專利名稱：乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)及乙醇濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乙醇濃度的方
法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
乙醇具成癮性，酒濫用和酒依賴是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)和公共衛(wèi)生
問(wèn)題之一。在西方國(guó)家，酒精相關(guān)性肝病已成為死亡的第六位原因。在我國(guó)，近20年來(lái)，隨
著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人均酒消耗量大幅度上升，酒依賴的患病率日趨增高。 生物樣品中乙醇的定量測(cè)定方法主要有化學(xué)比色法，酶終點(diǎn)比色法，均相酶免疫
測(cè)定法(EIA)，氣相色譜法(GC)和呼出氣乙醇分析。此外血清滲透量法可作乙醇半定量分析。 有多種化學(xué)比色法曾用于乙醇定量測(cè)定，微量擴(kuò)散法是其中較簡(jiǎn)單實(shí)用的一種，微量溢出的乙醇可使鉻酸還原成藍(lán)色的氧化鉻。 根據(jù)所用的試劑酶不同，乙醇的酶法測(cè)定分為二種乙醇氧化酶法和乙醇脫氫酶法，與乙醇氧化酶法相比，乙醇脫氫酶法的專一性高，不會(huì)與甲醇和丙酮起催化反應(yīng)。
—般認(rèn)為氣相色譜法可作為參考方法，尤其在準(zhǔn)確性和精密度要求高的法醫(yī)學(xué)乙醇測(cè)定中應(yīng)用最廣。GC法的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)在于特異、靈敏，且能同時(shí)分析多種揮發(fā)性醇類物質(zhì)，如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和異丙醇。 其他乙醇的測(cè)定方法還有均相酶免疫分析(Homogeneous enzymeimm皿oassay)、滲透量法、呼出氣乙醇分析法；用呼出氣乙醇分析儀檢測(cè)乙醇操作簡(jiǎn)單、快速，在交通執(zhí)法部門(mén)應(yīng)用較多。這類儀器中一種是根據(jù)紅外光吸收原理設(shè)計(jì)的，該法測(cè)定的乙醇濃度與酶法測(cè)得的血乙醇濃度相關(guān)性很好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶循環(huán)倍增法(EnzymaticRecycling
& Doubling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法
(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè)還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的
變化，得以測(cè)定乙醇濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的乙醇診斷/測(cè)定
試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行乙
醇濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。 本發(fā)明乙醇濃度測(cè)定方法如下 乙醇+氧酒精氧化酶乙醛+過(guò)氧化氡 乙醛+還原型輔酶酒精脫氡酶乙醇+輔酶 過(guò)氧化氫+還原型輔酶NADH過(guò)氧化物酶輔酶+2水 這種方法應(yīng)用酒精氧化酶(alcohol oxidase ;EC 1. 1. 3. 13)酶(偶)聯(lián)酒精脫氫酶(alcohol dehydrogenase ;EC 1. 1. 1. 1)、膽H過(guò)氧化物酶(NADH peroxidase ;EC1. 11. 1. 1 ;EC 1. 11. 1. 2)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法。酒精氧化酶作為作用酶，功能為將乙醇酶
解產(chǎn)生乙醛。酒精脫氫酶作為循環(huán)酶酒精脫氫酶再將乙醛再次變回乙醇，使乙醇不斷地被
重復(fù)循環(huán)利用。酒精脫氫酶與NADH過(guò)氧化物酶作為顯色酶，將乙醛、過(guò)氧化氫與還原型輔 酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為氧化型輔酶(在340nm處沒(méi)有吸收峰)，從而得以測(cè)定 還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過(guò)測(cè)量340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算 乙醇的濃度大小。 實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考慮，無(wú)論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)較為理想 緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L 酒精氧化酶 6000U/L 酒精脫氫酶 8000U/L NADH過(guò)氧化物酶10000U/L 本發(fā)明的乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶。 試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶。 還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試 劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l 緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精氧化酶。 還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶在試劑1、試劑2或試劑3 中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。 無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定乙醇濃度的方法，其還原型輔酶可以是 NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例一 本實(shí)施例的乙醇診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括[OO42]三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L 酒精氧化酶 6000U/L
酒精脫氫酶 8000U/L
NADH過(guò)氧化物酶 10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，
測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)乙醇樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向
為負(fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)
主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出乙醇的濃度大小。 實(shí)施例二
本實(shí)施例的乙醇診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括
試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷穩(wěn)定劑酒精氧化酶酒精脫氫酶NADH過(guò)氧化物酶
鹽酸緩沖液lOOmmol/L50mmol/L0. 25,1/L
鹽酸緩沖液lOOmmol/L500,1/L6000U/L8000U/L10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時(shí)間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)乙醇樣品與試劑1 、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出乙醇的濃度大小。
實(shí)施例三 本實(shí)施例的乙醇診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液lOOmmol/L
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
酒精脫氫酶
NADH過(guò)氧化物酶
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷
穩(wěn)定劑
酒精氧化酶
鹽酸緩沖液lOOmmol500,1/L6000U/L
鹽酸緩沖液lOOmmol
50mmol/L0. 25,1/L
500,1/L8000U/L10000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測(cè)定乙醇濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C ，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始
吸光度1. 8±0. 7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)乙醇樣品與試劑1、試劑2、試
劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，
檢測(cè)時(shí)間2分鐘左右。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，從而測(cè)算出乙醇的濃度大小。 申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測(cè)定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí)施例類同，不另一一例舉。 總之，實(shí)驗(yàn)證明采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0005 ;吸光度時(shí)間反應(yīng)曲線應(yīng)呈下降曲線直至終點(diǎn)；試劑可測(cè)有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)20mmol/L ;試劑測(cè)試的不準(zhǔn)確度，其相對(duì)偏差不超過(guò)±3% ;試劑測(cè)試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《1% ;試劑的靈敏度可達(dá)O. 030±0. 015 AA/mmol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長(zhǎng)，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種利用酶循環(huán)倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙醇濃度測(cè)定方法，其方法如下乙醇+氧 酒精氧化酶 乙醛+過(guò)氧化氫乙醛+還原型輔酶 酒精脫氫酶 乙醇+輔酶過(guò)氧化氫+還原型輔酶 NADH過(guò)氧化物酶 輔酶+2水將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的程度，測(cè)算出乙醇的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，主要成分包括緩沖液 20-500mmol/L穩(wěn)定劑 1-4000mmol/L還原型輔酶 0. 1-0. 35mmol/L酒精氧化酶 1000——80000U/L酒精脫氫酶 1000——80000U/LNADH過(guò)氧化物酶1000——80000U/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會(huì)反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定齊U、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶組成。還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定齊U、還原型輔酶組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精氧化酶組成。還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫酸銨(A,niaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)倍增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙醇診斷/測(cè)定試劑(盒)，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定乙醇濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、酒精氧化酶、酒精脫氫酶、NADH過(guò)氧化物酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的程度，從而測(cè)算出乙醇的濃度大小。
文檔編號(hào)C12Q1/26GK101762541SQ20081024426
公開(kāi)日2010年6月30日 申請(qǐng)日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司