專利名稱：四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中的谷氨酰胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品加工領(lǐng)域，涉及一種四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中的谷氨酰胺的方法。
背景技術(shù)：
L-谷氨酰胺是L-谷氨酸的γ-羧基酰胺化的一種氨基酸，化學(xué)名2，5-二氨基-5-氧代戊酸，作為20種構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本氨基酸之一，谷氨酰胺是人體血液中最豐富的氨基酸，亦是骨骼肌細(xì)胞內(nèi)最豐富的氨基酸，約占全身游離氨基酸的一半以上，在生物體代謝中起著舉足輕重的作用，是一種“條件性必需氨基酸”。自1952年用X光衍射確定了其分子結(jié)構(gòu)后，對它的應(yīng)用就日益引起人們的關(guān)注，被認(rèn)為是目前所知道的最重要的氨基酸之一，也是一種極有發(fā)展前途的新藥。目前谷氨酰胺生產(chǎn)主要使用發(fā)酵法，發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酰胺得以工業(yè)化生產(chǎn)還依賴于谷氨酰胺分離提取技術(shù)。目前國內(nèi)外谷氨酰胺的分離提取幾乎都采用以離子交換樹脂為填料的柱層析法，雖然可以進(jìn)行大規(guī)模制備，但是分離的效率低，流動(dòng)相浪費(fèi)嚴(yán)重，固定相利用效率低，產(chǎn)量低，成本高。
70年代以來，美國UOP公司開發(fā)了模擬移動(dòng)床(SMB)原理的色譜技術(shù)，該技術(shù)使吸附劑顆粒裝填后不在移動(dòng)，由原料進(jìn)出口和產(chǎn)品液流進(jìn)出口不斷切換的方法，形成吸附劑顆粒和液流相對逆流運(yùn)動(dòng)來模擬固定相的移動(dòng)。20世紀(jì)90年代模擬移動(dòng)床色譜應(yīng)用范圍也不斷擴(kuò)大，遍及石油、精細(xì)化工、生物發(fā)酵、醫(yī)藥、食品等很多生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其在同系化合物、手性異構(gòu)體藥物、糖類、有機(jī)酸和氨基酸等混合物的分離中顯示出其獨(dú)特性能。美國的一些專利文獻(xiàn)報(bào)道了模擬移動(dòng)床色譜分離手性藥物如光學(xué)異構(gòu)體、外消旋物質(zhì)和對映體以及石油化學(xué)品的分離。日本Daicel化學(xué)工業(yè)公司也開發(fā)了使用模擬移動(dòng)床色譜分離手性異構(gòu)體的方法。但是，對于使用模擬移動(dòng)床色譜分離提純谷氨酰胺的方法仍未見公開報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中的谷氨酰胺的方法，工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，提高產(chǎn)品的純度、收率和產(chǎn)量。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案包括以下步驟a、谷氨酰胺酵母發(fā)酵液裝入PES超濾膜的超濾設(shè)備中，在不超過0.25MPa的氮?dú)庀逻M(jìn)行超濾除去酵母細(xì)胞菌體、固形物及蛋白質(zhì)，降低料液的粘度；b、將超濾過的發(fā)酵液通過活性炭脫色；c、將脫色后的發(fā)酵液通過減壓濃縮、結(jié)晶脫鹽；d、將脫鹽后的粗晶配成濃度為10-80g/l的進(jìn)樣液裝入裝有陽離子交換樹脂的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)SMB中進(jìn)行吸附，由pH10-14的去離子水進(jìn)行洗脫，控制各功能區(qū)樣品的遷移速度，將谷氨酰胺和谷氨酸分別從提取液和提余液出口收集；e、模擬移動(dòng)床的萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無水，由甲醇洗脫后在真空干燥箱烘干得成品。
