一種從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法，具體為：1）海洋微生物發(fā)酵液樣品的制備：接種真菌，發(fā)酵，提取代謝產(chǎn)物，濃縮，洗脫；2）以創(chuàng)傷弧菌全基因組為模板，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增后，克隆入載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，目的蛋白經(jīng)洗脫，透析，超濾，除鹽得到His-DXR；3）將菌懸液、刃天青溶液和1）所得進(jìn)行反應(yīng)后測定其熒光值并通過公式計(jì)數(shù)出抑制率，篩選出抑制率在80%以上的餾分；4）將步驟3）篩選的餾分與步驟2）所得His-DXR進(jìn)行反應(yīng)，計(jì)算抑制率；篩選出抑制率≥50%的餾分。本方法簡單準(zhǔn)確，為發(fā)現(xiàn)以Dxr為靶點(diǎn)的新型抗菌藥物或先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。
【專利說明】一種從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自1929年弗萊明從真菌中發(fā)現(xiàn)了青霉素以來，微生物活性代謝產(chǎn)物成為了藥物發(fā)現(xiàn)的重要資源。青霉素的應(yīng)用標(biāo)志著抗生素時(shí)代的開始，越來越多的陸源微生物代謝產(chǎn)物被開發(fā)成天然藥物。在過去的70多年里，已經(jīng)從微生物中發(fā)現(xiàn)了約30000-50000種天然產(chǎn)物，其中10000多種有生物活性，8000多種是抗菌和抗腫瘤劑，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)至今已有100多種由微生物生產(chǎn)并應(yīng)用于臨床的農(nóng)藥、抗腫瘤劑和抗生素，每年全球抗生素產(chǎn)量超過10萬噸，產(chǎn)值超過50多億(五株海洋真菌次生代謝產(chǎn)物及其生物活性研究，2010)。然而，在對(duì)陸源微生物的長期研究開發(fā)過程中，從陸生微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物或抗生素的難度越來越大，而抗藥性問題的日益嚴(yán)重使新藥的開發(fā)面臨著嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。
[0003]海洋覆蓋地球表面積的71%，是生命的起源地。動(dòng)物界中28個(gè)主要?jiǎng)游镩T有26個(gè)是生活在水中，其中還有8個(gè)門 為完全水生，估計(jì)海洋動(dòng)物約有50多萬種。海洋生物中海洋微生物由于其生活在寡營養(yǎng)、弱堿性的含鹽海洋環(huán)境中，為了維持其生命活動(dòng)，形成了獨(dú)特的耐饑、耐堿和耐鹽等生理特征和代謝機(jī)制，在生長和代謝過程中產(chǎn)生了有別于陸地微生物的大量結(jié)構(gòu)新穎、活性強(qiáng)的次生代謝產(chǎn)物。另外，由于海洋微生物具有生長周期短、不受季節(jié)及自然生物量等方面的限制、可人工大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢，理所當(dāng)然的受到越來越多的重視。就尋找新的化合物和抗生素而言，目前僅有1%左右的海洋微生物被分離鑒定，具有產(chǎn)生新型生物活性物質(zhì)的巨大潛力，人們對(duì)于從中尋找新的特效藥物寄予了極大的希望。
[0004]近年來，隨著分子生物化、學(xué)生物學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，對(duì)萜類化合物的研究日趨深入，它的生物合成途徑也逐漸清晰，已得到克隆和分析了許多關(guān)鍵酶基因。其中包括萜類生物合成途徑中的相關(guān)酶之一:脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶(DXR)，DXR催化DXP生成MEP，是DXP途徑的限速酶。DXR是潛在的抗瘧藥物、抗生素和除草劑的靶標(biāo)位點(diǎn)，而且是一個(gè)更有效率的祀標(biāo)位點(diǎn)。