純化至同質(zhì)性)。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"分離的多肽"或"純化的多肽" 意指可與其他組分分離的組合物，其中多肽純化至相對(duì)于其可天然獲
得狀態(tài)的任何程度。純化多肽因此也指離開(kāi)它可能天然存在的環(huán)境的 多肽。 一般地，"純化的"將指已實(shí)施分級(jí)分離以去除各種其他組分的多 肽組合物，并且所述組合物基本上保留其表達(dá)的生物活性。當(dāng)使用術(shù) 語(yǔ)"基本上純化的"時(shí)，這個(gè)命名將指這樣的肽或多肽組合物，即，其中 肽或多肽形成組合物的主要組分，例如構(gòu)成組合物中約50%、約60%、 約70%、約80%、約85%或約90%或更多的蛋白質(zhì)。
適合于在純化中使用的各種技術(shù)將是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知 的。這些包括例如用硫酸銨、PEG、抗體(免疫沉淀)等或通過(guò)熱變性 沉淀，隨后離心；層析例如親和層析(蛋白質(zhì)A柱)、離子交換、凝膠 過(guò)濾、反相、羥基磷灰石、疏水相互作用層析；等電點(diǎn)聚焦；凝膠電 泳；以及這些4支術(shù)的組合。如本領(lǐng)域一^:已知的，^人為扭J亍各種純化^ 步驟的順序可以改變，或某些步驟可以省略，并且仍得到用于制備基 本上純化的多肽的合適方法。示例性純化步驟在下文實(shí)施例中提供。
用于對(duì)多肽純化程度進(jìn)行定量的各種方法依照本公開(kāi)內(nèi)容將是本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些包括例如測(cè)定活性級(jí)分的特異性結(jié)合活性、 或通過(guò)SDS/PAGE分析評(píng)估級(jí)分內(nèi)的肽或多肽量。用于評(píng)估多肽級(jí)分的 純度的優(yōu)選方法是計(jì)算級(jí)分的結(jié)合活性，使其與起始提取物的結(jié)合活性比較，且因此計(jì)算純化程度，在本文中通過(guò)"純化倍數(shù)"評(píng)估。用于代 表結(jié)合活性量的實(shí)際單位當(dāng)然將依賴在純化后所選擇的具體測(cè)定技 術(shù)，以及多肽或肽是否顯示可檢測(cè)的結(jié)合活性。
變體激活素IIB型多肽與激活肌肉降解級(jí)聯(lián)的配體結(jié)合。能夠結(jié) 合且抑制配體激活素A、肌抑素和/或GDF-11的活性的vActRIIB多肽 具有針對(duì)涉及肌肉萎縮的疾病，以及治療某些癌癥和如下文實(shí)施例中 所示的其他疾病的治療潛力。
然而，聚集可以在表達(dá)或純化野生型ActRIIB或ActRIIB5多肽時(shí) 發(fā)生。這種聚集包括在表達(dá)過(guò)程中有結(jié)構(gòu)的寡聚體形成，以及在表達(dá) 過(guò)程中和多肽純化后無(wú)結(jié)構(gòu)的聚集物的產(chǎn)生。
結(jié)構(gòu)分析、分子建模和質(zhì)譜法的組合方法已表明，多聚化可以經(jīng) 由分子間二硫鍵形成在ActRIIB多肽中出現(xiàn)，所述分子間二硫鍵形成 由非糖基化的ActRIIB多肽之間的靜電和氫鍵合相互作用幫助。顯著 的氫鍵存在于兩個(gè)ActRIIB分子的界面處；例如在一個(gè)ActRIIB的E28 側(cè)鏈和另一個(gè)ActRIIB的R40側(cè)鏈之間。此外，關(guān)4建的靜電相互作用 存在于一個(gè)ActRIIB的E28和另一個(gè)ActRIIB的R40之間。
這些靜電相互作用可以顯著促成增加暫時(shí)的ActRIIB二聚體群體， 導(dǎo)致促進(jìn)在ActRIIB單位之間的非共價(jià)和/或共價(jià)鍵形成。殘基28和 40之間的相互作用是這些相互作用中最關(guān)鍵的，因?yàn)檫@兩個(gè)殘基參與 雙氫鍵和強(qiáng)靜電相互作用。殘基28和40參與ActRIIB: ActRIIB相互 作用而不參與ActRIIB:配體相互作用。因此，殘基28和40根據(jù)本發(fā) 明可以由非天然氨基酸取代，以改善溶解度、且減少受體多肽的聚集。 因此，E28和R40可以分別由其他可能的天然氨基酸取代、表達(dá)、且如 下所述通過(guò)Bi&core進(jìn)4亍測(cè)試。Biacore測(cè)定的結(jié)合顯示于下文實(shí)施例 2中的表1A和1B中。此外，vActRIIB多肽的聚集百分比在下文測(cè)定。