本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由多根相同的陽離子交換樹脂柱串聯(lián)，即通過離子交換過程中的強(qiáng)弱吸附組分的吸附、精制、解吸、樹脂再生不同功能區(qū)之間的按順序切換，根據(jù)強(qiáng)弱吸附組分在分離介質(zhì)上遷移速度不同的原理進(jìn)行分離，通過組合閥門的切換來改變進(jìn)料口、提余液出口、流動(dòng)相入口、提取液出口的位置得到目標(biāo)產(chǎn)物；其中，切換時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)是通過調(diào)整各功能區(qū)洗脫液的流速和離子交換柱的根數(shù)來控制目標(biāo)物的遷移速度；各功能區(qū)離子交換柱的數(shù)量根據(jù)所需要洗脫的目標(biāo)物在此切換時(shí)間被洗脫的遷移長度決定，切換時(shí)按功能區(qū)進(jìn)行切換。
本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床色譜(SMBC)分離系統(tǒng)由洗脫泵、進(jìn)樣泵、萃取泵、色譜柱、電磁閥、信號采集器、系統(tǒng)控制器及計(jì)算機(jī)連接組成，洗脫泵流量200-800ml/min，壓力1-10Mpa；進(jìn)樣泵流量10-50ml/min，壓力1-10Mpa；萃取泵流量100-500ml/min，壓力1-10Mpa；提余泵流量100-500ml/min，壓力1-10Mpa；閥切換時(shí)間為18-24min；整個(gè)模擬移動(dòng)床的溫度為25-35℃，進(jìn)料液、洗脫液溫度25-35℃，二者溫度保持一致。
本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由4-16根離子交換柱串聯(lián)，模擬移動(dòng)床系統(tǒng)按照四個(gè)口的位置分四區(qū)，每區(qū)由1-4根相同的離子交換柱，一區(qū)位于洗脫液入口處與提取液出口處之間，在此區(qū)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺發(fā)酵液粗提取物中強(qiáng)吸附組分的解吸；二區(qū)位于提取液出口處與進(jìn)料口之間，其作用相當(dāng)于精餾塔，使谷氨酰胺粗提取物中強(qiáng)吸附組分反復(fù)吸附、解吸而濃縮，從提取液出口得到谷氨酸；三區(qū)位于進(jìn)料口與提余液出口之間，其作用是盡可能地將谷氨酰胺和谷氨酸吸附在固定相上，從提余液出口得到含谷氨酰胺；四區(qū)位于洗脫液入口與提余液出口之間，一方面，液相中的谷氨酰胺和谷氨酸被固定相吸附，其洗脫液與新鮮的洗脫液一起進(jìn)入一區(qū)，從而達(dá)到循環(huán)利用的目的；另一方面將三區(qū)與一區(qū)隔開，以免提余液中的谷氨酰胺和谷氨酸進(jìn)入一區(qū)而污染提取液，起到一定的緩沖作用。
本發(fā)明的方法采用模擬移動(dòng)床系統(tǒng)分離純化發(fā)酵液中的谷氨酰胺，連續(xù)化工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)品純度好、效率高、產(chǎn)量大、生產(chǎn)成本低。
具體實(shí)施例方式
實(shí)例1選用谷氨酰胺發(fā)酵液，在江蘇漢邦科技有限公司的模擬移動(dòng)床上實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺的純化a、取谷氨酰胺酵母發(fā)酵液裝入PES超濾膜的超濾設(shè)備中，在不超過0.25MPa的氮?dú)庀逻M(jìn)行超濾除去酵母細(xì)胞菌體、固形物及蛋白質(zhì)，降低料液的粘度；b、將超濾過的發(fā)酵液通過活性炭脫色；c、將脫色后的發(fā)酵液通過減壓濃縮、結(jié)晶脫鹽；d、將脫鹽后的粗晶配成濃度為10g/l的進(jìn)樣液進(jìn)入模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由pH10的去離子水進(jìn)行洗脫；e、將模擬移動(dòng)床的萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無水，由甲醇洗脫后在真空干燥箱烘干得成品。
本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床色譜(SMBC)分離系統(tǒng)由洗脫泵、進(jìn)樣泵、萃取泵、色譜柱、電磁閥、信號采集器、系統(tǒng)控制器及計(jì)算機(jī)連接組成，洗脫液流速為200ml/min，萃取液流速為100ml/min，提余液流速為100ml/min閥切換時(shí)間為18min；進(jìn)料液流速為10ml/min；各泵工作壓力1Mpa；整個(gè)模擬移動(dòng)床的溫度為25℃，進(jìn)料液、洗脫液溫度25℃。