Kuntz等(2005)報(bào)道，膦胺霉素(fosmidomycin)是傳統(tǒng)的 DXR 抑制劑，在 2 個(gè)新型 DXR 抑制劑 4_ (hydroxyamino) -4-oxobutyIphosphonicacid 和 4-[hydroxy (methyl) amino]-4-oxobutylphosphonicacid 中，其中后者表現(xiàn)出很高的抑制DXR的活性。在細(xì)菌、藻類、植物和原生動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)存在DXR，但目前在人體中還未找到，因此用DXR這一靶標(biāo)位點(diǎn)研制抗菌和抗瘧藥物更加引起了人們的興趣。在研究擬南芥的DXR基因中，Rohdich等(2006)將去除N端轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列后的重組體在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達(dá)，通過親和色譜法得到的純化蛋白可用DXP催化形成MEP,催化速率為5.6molmin-lmg-l (蛋白)，此反應(yīng)需NADPH參與，需要二價(jià)金屬離子Mn2+和Mg2+，最適PH值為8.0, NADPH雖然可用NADH替代，但替代后的反應(yīng)速率降至原來的14%。
[0005]20世紀(jì)90年代中期，運(yùn)用分子生物學(xué)和比較基因組學(xué)方法證實(shí)，在某些細(xì)菌、原蟲和植物質(zhì)體存在一條MEP(2-甲基-赤蘚糖醇磷酸)途徑用于合成類異戊二烯的前體物質(zhì)異戊酰焦磷酸(IPP)或二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)。該途徑完全不同于哺乳動(dòng)物和植物胞漿中的甲羥戊酸(MVA)途徑。由于該途徑合成的類異戊二烯及其衍生物在生物代謝和細(xì)胞壁合成中至關(guān)重要，因此MEP途徑已成為藥靶研究的熱點(diǎn)，是極有希望的抗菌、抗瘧和除草劑的藥靶之一。結(jié)核桿菌合成異戊二烯類物質(zhì)的途徑不同于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，依賴于2-C-甲基-D-赤蘚醇-4-磷酸鹽途徑(MEP途徑)。經(jīng)過MEP途徑合成的異戊二烯類化合物參與結(jié)核桿菌的多種生物過程，MEP途徑對(duì)結(jié)核桿菌的生長是必需的[見EohH, BrenanPJ, CrickDC.TheMycobacteriumtuberculosisMEP(2C-methyl-D_erythritol4-phosphate)pathwayasanewdrugtarget[J].Tuberculosis2009, 89(I):1-1]。MEP 途徑
[4]經(jīng)歷7步反應(yīng)，7種酶催化，將丙酮酸和3-磷酸甘油醛轉(zhuǎn)化成異戊二烯二磷酸(IPP)和二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)。參與MEP途徑的7種酶分別為:1-脫氧-D-5-磷酸木酮糖合酶(DXS)、1-脫氧-D-5-磷酸木酮糖還原酶(DXR)、4_ 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合成酶(CMS)、4_ 二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶(CMK)、2C_甲基-D-赤蘚糖醇-2，4-環(huán)丙二磷酸合酶(MECDS)、1-羥基-2-甲基_2 (E) - 丁烯-4- 二磷酸合酶(HMS)和1-羥基-2-甲基-2 (E) - 丁烯-4- 二磷酸還原酶(HMR)。DXR是MEP途徑中的關(guān)注度最高的酶。首先，DXR是合成異戊二烯類化合物的重要酶；其次，它僅存在于藻類、植物、結(jié)核桿菌等細(xì)菌中，人體內(nèi)不表達(dá)；再者，發(fā)現(xiàn)膦胺霉素(fosmidomycin, 7)是進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的有效的抗DXR藥物?