專利名稱：乙醇診斷/測定試劑盒及乙醇濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種乙醇診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定乙 醇濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
技術(shù)背景乙醇具成癮性，酒濫用和酒依賴是當(dāng)今世界范圍內(nèi)最嚴重的社會經(jīng) 濟和公共衛(wèi)生問題之一。在西方國家，酒精相關(guān)性肝病已成為死亡的第六位原因。在我國，近20年來，隨著社會經(jīng)濟發(fā)展，人均酒消耗量 大幅度上升，酒依賴的患病率日趨增高。生物樣品中乙醇的定量測定方法主要有化學(xué)比色法，酶終點比色 法，均相酶免疫測定法(EIA)，氣相色譜法(GC)和呼出氣乙醇分析。 此外血清滲透量法可作乙醇半定量分析。有多種化學(xué)比色法曾用于乙醇定量測定，微量擴散法是其中較簡單 實用的一種，微量溢出的乙醇可使鉻酸還原成藍色的氧化鉻。根據(jù)所用的試劑酶不同，乙醇的酶法測定分為二種乙醇氧化酶法 和乙醇脫氫酶法，與乙醇氧化酶法相比，乙醇脫氫酶法的專一性高， 不會與甲醇和丙酮起催化反應(yīng)。一般認為氣相色譜法可作為參考方法，尤其在準確性和精密度要求 高的法醫(yī)學(xué)乙醇測定中應(yīng)用最廣。GC法的獨特優(yōu)點在于特異、靈敏， 且能同時分析多種揮發(fā)性醇類物質(zhì)，如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和異丙醇。其他乙醇的測定方法還有均相酶免疫分析(Homogeneous enzyme immunoassay^滲透量法、呼出氣乙醇分析法；用呼出氣乙醇分析儀 檢測乙醇操作簡單、快速，在交通執(zhí)法部門應(yīng)用較多。這類儀器中一 種是根據(jù)紅外光吸收原理設(shè)計的，該法測定的乙醇濃度與酶法測得的 血乙醇濃度相關(guān)性很好。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量通過酶 聯(lián)反應(yīng)生成吲嗒胺色原(Indamine dye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye)所導(dǎo)致在400—700nm波長處吸光度的上升，得以測定乙醇濃度 的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的乙醇診斷/測定試劑 盒，采用該試劑不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上 進行乙醇濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、準確度高，因而可 以得到切實的推廣應(yīng)用。本發(fā)明乙醇濃度測定方法原理如下乙醇+氧酒精脫氫酶乙醛+過氧化氫 過氧化氫+還原型色原體組合過氧化物酶噴嗒胺色原或醌亞胺色原+水這個方法應(yīng)用酒精脫氫酶(Alcohol dehydrogenase ; EC 1.1.3.13) (偶)聯(lián)過氧化物酶(peroxidase ; EC 1.1L1.7)酶促反應(yīng)終點/速率比色 法。酒精脫氫酶酶解乙醇反應(yīng)產(chǎn)生過氧化氫，再通過(偶)聯(lián)合過氧化物酶的作用，最后生成的過氧化氫在過氧化物酶的作用下，將無色 的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400—700nrn (根據(jù)還原型色原體組合的不同而定)波長處，測 定染料一吲嗒胺色原(Indaminedye)或醌亞胺色原(Quioneimine dye) 一含量高低的光吸收大小；通過測量400—700nm (根據(jù)還原型色原體 組合的不同而定)處吸光度上升的程度/速度，得出乙醇濃度大小測定 結(jié)果。實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，如下成分關(guān)系的本發(fā)明乙醇診斷/測定試劑盒較為理想 緩沖液 10Ommol/L穩(wěn)定劑還原型色原體組合過氧化物酶酒精脫氫酶500 mmol/L0.1-20 mmol/L30000 U/L 10000U/L所述還原型色原體組合(Chromogen)可以是下列28個組合中的任何一個配對組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基^N. (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N，N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2，4-雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙 仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒N-乙基""N- (3-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N，N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2,4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3，5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2,2，-AZINO-雙G-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸4-氨基抗砒 3-甲基-乙基-羥基苯胺本發(fā)明的乙醇診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合。試 劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、還原型色原體組合、酒精脫氫過氧化物酶、還原型色原體組合、酒精脫氫酶在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化物酶、酒精脫氫酶。 過氧化物酶、還原型色原體組合、酒精脫氫酶在試劑l、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一本實施例的乙醇診斷/測定試劑為單試劑，包括-三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L過氧化物酶 30000 U/L酒精脫氫酶 10000 U/L4-氨基抗砒 2 mmol/L石碳酸 10mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑; 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37-C，反應(yīng)時間IO分鐘，測 試主波長505nm，測試副波長600nm，被測乙醇樣品與試劑的體積比 例為1/25，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點/速率法， 延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長505nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出乙 醇的濃度大小。 