本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)SMB的由4根相同的離子交換柱串聯(lián)，按照四個(gè)口的位置分4區(qū)一區(qū)位于洗脫液入口處與提取液出口處之間，在此區(qū)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺發(fā)酵液粗提取物中強(qiáng)吸附組分的解吸；二區(qū)位于提取液出口處與進(jìn)料口之間，其作用相當(dāng)于精餾塔，使谷氨酰胺粗提取物中強(qiáng)吸附組分反復(fù)吸附、解吸而濃縮，從提取液出口得到谷氨酸；三區(qū)位于進(jìn)料口與提余液出口之間，其作用是盡可能地將谷氨酰胺和谷氨酸吸附在固定相上，從提余液出口得到含谷氨酰胺；四區(qū)位于洗脫液入口與提余液出口之間，一方面，液相中的谷氨酰胺和谷氨酸被固定相吸附，其洗脫液與新鮮的洗脫液一起進(jìn)入一區(qū)，從而達(dá)到循環(huán)利用的目的；另一方面將三區(qū)與一區(qū)隔開，以免提余液中的谷氨酰胺和谷氨酸進(jìn)入一區(qū)而污染提取液，起到一定的緩沖作用。
成品柱前衍生反相高效液相色譜(HPLC)法檢測PerkinElmer Series 200高效液相色譜系統(tǒng)；紫外檢測器，檢測波長254nm；Hedera ODS-24.6mm×250mm分析柱，填料粒徑5μm；1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液作為衍生劑，取樣品9.86mg置10ml棕色量瓶中，加0.5mol/L pH＝9.0NaHCO3溶液1ml，加1％2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1ml，置60攝氏度水浴中暗處加熱1小時(shí)后取出，放冷，加pH＝7.0磷酸鹽緩沖液至刻度；洗脫液由A、B雙組分組成梯度洗脫，A為CH3CN∶H2O＝1∶1，B為0.03mol/l NaAC-HAC，流速1ml/min，進(jìn)樣濃度1mg/ml，進(jìn)樣量20μl，檢測溫度25℃；依以下表格中參數(shù)使用外標(biāo)法測定成品谷氨酰胺含量98％。

實(shí)例2選用谷氨酰胺發(fā)酵液，在江蘇漢邦科技有限公司的模擬移動(dòng)床上實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺的純化a、取谷氨酰胺酵母發(fā)酵液裝入PES超濾膜的超濾設(shè)備中，在不超過0.25MPa的氮?dú)庀逻M(jìn)行超濾除去酵母細(xì)胞菌體、固形物及蛋白質(zhì)，降低料液的粘度；b、將超濾過的發(fā)酵液通過活性炭脫色；c、將脫色后的發(fā)酵液通過減壓濃縮、結(jié)晶脫鹽；d、將脫鹽后的粗晶配成濃度為45g/l的進(jìn)樣液進(jìn)入模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由pH12的去離子水進(jìn)行洗脫；e、將模擬移動(dòng)床的萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無不，由甲醇洗脫后在真空干燥箱烘干得成品。
本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床色譜(SMBC)分離系統(tǒng)由洗脫泵、進(jìn)樣泵、萃取泵、色譜柱、電磁閥、信號采集器、系統(tǒng)控制器及計(jì)算機(jī)連接組成，洗脫液流速為500ml/min，壓力5Mpa；進(jìn)樣液流速為30ml/min，壓力5Mpa，萃取液流速為300ml/min，壓力5Mpa；提余液流速為300ml/min；閥切換時(shí)間為21min工作溫度30℃，進(jìn)料液、洗脫液溫度30℃。
本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)SMB由12根相同的離子交換柱串聯(lián)，按照四個(gè)口的位置分4區(qū)，每區(qū)由3根交換柱，一區(qū)位于洗脫液入口處與提取液出口處之間，在此區(qū)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺發(fā)酵液粗提取物中強(qiáng)吸附組分的解吸；二區(qū)位于提取液出口處與進(jìn)料口之間，其作用相當(dāng)于精餾塔，使谷氨酰胺粗提取物中強(qiáng)吸附組分反復(fù)吸附、解吸而濃縮，從提取液出口得到谷氨酸；三區(qū)位于進(jìn)料口與提余液出口之間，其作用是盡可能地將谷氨酰胺和谷氨酸吸附在固定相上，從提余液出口得到含谷氨酰胺；四區(qū)位于洗脫液入口與提余液出口之間，一方面，液相中的谷氨酰胺和谷氨酸被固定相吸附，其洗脫液與新鮮的洗脫液一起進(jìn)入一區(qū)，從而達(dá)到循環(huán)利用的目的；另一方面將三區(qū)與一區(qū)隔開，以免提余液中的谷氨酰胺和谷氨酸進(jìn)入一區(qū)而污染提取液，起到一定的緩沖作用。