；谶@些原因，DXR被視為一個(gè)很好的抗結(jié)核靶點(diǎn)[見SinghN，etal.Targetingthemethylerythritolphosphate(MEP)pathwayfornovelantimalarial, antibacterialandherbicidaldrugdiscovery:1nhibitionofl-deoxy-D-xylulose-5-phosphatereductoisomerase (DXR) enzyme [J].CurPharmDes, 207, 13(1): 1161-117]。研究人員以勝胺霉素為先導(dǎo)化合物，先后發(fā)現(xiàn)了乙酰基衍生物(FR9098，8)，羥基脲類似物(化合物9)，羧酸類似物(化合物10)，Ct-芳基取代類似物(化合物I)[見HaemersT, etal.Synthesisofalpha-sub-stitutedfosmidomycinanaloguesashighlypotentPlasmodiumfalciparumgrowthinhibitors [J].BiorgMedChemLet, 2006，16(7):18-1891]等 DXR 抑制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種簡便的，從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法，其特征在于，包括如下步驟，
O海洋微生物發(fā)酵液樣品的制備:海水PDA液體培養(yǎng)基接種真菌，培養(yǎng)后作為種子液繼續(xù)發(fā)酵，待真菌發(fā)酵成熟后，提取代謝產(chǎn)物；并提取胞內(nèi)物質(zhì)，提取的液體濃縮至浸膏，得到初級(jí)浸膏；
初級(jí)浸膏利用正相硅膠柱進(jìn)行等度洗脫，根據(jù)信號(hào)峰出峰的時(shí)間收集洗脫液，減壓濃縮，得到初級(jí)餾分；
初級(jí)餾分使用反相C18制備柱進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)信號(hào)峰出峰的時(shí)間收集洗脫液，減壓蒸餾至浸膏，得到次級(jí)餾分，次級(jí)餾分溶于DMSO使之達(dá)到次級(jí)餾分蒸餾前的體積即為海洋微生物發(fā)酵液樣品；2)His-DXR的制備:以創(chuàng)傷弧菌全基因組為模板，SEQID NO:1和SEQ ID N0:2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，克隆入pET-22b載體得到重組質(zhì)粒pET22b-DXR ;將重組質(zhì)粒pET22b_DXR轉(zhuǎn)化大腸桿菌后用IPTG誘導(dǎo)，離心收集菌體細(xì)胞后重懸，進(jìn)行超聲裂解菌體，離心收集上清，將上清經(jīng)過Ni2 + -NTA親合層析柱洗脫，收集到目的蛋白溶液His-DXR并溶于透析液中，用 Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Devices 反復(fù)離心超濾除鹽，得到 His-DXR ;
3)抑菌活性篩選:將175μ L菌懸液、20 μ L刃天青溶液和5 μ L步驟I)所得海洋微生物發(fā)酵液樣品同時(shí)加入到96微孔板中；同時(shí)設(shè)定陰性和陽性對(duì)照，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，在酶標(biāo)儀中的激發(fā)波長為530nm，發(fā)射波長為590nm處測定其熒光值，并通過公式計(jì)數(shù)出抑制率，篩選出抑制率在80%以上的餾分留做下一步酶活篩選；
所述菌懸液為輪蟲弧菌或坎式弧菌或創(chuàng)傷弧菌懸液；陰性對(duì)照為:5 μ L DMS0+175 μ L菌懸液+20 μ L刃天青；陽性對(duì)照為:5 μ L DMS0+175 μ L LB+20 μ L刃天青；
4)酶活抑制試驗(yàn)篩選:將步驟3)篩選出的餾分溶于DMSO中配置待篩選餾分，在含有Tris-HCl緩沖液，1%(:12，01'1'，應(yīng)0?!1及0乂?，一定pH的反應(yīng)液中，分別加入待篩選餾分，加入步驟2)所得His-DXR開始反應(yīng)，在340nm下測定吸光值，設(shè)置對(duì)照和空白組，對(duì)照組以DMSO代替待篩選餾分，空白組不加His-DXR，重復(fù)三次，計(jì)算抑制率；^ 50%的酶活抑制率的餾分即為篩選到的1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑。