下文實(shí)施例中的結(jié)果顯示具有本文描述的氨基酸取代的vActRIIB 多肽和蛋白質(zhì)的聚集減少，同時(shí)保留結(jié)合且中和肌抑素、激活素A或 GDF-ll的能力。
抗體
本發(fā)明進(jìn)一步包括與變體ActRIIB多肽結(jié)合的抗體，包括與本發(fā) 明的vActRIIB多肽特異性結(jié)合的那些。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"特異
20性結(jié)合"指對(duì)于vActRIIB多肽具有106 M—或更大的結(jié)合親和力(Ka) 的抗體。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體"指完整抗體，包括多克隆抗體(參 見(jiàn)侈'H口 Ant ibodies: A Laboratory Manua 1, Harlow和Lane (編4辱)， Cold Spring Harbor Press, ( 1988 ))，和單克隆抗體(參見(jiàn)例如美國(guó) 專利號(hào)RE 32,011、 4,902,614 、 4,543,439和4,411,993,以及 Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Ke誕tt， McKearn和Bechtol (編輯)(1980 ))。如本 文所使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體，，還指通過(guò)重組DM技術(shù)或者通過(guò)酶促或化學(xué)切 割完整抗體產(chǎn)生的抗體片段，例如F(ab)、 F(ab，)、 F ( ab， ) 2、 Fv、 Fc和單鏈抗體。術(shù)語(yǔ)"抗體"還指雙特異性或雙功能抗體，其是具有兩 個(gè)不同重/輕鏈對(duì)和兩個(gè)不同結(jié)合位點(diǎn)的人工雜交抗體。雙特異性抗體 可以通過(guò)各種方法產(chǎn)生，包括雜交瘤的融合或Fab，片段的連接(參見(jiàn) Songsivilai等人，CI in. Exp. Immunol. 79: 315-321( 1990 ), Kostelny 等人，J. Imm畫(huà)1.148: 1547-1553 ( 1992 ))。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"抗體"還指嵌合抗體，即具有與一個(gè)或多個(gè) 非人可變抗體免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)的人恒定抗體免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域 的抗體，或其片段(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)5， 595， 898和美國(guó)專利號(hào) 5， 693， 493 )?？贵w還指"人源化"抗體(參見(jiàn)例如，美國(guó)專利號(hào)4, 816， 567 和W0 94/1 0332 )、樣￡抗體(minibodies) (W0 94/09817 )、 大抗體 (maxibodies )、和由轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生的抗體，其中包含產(chǎn)生人抗體的 基因的一部分但在內(nèi)源抗體產(chǎn)生方面缺陷的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠產(chǎn)生人抗 體(參見(jiàn)例如,Mendez等人,Nature Genetics 15: 146-156 ( 1997 ) 和美國(guó)專利號(hào)6,300,129 )。術(shù)語(yǔ)"抗體"還包括多聚抗體、或蛋白質(zhì)的
更高級(jí)別復(fù)合物例如異二聚抗體和抗獨(dú)特型抗體。"抗體"還包括抗獨(dú)特 型抗體。抗vActRIIB的抗體可以例如用于在體外和體內(nèi)鑒定且定量 vActRIIB。
還包括的是來(lái)自任何哺乳動(dòng)物的多克隆抗體，例如小鼠和大鼠抗 體、和兔抗體，其與本文描述的vActRIIB多肽特異性結(jié)合，所述 vActRIIB多肽包4舌SEQ ID NO: 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 20、 22、 24、 26、 28、 30、 32、 34、 36、 38、 40、 42、 44、 46、 52、 54、 56、 60、 62、 64、 66、 68、 70、 72、 87、 88、 91、 93、 95和97。