成品柱前衍生反相高效液相色譜(HPLC)法檢測PerkinElmer Series 200高效液相色譜系統(tǒng)；紫外檢測器，檢測波長254nm；Hedera ODS-24.6mm×250mm分析柱，填料粒徑5μm；1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液作為衍生劑，取樣品9.86mg置10ml棕色量瓶中，加0.5mol/L pH＝9.0NaHCO3溶液1ml，加1％2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1ml，置60攝氏度水浴中暗處加熱1小時(shí)后取出，放冷，加pH＝7.0磷酸鹽緩沖液至刻度；洗脫液由A、B雙組分組成梯度洗脫，A為CH3CN∶H2O＝1∶1，B為0.03mol/l NaAC-HAC，流速1ml/min，進(jìn)樣濃度1mg/ml，進(jìn)樣量20μl，檢測溫度25℃；依以下表格中參數(shù)使用外標(biāo)法測定成品谷氨酰胺含量98.68％。

實(shí)例3選用谷氨酰胺發(fā)酵液，在江蘇漢邦科技有限公司的模擬移動(dòng)床上實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺的純化a、取谷氨酰胺酵母發(fā)酵液裝入PES超濾膜的超濾設(shè)備中，在不超過0.25MPa的氮?dú)庀逻M(jìn)行超濾除去酵母細(xì)胞菌體、固形物及蛋白質(zhì)，降低料液的粘度b、將超濾過的發(fā)酵液通過活性炭脫色；c、將脫色后的發(fā)酵液通過減壓濃縮、結(jié)晶脫鹽；d、將脫鹽后的粗晶配成濃度為80g/l的進(jìn)樣液進(jìn)入模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由pH14的去離子水進(jìn)行洗脫；e、將模擬移動(dòng)床的萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無不，由甲醇洗脫后在真空干燥箱烘干得成品。
本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床色譜(SMBC)分離系統(tǒng)由洗脫泵、進(jìn)樣泵、萃取泵、色譜柱、電磁閥、信號采集器、系統(tǒng)控制器及計(jì)算機(jī)連接組成，洗脫液流速為800ml/min，壓力10Mpa；進(jìn)樣液流速為50ml/min，壓力10Mpa，萃取液流速為500ml/min，壓力10Mpa；提余液流速500ml/min；閥切換時(shí)間為24min；工作溫度35℃，進(jìn)料液、洗脫液溫度35℃。
本發(fā)明方法中的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)SMB由16根相同的離子交換柱串聯(lián)，按照四個(gè)口的位置分4區(qū)，每區(qū)4根交換柱，一區(qū)位于洗脫液入口處與提取液出口處之間，在此區(qū)內(nèi)，實(shí)現(xiàn)谷氨酰胺發(fā)酵液粗提取物中強(qiáng)吸附組分的解吸；二區(qū)位于提取液出口處與進(jìn)料口之間，其作用相當(dāng)于精餾塔，使谷氨酰胺粗提取物中強(qiáng)吸附組分反復(fù)吸附、解吸而濃縮，從提取液出口得到谷氨酸；三區(qū)位于進(jìn)料口與提余液出口之間，其作用是盡可能地將谷氨酰胺和谷氨酸吸附在固定相上，從提余液出口得到含谷氨酰胺；四區(qū)位于洗脫液入口與提余液出口之間，一方面，液相中的谷氨酰胺和谷氨酸被固定相吸附，其洗脫液與新鮮的洗脫液一起進(jìn)入一區(qū)，從而達(dá)到循環(huán)利用的目的；另一方面將三區(qū)與一區(qū)隔開，以免提余液中的谷氨酰胺和谷氨酸進(jìn)入一區(qū)而污染提取液，起到一定的緩沖作用。