[0008]所述步驟I)中，海洋微生物發(fā)酵液樣品的制備為海水PDA液體培養(yǎng)基接種真菌，培養(yǎng)后作為種子液；大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基 進(jìn)行發(fā)酵，待真菌發(fā)酵成熟后，采用乙酸乙酯浸泡發(fā)酵產(chǎn)物，提取代謝產(chǎn)物，反復(fù)提取3次，每次浸泡24h ;并采用高壓乳化切割機(jī)以乙酸乙酯為溶劑處理發(fā)酵產(chǎn)物，提取胞內(nèi)物質(zhì)，提取的液體采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏，得到初
級(jí)浸膏；
初級(jí)浸膏利用正相硅膠柱，設(shè)置正己烷，乙酸乙酯比例進(jìn)行等度洗脫，通過紫外檢測器檢測信號(hào)，220nm下接收信號(hào)，根據(jù)信號(hào)峰出峰的時(shí)間收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮，得到初級(jí)餾分；
初級(jí)餾分使用反相C18制備柱進(jìn)行次級(jí)餾分的制備，設(shè)置乙腈:水梯度洗脫條件，通過紫外檢測器檢測信號(hào)，220nm下接收信號(hào)，根據(jù)信號(hào)峰出峰的時(shí)間收集洗脫液，減壓蒸餾至浸膏，得到次級(jí)餾分，次級(jí)餾分溶于DMSO使之達(dá)到次級(jí)餾分蒸餾前的體積即為海洋微生物發(fā)酵液樣品。
[0009]所述步驟2)中，以創(chuàng)傷弧菌E1758全基因組為模板，用高保真DNA聚合酶Primerstar進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件:94°C變性30s ;53°C退火30s ;72°C延伸1.5min共30個(gè)循環(huán)；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，將其克隆到pET-22b載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在加氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)12h ;挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖過夜；建質(zhì)粒命名為pET22b-DXR ;將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21(DE3);挑取單菌落，置于5ml LB (Amp + )培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)至D600約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG 28°C誘導(dǎo)，繼續(xù)振搖6h ;對(duì)有His-DXR融合蛋白表達(dá)的菌落進(jìn)行；菌液擴(kuò)增誘導(dǎo)，菌體細(xì)胞進(jìn)行離心收集7800 rpm/min，4°C離心5min后，重懸于 10 ml 結(jié)合緩沖液 NP1-10，并加入 1.5%TriotonX 100，lmmol/L 的 DTT，lmmol/L 的 PMSF，在冰上超聲裂解菌體，超5s，停5s，50%功率；4°C離心收集上清7800 rpmX 20min，將上清轉(zhuǎn)入經(jīng)結(jié)合緩沖液平衡過的Ni2 + -NTA親合層析柱中，4°C下輕緩旋轉(zhuǎn)結(jié)合60min后,棄流出液。用10倍Ni2 + -NTA親合層析柱體積的洗滌緩沖液NP1-20 ;洗滌Ni2 + -NTA親合層析柱，洗滌掉非特異結(jié)合蛋白，棄流出液，重復(fù)一次。最后用5倍Ni2 + -NTA親合層析柱體積的NP1-250 ;洗脫并收集目的蛋白溶液His-DXR，將收集的蛋白再加回去重新洗脫1-3次；收集的蛋白溶液His-DXR溶于透析液中，用Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Devices反復(fù)離心超濾除鹽，得到His-DXR ；