此種抗體可以用作研究工具并且可以在定量測(cè)定中用于檢測(cè)且測(cè)定本文公開(kāi)的多肽。此種抗體使用上文描述的方法和如本領(lǐng)域已知的
來(lái)制備。
藥物組合物
還提供了包含本發(fā)明的vActRIIB蛋白質(zhì)和多肽的藥物組合物。此 種組合物包含與藥學(xué)上可接受的材料和生理學(xué)上可接受的制劑材料混 合的、治療或預(yù)防有效量的多肽或蛋白質(zhì)。藥物組合物可以包含用于 修飾、維持或保留例如組合物的pH、重量摩爾滲透壓濃度、粘性、澄 清度、顏色、等滲性、氣味、無(wú)菌性、穩(wěn)定性、溶解或釋放速度、吸 收或滲透的制劑材料。合適的制劑材料包括但不限于，氨基酸(例如 甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸)；抗微生物劑；抗氧 化劑(例如抗壞血酸、亞石危酸鈉或亞碌u酸氫鈉)；纟爰沖劑(例如硼酸鹽、 碳酸氫鹽、Tris-HC1、檸檬酸鹽、磷酸鹽、其他有機(jī)酸)；膨脹劑(例 如甘露醇或甘氨酸)，螯合劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA ));絡(luò)合劑(例 如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、(3-環(huán)糊精或羥丙基-P-環(huán)糊精)；填充劑； 單糖；二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白質(zhì) (例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；著色劑；調(diào)味劑和稀釋劑； 乳化劑；親水聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成鹽抗 衡離子(例如鈉)；防腐劑(例如苯扎氯銨、苯曱酸、水楊酸、硫柳汞、 苯乙醇、對(duì)羥基苯甲酸甲酯、對(duì)羥基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或 過(guò)氧化氫)；溶劑(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露 醇或山梨糖醇)；懸浮劑；表面活性劑或濕潤(rùn)劑(例如普流羅尼 (pluronics)、 PEG、脫水山梨糖醇酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯 例如聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油 酸酯、triton、氨基丁三醇、卵磷脂、膽固醇、tyloxapal);穩(wěn)定性 增強(qiáng)劑(蔗糖或山梨糖醇)；張度增強(qiáng)劑(例如堿金屬鹵化物(優(yōu)選氯 化鈉或鉀、甘露醇、山梨糖醇)；遞送媒介物；稀釋劑；賦形劑和/或 藥物佐劑(Remington's Pharmaceutical Sciences, 第 18片反，A. R. Gennaro, 編輯,Mack Publishing Company, 1990 )。
最佳藥物組合物將通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員依賴?yán)珙A(yù)期施用途徑、 遞送形式和所需劑量進(jìn)4亍確定。參見(jiàn)例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,同上。此種組合物可以影響身體狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速度、和多肽的體內(nèi)清除速度。例如，合適的組合物 可以是用于腸胃外施用的注射用水、生理鹽水溶液。
藥物組合物中的主要媒介物或載體的性質(zhì)可以是水性的或非水性 的。例如，合適的々某介物或載體可以是注射用水、生理鹽水溶液或人 工腦脊液，可能補(bǔ)充有在用于腸胃外施用的組合物中常見(jiàn)的其他材料。 中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是進(jìn)一 步的示例性媒介物。
其他示例性藥物組合物包含約pH 7.0-8.5的Tris緩沖液、或約pH 4.0-5.5的乙酸鹽緩沖液，其可以進(jìn)一步包括山梨糖醇或其合適的替代 物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，組合物可以通過(guò)使具有所需純度的 所選纟且合物與^f壬選的酉己制試劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences,同上)，以凍干團(tuán)塊或水i容液的形式制備用于貯存。此外， 治療組合物可以<吏用合適的賦形劑例如蔗糖配制為凍干物。
