專利名稱：乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)及乙醇濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乙醇濃度的方
法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙醇具成癮性，酒濫用和酒依賴是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生
問題之一。在西方國(guó)家，酒精相關(guān)性肝病已成為死亡的第六位原因。在我國(guó)，近20年來，隨
著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人均酒消耗量大幅度上升，酒依賴的患病率日趨增高。 生物樣品中乙醇的定量測(cè)定方法主要有化學(xué)比色法，酶終點(diǎn)比色法，均相酶免疫
測(cè)定法(EIA)，氣相色譜法(GC)和呼出氣乙醇分析。此外血清滲透量法可作乙醇半定量分析。 有多種化學(xué)比色法曾用于乙醇定量測(cè)定，微量擴(kuò)散法是其中較簡(jiǎn)單實(shí)用的一種， 微量溢出的乙醇可使鉻酸還原成藍(lán)色的氧化鉻。 根據(jù)所用的試劑酶不同，乙醇的酶法測(cè)定分為二種乙醇氧化酶法和乙醇脫氫酶 法，與乙醇氧化酶法相比，乙醇脫氫酶法的專一性高，不會(huì)與甲醇和丙酮起催化反應(yīng)。
—般認(rèn)為氣相色譜法可作為參考方法，尤其在準(zhǔn)確性和精密度要求高的法醫(yī)學(xué)乙 醇測(cè)定中應(yīng)用最廣。GC法的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)在于特異、靈敏，且能同時(shí)分析多種揮發(fā)性醇類物質(zhì)， 如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和異丙醇。 其他乙醇的測(cè)定方法還有均相酶免疫分析(Homogeneous enzymeimm皿oassay)、 滲透量法、呼出氣乙醇分析法；用呼出氣乙醇分析儀檢測(cè)乙醇操作簡(jiǎn)單、快速，在交通執(zhí)法 部門應(yīng)用較多。這類儀器中一種是根據(jù)紅外光吸收原理設(shè)計(jì)的，該法測(cè)定的乙醇濃度與酶 法測(cè)得的血乙醇濃度相關(guān)性很好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出 一 種利用酶循環(huán)倍增法
(EnzymaticRecycling&Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)
及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計(jì)量通過酶聯(lián)反應(yīng)生成噴嗒胺色原(Indamine dye)或
醌亞胺色原(Quioneimine dye)所導(dǎo)致在400-700nm波長(zhǎng)處吸光度的上升，得以測(cè)定乙醇
濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，采用該試
劑不僅可以在可見光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行乙醇濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度
快、靈敏度大、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明乙醇濃度測(cè)定方法如下 乙醇+氧酒精氧化酶乙醛+過氧化氡 乙醛+水過氧化氡酶乙醇+過氧化氫 過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶吲嗒胺色原或 醌亞胺色原+水
5
這個(gè)方法應(yīng)用酒精氧化酶(alcohol oxidase ;EC 1. 1. 3. 13)(偶)聯(lián)過氧化氫酶 (Catalase ;EC 1. 11. 1. 6)及過氧化物酶(peroxidase ;EC 1. 11. 1. 7)酶促反應(yīng)速率比色 法。酒精氧化酶作為作用酶，功能為將乙醇酶解產(chǎn)生乙醛。過氧化氫酶作為循環(huán)酶過氧化
氫酶的酶促作用將乙醛再次變回乙醇，使乙醇不斷地被重復(fù)循環(huán)利用，因此連續(xù)不斷地產(chǎn)
生二個(gè)過氧化氫。過氧化物酶(peroxidase ;EC 1. 11. 1. 7)作為顯色酶，通過和過氧化氫 的作用，使無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在 400-700nm(根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長(zhǎng)處測(cè)定染料_吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)-含量高低的光吸收大小速度，得出乙醇濃度大小
測(cè)定結(jié)果。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，如下成分
關(guān)系的本發(fā)明乙醇診斷/
緩沖液
穩(wěn)定劑 過氧化物酶 酒精氧化酶 過氧化氫酶 還原型色原體組合




合.


















定試劑(盒)較為理想
100,1/L 500,1/L 30000U/L 10000U/L 12000U/L 0. 1-20,1/L
所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個(gè)組合中的任何一個(gè)配對(duì)組
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N， N-雙乙基-m-甲苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2 ，4-雙氯石碳酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4，6-仨溴-3-羥基 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3， 5-雙氯石碳酸磺酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3， 5-雙氯_2-羥基. 3-甲基-2-苯噻唑酮腙
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺






