成品柱前衍生反相高效液相色譜(HPLC)法檢測PerkinElmer Series 200高效液相色譜系統(tǒng)；紫外檢測器，檢測波長254nm；Hedera ODS-24.6mm×250mm分析柱，填料粒徑5μm；1％2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液作為衍生劑，取樣品9.86mg置10ml棕色量瓶中，加0.5mol/L pH＝9.0NaHCO3溶液1ml，加1％2，4-二硝基氟苯乙腈溶液1ml，置60攝氏度水浴中暗處加熱1小時(shí)后取出，放冷，加pH＝7.0磷酸鹽緩沖液至刻度；流動(dòng)相由A、B雙組分組成梯度洗脫，A為CH3CN∶H2O＝1∶1，B為0.03mol/l NaAC-HAC，流速1ml/min，進(jìn)樣濃度1mg/ml，進(jìn)樣量20μl，檢測溫度25℃；依以下表格參數(shù)方式使用外標(biāo)法測定成品谷氨酰胺含量99.10％。

權(quán)利要求
1.四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中谷氨酰胺的方法，其特征在于a、谷氨酰胺酵母發(fā)酵液裝入PES超濾膜的超濾設(shè)備中，在不超過0.25MPa的氮?dú)庀逻M(jìn)行超濾除去酵母細(xì)胞菌體、固形物及蛋白質(zhì)，降低料液的粘度；b、將超濾過的發(fā)酵液通過活性炭脫色；c、將脫色后的發(fā)酵液通過減壓濃縮、結(jié)晶脫鹽； d、將脫鹽后的粗晶配成濃度為10-80g/l的進(jìn)樣液裝入裝有陽離子交換樹脂的模擬移動(dòng)床系統(tǒng)SMB中由pH 10-14的去離子水進(jìn)行洗脫，控制各功能區(qū)樣品的遷移速度，將谷氨酰胺和谷氨酸分別從提取液和提余液出口收集；e、模擬移動(dòng)床的萃取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無水，由甲醇洗脫后在真空干燥箱烘干得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中谷氨酰胺的方法，其特征在于模擬移動(dòng)床色譜(SMBC)分離系統(tǒng)由洗脫泵、進(jìn)樣泵、萃取泵、色譜柱、電磁閥、信號采集器、系統(tǒng)控制器及計(jì)算機(jī)連接組成，洗脫泵流量200-800ml/min，壓力1-10Mpa；進(jìn)樣泵流量10-50ml/min，壓力1-10Mpa；萃取泵流量100-500ml/min，壓力1-10Mpa；提余泵流量100-500ml/min，壓力1-10MPa；閥切換時(shí)間為18-24min；整個(gè)模擬移動(dòng)動(dòng)的溫度25-35℃，進(jìn)料液、洗脫液溫度25-35℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中谷氨酰胺的方法，其特征在于模擬移動(dòng)床系統(tǒng)由4-16根相同的離子交換柱串聯(lián)，模擬移動(dòng)床系統(tǒng)按照四個(gè)口的位置分四區(qū)，每區(qū)1-4根交換柱，一區(qū)位于洗脫液入口處與提取液出口處之間；二區(qū)位于提取液出口處與進(jìn)料口之間；三區(qū)位于進(jìn)料口與提余液出口之間；四區(qū)位于洗脫液入口與提余液出口之間。
全文摘要
本發(fā)明公開了四區(qū)模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中谷氨酰胺的方法，谷氨酰胺發(fā)酵液裝入PES超濾膜的超濾設(shè)備中，在不超過0.25MPa的氮?dú)庀逻M(jìn)行超濾除去酵母細(xì)胞菌體、固形物及蛋白質(zhì)；將超濾過的發(fā)酵液通過活性炭脫色；將脫色后的發(fā)酵液通過減壓濃縮、結(jié)晶脫鹽；將脫鹽后的粗晶配成濃度為10－80g/l的進(jìn)樣液裝入模擬移動(dòng)床，由pH 10－14的去離子水進(jìn)行洗脫，將谷氨酰胺和谷氨酸分別從提取液和提余液出口收集；萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至無水，由甲醇洗脫后在真空干燥箱烘干得成品。本發(fā)明的方法采用模擬移動(dòng)床分離純化發(fā)酵液中谷氨酰胺，連續(xù)化工業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)品純度好、效率高、產(chǎn)量大、生產(chǎn)成本低。
文檔編號C12P13/14GK101085748SQ200710022900
公開日2007年12月12日 申請日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日
發(fā)明者張大兵, 王亞輝, 孟強(qiáng), 王艷 申請人:江蘇漢邦科技有限公司