制劑可以以各種方法進(jìn)4亍遞送，例如通過(guò)吸入療法、口月l或通過(guò) 注射。當(dāng)考慮腸胃外施用時(shí)，用于在本發(fā)明中使用的治療組合物可以 是包含藥學(xué)上可接受的媒介物中的所需多肽的無(wú)熱原、腸胃外可接受 的水溶液的形式。用于腸胃外注射的特別合適的媒介物是無(wú)菌蒸餾水， 其中多肽配制為無(wú)菌、等滲溶液，適當(dāng)保存。另外一種制劑可以涉及 所需分子與試劑的配制，所述試劑例如可注射微球體、生物可蝕解顆 粒、聚合化合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠或脂質(zhì)體，所述試劑提供 用于產(chǎn)物的控制或持續(xù)釋放，所述產(chǎn)物隨后可以經(jīng)由儲(chǔ)存注射進(jìn)行遞 送。還可以使用透明質(zhì)酸，并且這可以具有促進(jìn)循環(huán)中的持續(xù)時(shí)間的 置。； 、、 、 。 、纟、、"
在另一個(gè)方面，適合于可注射施用的藥物制劑可以在水溶液中進(jìn) 行配制，優(yōu)選在生理學(xué)上相容的緩沖液中，例如Hanks液、林才各氏溶 液或生理學(xué)緩沖鹽水。水性注射懸浮液可以包含增加懸浮液的粘度的 物質(zhì)，例如羧曱基纖維素鈉、山梨糖醇或右旋糖酐。此外，活性化合 物的懸浮液可以制備為合適的油性注射懸浮液。合適的親脂溶劑或媒 介物包括脂肪油例如芝麻油，或合成脂肪酸酯例如油酸乙酯、甘油三 酯或脂質(zhì)體。非脂質(zhì)聚陽(yáng)離子氨基聚合物也可以用于遞送。任選地， 懸浮液還可以包含合適的穩(wěn)定劑或試劑，以增加化合物的溶解度且允 許制備高濃縮溶液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物可以配制用于
23個(gè)實(shí)施方案中，溶液可以是霧化的。肺施用在PCT申請(qǐng)?zhí)?PCT/US94/001875中進(jìn)一步描述，所述專利申請(qǐng)描述化學(xué)修飾的蛋白質(zhì) 的肺遞送。
還考慮某些制劑可以口服施用。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，以
制中通常使用的那些載體進(jìn)行配制。例如，膠嚢可以設(shè)計(jì)為在胃腸道 中的點(diǎn)上當(dāng)生物利用度達(dá)到最大和系統(tǒng)前降解降到最低時(shí)釋放制劑的 活性部分?？梢园硗獾脑噭┮源龠M(jìn)治療分子的吸收。還可以采用 稀釋劑、調(diào)味劑、低熔點(diǎn)蠟、植物油、潤(rùn)滑劑、懸浮劑、片劑崩解劑 和粘合劑。用于口服施用的藥物組合物也可以使用本領(lǐng)域眾所周知的 藥學(xué)上可接受的載體以適合于口服施用的劑量進(jìn)行配制。此種載體使 得藥物組合物能夠配制為用于由患者攝入的片劑、丸劑、錠劑、膠嚢、 液體、凝膠、糖漿劑、膏劑、懸浮液等。
用于口服使用的藥物制劑可以這樣獲得使活性化合物與固體賦 形劑組合，且加工所產(chǎn)生的顆?；旌衔?任選地，在研磨后)，以獲得 片劑或錠劑核心。需要時(shí)，可以加入合適的助劑。合適的賦形劑包括 碳水化合物或蛋白質(zhì)填充劑，例如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖醇和 山梨糖醇；來(lái)自玉米、小麥、稻、馬鈴薯或其他植物的淀粉；纖維素， 例如甲基纖維素、羥丙基曱基纖維素、或羧曱基纖維素鈉；樹(shù)膠，包 括阿拉伯膠和黃蓍膠；和蛋白質(zhì)例如明膠和膠原。需要時(shí)，可以加入
崩解劑或增溶劑，例如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂和海藻酸或其鹽， 例如海藻酸鈉。
錠劑核心可以與合適的包衣例如濃縮糖溶液結(jié)合使用，所述包衣 還可以包含阿拉伯樹(shù)膠、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝膠、 聚乙二醇、和/或二氧化鈦、漆溶液、和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。 染料或色素可以加入片劑或錠劑包衣內(nèi)，用于產(chǎn)品鑒定或表征活性化 合物的量，即劑量。