實施例二本實施例的乙醇診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸 0.2 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50Ommol/L 過氧化物酶 30000 U/L10000U/L4-氨基抗砒 0.6 mmol/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，測試主波長546nm，測試副波長600nm，被測乙醇樣品與試劑的體積比例為1/20，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點/速率法，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測主波長546nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出乙醇的濃度大小。實施例三本實施例的乙醇診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑l三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 3-甲基-2-苯噻唑酮腙 0.6 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 雙甲基苯胺100 mmol/L 2 mmol/L試劑3三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑過氧化物酶酒精脫氫酶100 mmol/L 500 mmol/L30000 U/L10000 U/L13試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時間10分鐘，測試 主波長578nm，測試副波長660nm，被測乙醇樣品與試劑的體積比例 為1/30，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，檢測方法為終點/速率法， 延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測主波長578nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出乙 醇的濃度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉?？傊瑢嶒炞C明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過可見光分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，不受內(nèi)外源 物質(zhì)量污染。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙醇濃度測定方法，其方法原理如下乙醇+氧 酒精脫氫酶 乙醛+過氧化氫過氧化氫+還原型色原體組合 過氧化物酶 吲嗒胺色原或醌亞胺色原+水將最終反應(yīng)物置于可見光分析儀下，檢測400-700nm處直接反映吲嗒胺色原或醌亞胺色原含量高低的光吸收速度/程度，得出乙醇濃度大小測定結(jié)果。
2. —種乙醇診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 穩(wěn)定劑還原型色原體組合 過氧化物酶 500——80000 U/L酒精脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合 組成單劑試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合20-500 mmol/L1-4000 mmol/L0.1-20mmol/L組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組 成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶、過氧化物酶、還原 型色原體組合組成。過氧化物酶、還原型色原體組合、酒精脫氫酶、 在試劑1或試劑2中的位置可以不限。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合 組成多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組 成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型色原體組合組成；試劑3， 由緩沖液、穩(wěn)定劑、酒精脫氫酶、過氧化物酶組成。過氧化物酶、 還原型色原體組合酒精脫氫酶、在試劑l、試劑2或試劑3中的位 置可以不限。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括 穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1。/。-100。/。體積比。所述穩(wěn)定劑為硫 酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑盒，其特征在于所述還原型色原體組合可以是下列28個組合中的任一個配對組合3-甲基-2-苯噻唑酮腙 石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙1^-乙基>~1^ (3-硫丙基)-m-噻啶胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙 N,N-雙乙基-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2.4- 雙氯石碳酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 2,4,6-仨溴-3-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3.5- 雙氯石碳酸磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 3，5-雙氯-2-羥基-苯磺酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽3-甲基-2-苯噻唑酮腙仨溴羥基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙 雙甲基苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺3-甲基-2-苯噻唑酮腙2，2，-AZINO-雙(3-乙基苯噻唑-6-磺酸)3- 甲基-2-苯噻唑酮腙4- 羥基-3-甲氧基苯甲酸3-甲基-2-苯噻唑酮腙3- 甲基-乙基-羥基苯胺4- 氨基抗砒 石碳酸4-氨基抗砒!^-乙基^~^- G-硫丙基)-m-噻啶胺4-氨基抗砒 N,N-雙乙基-m-甲苯胺4-氨基抗砒 2，4-雙氯石碳酸4-氨基抗砒2，4，6-仨溴-3-羥基-苯磺酸4-氨基抗砒 3,5-雙氯石碳酸磺酸4-氨基抗砒3,5-雙氯-2-羥基-苯磺酸 4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺鈉鹽4-氨基抗砒仨溴羥基苯甲酸4-氨基抗砒 雙甲基苯胺4-氨基抗砒N-乙基-N- (2-羥基-3-硫丙基)-m-甲苯胺 4-氨基抗砒2，2，-AZINO-雙G-乙基苯噻唑-6-磺酸) 4-氨基抗砒4-羥基-3-甲氧基苯甲酸 4-氨基抗砒3-甲基-乙基-羥基苯胺。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙醇診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定乙醇濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、酒精脫氫酶、過氧化物酶、還原型色原體組合及穩(wěn)定劑；通過一系列的酶促反應(yīng)，最終將無色的還原型色原體組合氧化成有色的染料，從而可以通過可見光分析儀器，在400-700nm波長處，測定染料含量的高低，進而直接反映出乙醇濃度的大小。
文檔編號C12Q1/00GK101324629SQ200710023208
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司