3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2， 2， -AZIN0-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)
3- 甲基-2-苯噻唑酮腙
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙
3- 甲基-乙基-羥基苯胺 4_氨基抗砒 石碳酸 4_氨基抗砒
N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺 4_氨基抗砒 N， N-雙乙基-m-甲苯胺 4_氨基抗砒 2 ，4-雙氯石碳酸 4_氨基抗砒 2，4，6-仨溴-3-羥基 4_氨基抗砒 3， 5-雙氯石碳酸磺酸 4_氨基抗砒 3， 5-雙氯_2-羥基 4_氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽
4_氨基抗砒
仨溴羥基苯甲酸
4_氨基抗砒
雙甲基苯胺
4_氨基抗砒
N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4_氨基抗砒
2， 2， -AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4_氨基抗砒
4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸 4_氨基抗砒
3_甲基-乙基.
本發(fā)明的乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、酒精氧化酶、過氧化氫酶。
過氧化物酶、還原型色原體組合、酒精氧化酶、過氧化氫酶在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。 也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合、過氧化氫酶、過氧化物酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精氧化酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、酒精氧化酶、過氧化氫酶在試劑1、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液體試劑，直接使用。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的乙醇診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括 [OO"]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
酒精氧化酶 10000U/L
過氧化氫酶 12000U/L
過氧化物酶 30000U/L
4-氨基抗砒 2mmol/L
石碳酸 10mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37 。C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)505nm，測(cè)
試副波長(zhǎng)600nm，被測(cè)乙醇樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))，
檢測(cè)方法為比色速率法，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)505nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出乙醇的濃度大小。 實(shí)施例二0110] 本實(shí)施例的乙醇診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括 0111] 試劑l
0112]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液lOOmmol/L 0113] 穩(wěn)定劑 50mmol/L 0114] 2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 0. 2mmol/L 0115] 試劑2
0116]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液lOOmmol/L 0117]穩(wěn)定劑 500mmol/L 0118] 酒精氧化酶 10000U/L 0119] 過氧化氫酶 12000U/L 0120] 過氧化物酶 30000U/L 0121]4-氨基抗祉匕 0.6mmol/L
0122] 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 0123] 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)546nm，測(cè) 試副波長(zhǎng)600nm，被測(cè)乙醇樣品與試劑的體積比例為1/20，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))， 檢測(cè)方法為比色速率法，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。 —0124] 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè) 主波長(zhǎng)546nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出乙醇的濃度大小。
0125: 0126: 0127: 0128: 0129:
0130: 0131:
0132: 0133: 0134: 0135: 0136: 0137: 0138: 0139:
0140: 0141:
0142'
實(shí)施例三
本實(shí)施例的乙醇診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括
鹽酸緩沖液lOOmmol/L 50mmol/L 0. 6mmol/L
鹽酸緩沖液lOOmmol/L 500,1/L 12000U/L 30000U/L
試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-穩(wěn)定劑
3-甲基-2-苯噻唑酮腙 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-穩(wěn)定劑 過氧化氫酶 過氧化物酶
雙甲基苯胺 2mmol/L 試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 酒精氧化酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37 °C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，測(cè)試主波長(zhǎng)578nm，測(cè) 試副波長(zhǎng)660nm，被測(cè)乙醇樣品與試劑的體積比例為1/30，反應(yīng)方向?yàn)檎磻?yīng)(上升反應(yīng))， 檢測(cè)方法為比色速率法，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)578nm吸光度上升的速度，從而測(cè)算出乙醇的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原體組合均 能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。
總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈上 升曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)15mmol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確 度，其相對(duì)偏差不超過±3% ;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《1% ;試劑 的靈敏度可達(dá)O. 0500±0. 0250 AA/mmol/L ;試劑在2-8"下保存，活性可以穩(wěn)定一年；—— 本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種酶循環(huán)倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙醇濃度測(cè)定方法，其方法如下乙醇+氧 酒精氧化酶 乙醛+過氧化氫乙醛+水 過氧化氫酶 乙醇+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合 過氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測(cè)400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度，得出乙醇濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，主要成分包括還原型色原體組合 0. 1——20mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì) 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成雙劑 試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精氧 化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成。過氧化物酶、還原型色原體組合、 酒精氧化酶、過氧化氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化 氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精氧化酶組成。過 氧化物酶、還原型色原體組合酒精氧化酶、過氧化氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可 以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油 (Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一 種。
7 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于所述還原型色原體組 合可以是下列28個(gè)組合中的任一個(gè)配對(duì)組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙醌亞胺色原+水緩沖液 穩(wěn)定劑過氧化物酶 酒精氧化酶 過氧化氫酶石碳酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N， N-雙乙基-m-甲苯胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`2 ，4-雙氯石碳酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`2， 4， 6-仨溴-3-羥基-苯磺酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`3， 5-雙氯石碳酸磺酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`3，5-雙氯_2-羥基-苯磺酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽`3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸`3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺`3-甲基-2-苯噻唑酮腙`2， 2， -AZIN0-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)`3- 甲基-2-苯噻唑酮腙`4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3-甲基-乙基-羥基苯胺 4_氨基抗砒石碳酸`4_氨基抗砒N-乙基-N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺`4_氨基抗砒N， N-雙乙基-m-甲苯胺`4_氨基抗砒`2 ，4-雙氯石碳酸`4_氨基抗砒`2， 4， 6-仨溴-3-羥基-苯磺酸`4_氨基抗砒`3， 5-雙氯石碳酸磺酸4_氨基抗砒3，5_雙氯_2-羥基-苯磺酸 4_氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4_氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4_氨基抗砒雙甲基苯胺4_氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4_氨基抗砒2， 2， -AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4_氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4_氨基抗砒 3_甲基_乙基國(guó)
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乙醇濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、酒精氧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過一系列的酶促反應(yīng)，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長(zhǎng)處，測(cè)定染料含量的高低，進(jìn)而直接反映出乙醇濃度的大小。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK101762543SQ20081024426
公開日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司