可以口服使用的藥物制劑還包括由明膠制成的推入配合膠嚢，以 及由明膠制成的軟的、密封膠嚢，和包衣例如甘油或山梨糖醇。推入 配合膠嚢可以包含與填充劑或粘合劑例如乳糖或淀粉，潤(rùn)滑劑例如滑 石粉或硬脂酸鎂混合，和任選與穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠嚢中，活性化合物可以連同或不連同穩(wěn)定劑溶解或懸浮于合適的液體內(nèi)，所 述液體例如脂肪油、液體、或液體聚乙二醇。
另外的藥物組合物對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的，包括涉 及在持續(xù)或控制遞送制劑中的多肽的制劑。用于配制各種其他持續(xù)或 控制遞送方式，例如脂質(zhì)體載體、生物可蝕解的微?；蚨嗫字楹蛢?chǔ)存 注射的技術(shù)，也是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。參見(jiàn)例如，描述用于遞送
藥物組合物的多孔聚合微粒的控制釋放的PCT/US93/00829。持續(xù)釋放 制劑的另外例子包括成形物品形式的半透聚合物基質(zhì)，例如膜或微膠 嚢。持續(xù)釋放基質(zhì)可以包括聚酯、水凝膠、聚交酯(U. S. 3， 773， 919、 ep 58,481)、 l-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物(Sidman等人， Biopolymers， 22: 547-556 ( 1983 )、聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯) (Langer等人，J. Biomed. Mater. Res. , 15: 167-277， ( 1981 ); Langer 等人，Chem. Tech.,12: 98-105 ( 1982 ))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer 等人，同上)或聚-D (-) -3-羥丁酸(EP 1 33,988 )。持續(xù)釋放的組合 物還包括脂質(zhì)體，其可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的幾種方法中的任何一種進(jìn) 行配制。參見(jiàn)例如，Eppstein等人，PNAS (USA )， 82: 3688( 1985 ); EP 36,676; EP 88,046; EP 143, 949。
待用于體內(nèi)施用的藥物組合物一般必須是無(wú)菌的。這可以通過(guò)經(jīng) 過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)組合物凍干時(shí)，使用這種方法的滅菌可以 在凍干和重配前或后執(zhí)行。用于腸胃外施用的組合物可以以凍干形式 或在溶液中進(jìn)行貯存。此外，腸胃外組合物一般置于具有無(wú)菌進(jìn)入口 的容器內(nèi)，例如具有可由皮下注射針穿透的塞子的靜脈內(nèi)溶液包或管 形瓶。
一旦藥物組合物已配制，它就作為溶液、懸浮液、凝膠、乳狀液、 固體或脫水或凍干粉劑貯存于無(wú)菌管形瓶?jī)?nèi)。此種制劑可以以立即可 用形式或以在施用前需要重配的形式(例如，凍干的)進(jìn)行貯存。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生單劑施用單位的試 劑盒。試劑盒可以各自包含具有干燥蛋白質(zhì)的第一個(gè)容器和具有水制 劑的第二個(gè)容器。還包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)的是包含單和多室預(yù)填充 注射器(例如，液體注射器和溶解注射器(lyosyringes ))的試劑盒。
在治療上采用的有效量的藥物組合物將依賴?yán)缰委煴尘昂湍?的。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解用于治療的合適劑量水平因此將部分依遞送的分子、多肽用于的適應(yīng)癥、施用途徑、以及患者的體型(體重、 體表或器官大小)和狀況(年齡和一般健康)而變化。因此，臨床醫(yī) 生可以逐步滴加劑量且修改施用途徑以獲得最佳療效。
一 般的劑量可
以是約O. lmg/kg -最多約IOO mg/kg或更多，依賴上文提及的因素。 多肽組合物可以優(yōu)選靜脈內(nèi)注射或施用。長(zhǎng)效藥物組合物可以每3-4 天、每周或每2周進(jìn)行施用，依賴具體制劑的半衰期和清除率。給藥 頻率將依賴使用的制劑中的多肽的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 一般地，施用組 合物直至達(dá)到實(shí)現(xiàn)所需效應(yīng)的劑量。組合物因此可以作為單劑或多劑 (以相同或不同濃度/劑)隨時(shí)間施用，或作為連續(xù)輸注施用。常規(guī)進(jìn) 行合適劑量的進(jìn)一步改善。合適劑量可以通過(guò)使用合適的劑量-反應(yīng)數(shù) 據(jù)進(jìn)行確定。
藥物組合物的施用途徑依照已知方法，例如口月l、通過(guò)4爭(zhēng)月永內(nèi)、 腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)(實(shí)質(zhì)內(nèi))、腦室內(nèi)、肌內(nèi)、目艮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、門(mén)靜脈 內(nèi)、病變內(nèi)途徑、髓內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、經(jīng)皮、皮下或腹膜內(nèi)注射； 以及鼻內(nèi)、腸內(nèi)、局部、舌下、尿道、陰道或直腸方法，通過(guò)持續(xù)釋 放系統(tǒng)或通過(guò)植入裝置施用。需要時(shí)，組合物可以通過(guò)推注或連續(xù)輸 注或通過(guò)植入裝置進(jìn)行施用。可替代地或另外地，組合物可以經(jīng)由植 入已吸附或封裝所需分子的膜、海綿或其它合適材料進(jìn)行局部施用。 當(dāng)使用植入裝置時(shí)，裝置可以植入任何合適的組織或器官內(nèi)，并且所 需分子的遞送可以經(jīng)由擴(kuò)散、定時(shí)釋放丸或連續(xù)施用。
在某些情況下，本發(fā)明的vActRIIB多肽可以通過(guò)植入某些細(xì)胞進(jìn) 行遞送，所述細(xì)胞已使用例如本文描述的那些方法進(jìn)行基因工程化， 以表達(dá)和分泌多肽。此種細(xì)胞可以是動(dòng)物或人細(xì)胞，并且可以是自體 的、異體的或異種的。任選地，細(xì)胞可以是永生化的。為了減少免疫 應(yīng)答的機(jī)會(huì)，細(xì)胞可以進(jìn)行封裝以避免滲入周圍組織。封裝材料一般 是生物相容的、半透的聚合外殼或膜，其允許多肽產(chǎn)品的釋放，但避 免細(xì)胞被患者的免疫系統(tǒng)或來(lái)自周圍組織的其他有害因子破壞。
還考慮了在體內(nèi)的vActRIIB基因療法，其中將編碼vActRIIB或 vActRIIB書(shū)亍生物的核酸分子直接引入受試者內(nèi)。例如，經(jīng)由核酸構(gòu)建
體連同或不連同合適的遞送載體例如腺伴隨病毒載體的局部注射，將 編碼vActRIIB的核酸序列引入耙細(xì)胞內(nèi)。可替代的病毒載體包括但不 限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、單純皰滲病毒和乳頭瘤病毒載體?？梢酝ㄟ^(guò)包含所需核酸序列的所需核酸構(gòu)建體或其他合適的遞送載體的局部
注射、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、直接注射(棵露DNA)或微粒轟擊(基因槍) 在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)病毒載體的物理轉(zhuǎn)移。
vActRIIB組合物的用途
本發(fā)明提供了通過(guò)使多肽與vActRIIB多肽接觸，用于在體內(nèi)和在 體外減少或中和肌抑素、激活素A或GDF-ll的量或活性的方法和藥物 組合物。vActRIIB多肽對(duì)于肌抑素、激活素A和GDF-11具有高親和力， 并且能夠減少且抑制肌抑素、激活素A和GDF-ll中的至少一種的生物 活性。在某些實(shí)施方案中，與野生型ActRIIB多肽比較，vActRIIB多 肽顯示出改善的活性。這在下文實(shí)施例中證實(shí)。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了通過(guò)給受試者施用有效劑量的 vAc t R11B組合物，用于治療需要此種治療的受試者中的肌抑素相關(guān)和/ 或激活素A相關(guān)病癥的方法和試劑。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"受試者" 指任何動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，包括人。
本發(fā)明的組合物用于增加作為體重百分比的無(wú)脂肪肌肉量且減少
作為體重百分比的脂肪量。
可以通過(guò)vActRIIB組合物治療的病癥包括]旦不限于各種形式的朋j 肉消耗、以及代謝紊亂例如糖尿病和相關(guān)病癥、和骨退化性疾病例如 骨質(zhì)疏松癥。vActRIIB組合物已證實(shí)在治療下文實(shí)施例3中所示的各 種疾病才莫型的肌肉消耗病癥中有效。這在抑制素-a敲除小鼠中的肌肉 消耗治療、結(jié)腸-26癌癥惡病質(zhì)模型中的肌肉消耗治療、后肢懸吊模型 中的肌肉萎縮預(yù)防、顯示無(wú)脂肪肌肉量中的增加的0XV雌性治療、脂 肪量的減少和骨礦物質(zhì)含量的增加中得到證實(shí)。
肌肉消耗病癥還包括營(yíng)養(yǎng)不良，例如杜興氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、進(jìn)行性 肌營(yíng)養(yǎng)不良、貝克型肌營(yíng)養(yǎng)不良、代-蘭二氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、歐勃肌營(yíng)養(yǎng) 不良、和嬰兒神經(jīng)軸突肌營(yíng)養(yǎng)不良。另外的肌肉消耗病癥起于慢性疾 病或病癥，例如力幾萎縮性側(cè)索硬—化、充血性阻塞性肺疾病、癌癥、AIDS、 腎衰竭、器官萎縮、雄激素剝奪和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
肌抑素和/或激活素的超量表達(dá)可以促成惡病質(zhì)，即一種嚴(yán)重的肌 肉和脂肪消耗綜合征。vActRIIB多肽在治療動(dòng)物模型中的惡病質(zhì)中的 有效性在下文實(shí)施例3中顯示。惡病質(zhì)也由于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿
27病腎病、腎衰竭、化學(xué)療法、由于燒傷導(dǎo)致的損傷以及其他原因而出 現(xiàn)。在另一個(gè)例子中，發(fā)現(xiàn)肌抑素免疫反應(yīng)蛋白質(zhì)的血清和肌內(nèi)濃度
在顯示出AIDS相關(guān)肌肉消耗的人中增加，并且與無(wú)脂肪量體重相關(guān) (Gonzalez-Cadavid等人，PNAS USA 95: 14938-14943 ( 1998 ))。肌 抑素水平還已顯示反應(yīng)于燒傷而增加，導(dǎo)致分解代謝肌效應(yīng)(Lang等 人，F(xiàn)ASEB J 15, 1807-1809 ( 2001 ))。導(dǎo)致月幾肉消耗的另外狀況可能 起于由于殘廢導(dǎo)致的不活動(dòng)，例如限制在輪椅中、由于中風(fēng)長(zhǎng)期臥床 休息、疾病、脊髓損傷、骨折或創(chuàng)傷、和微重力環(huán)境(太空飛行)中 的肌肉萎縮。例如，發(fā)現(xiàn)血漿肌抑素免疫反應(yīng)蛋白質(zhì)在長(zhǎng)期臥床休息 后增加(Zachwieja等人J Gravit Physiol. 6 ( 2 ): 11 ( 1999 )。還 發(fā)現(xiàn)與未暴露的大鼠肌肉比較，在航天穿梭飛行過(guò)程中暴露于微重力 環(huán)境的大鼠肌肉表達(dá)增加量的肌抑素(Lalani等人，J. Endocrin 167 (3 ): 417-28 ( 2000 ))。
此外，脂肪與肌肉比的年齡相關(guān)性增加、以及年齡相關(guān)的肌肉萎 縮看起來(lái)與肌抑素相關(guān)。例如，在年輕(19-35歲)、中年(36-75歲) 和老年(76-92歲)男性和女性的組中，平均血清肌抑素-免疫反應(yīng)性 蛋白質(zhì)伴隨年齡而增加，而在這些組中平均肌肉量和無(wú)脂肪體重伴隨 年齡而減少(Yarasheski等人J Nutr Aging 6 ( 5 ): 343-8 ( 2002 ))。 此外，目前已發(fā)現(xiàn)肌抑素在心肌中以4氐水平表達(dá)，并且表達(dá)在梗死后 的心肌細(xì)胞中上調(diào)(Sharma等人，J Cell Physiol. 180( 1 ): 1-9( 1999 ))。 因此，減少心肌中的肌抑素水平可能改善梗死后心肌的恢復(fù)。
肌抑素看起來(lái)還影響代謝紊亂，包括2型糖尿病、非胰島素依賴 型糖尿病、高血糖癥和肥胖。例如，肌抑素的缺乏已顯示改善兩個(gè)小 鼠模型的肥胖和糖尿病表型(Yen等人/, & 479 ( 19")。已 在美國(guó)申請(qǐng)序列號(hào)11/590,962、美國(guó)申請(qǐng)
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