所述結(jié)合緩沖液 NP1-1O 為 50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，10mmol/L 咪唑，pH 8.0 ;洗滌緩沖液 NP1-20 為 50mmol/L NaH2PO4, 300mmo I/L NaCl, 20mmol/L 咪唑，pH
8.0 ；NP1-250 為 50mmol/L NaH2PO4, 300mmoI/L NaCl, 250mmol/L 咪唑，pH 8.0 ;透析液為50mmol/LTris-HCl 緩沖液，2mmol/L DTT, pH 為 7.5。
[0010]所述步驟3)中所述菌懸液為IO4 CFU/mL的輪蟲弧菌或IO4 CFU/mL坎式弧菌或IO5 CFU/mL創(chuàng)傷弧菌；當(dāng)為輪蟲弧菌及坎式弧菌時(shí)，刃天青溶液為500 μ g/mL,當(dāng)為創(chuàng)傷弧菌時(shí)，刃天青溶液為200 μ g/mL ;陰性對(duì)照為:5 μ L DMS0+175 μ L菌懸液+20 μ L刃天青；陽性對(duì)照為:5 μ L DMS0+175 μ L LB+20 μ L 刃天青。
[0011]所述步驟4)為在含有 50mmol/LTris-HCl 緩沖液，3mmol/L 的 MgCl2, 2mmol/L DTT,
0.15mmol/L 的 NADPH 及 0.25mmol/L 的 DXP，pH 為 7.5 的 100 μ I 反應(yīng)液中，在 37 度下，分別加入5 μ I的待篩選餾分，加入步驟2)所得HiS-DXR開始反應(yīng)，5min后在340nm下測定吸光值，設(shè)置對(duì)照和空白組，對(duì)照組以DMSO代替待篩選餾分，空白組不加His-DXR，重復(fù)三次，計(jì)算抑制率；> 50%的酶活抑制率的餾分即為篩選到的篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑。
[0012]所述步驟4)中，所述反應(yīng)溫度為37度。
[0013]本發(fā)明55到60度是酶的最適活性溫度，在37度時(shí)酶也有活性，活性物質(zhì)也不因溫度的改變而發(fā)生未知的改變。
[0014]MEP途徑(即類異戊二烯及其衍生物合成途徑)中關(guān)鍵酶1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶(Dxr)抑制劑的方法。MEP途徑(即類異戊二烯及其衍生物合成途徑)在生物代謝和細(xì)胞壁合成中至關(guān)重要，它在某些細(xì)菌、原蟲和植物質(zhì)體內(nèi)存在，而在哺乳動(dòng)物中并沒有發(fā)現(xiàn)，是極有希望的抗菌、抗瘧和除草劑的藥靶之一。其中，該途徑中最為關(guān)鍵的酶之一是1-脫氧木酮糖-5 憐酸消旋酶(1-deoxy- d-xylulose 5-phosphate reductoisomeraseDxr),通過氧化 NADPH催化 1-脫氧木酮糖-5 憐酸(1-deoxy- d-xylulose-5-phosphate DXP)生成MEP0我們推測抑制Dxr酶活性的化合物，必然會(huì)在一定程度上抑制菌的生長。通過在大腸桿菌中克隆及表達(dá)創(chuàng)傷弧菌Dxr蛋白并優(yōu)化其酶活測定方法，在此基礎(chǔ)上建立弧菌Dxr抑制劑高通量篩選模型，為發(fā)現(xiàn)以Dxr為靶點(diǎn)的新型抗菌藥物或先導(dǎo)化合物奠定基礎(chǔ)。
[0015]本發(fā)明實(shí)施例提供了具體的篩選步驟和方法。可以看出，本發(fā)明得到的21個(gè)有活性的餾分，最終篩選到6個(gè)餾分對(duì)His-DXR的抑制率大于50%，說明該海洋微生物發(fā)酵液的6個(gè)餾分樣品對(duì)His-DXR是有抑制效果的，所篩選的餾分是本發(fā)明需要的抑制劑。
[0016]標(biāo)準(zhǔn)品膦胺霉素(Fosmidomycin)的酶活抑制實(shí)驗(yàn)是一個(gè)陽性對(duì)照試驗(yàn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1是重組質(zhì)粒pET22b_DXR的酶切電泳圖。
[0018]圖2是SDS-PAGE分析Hi S-DXR表達(dá)及純化結(jié)果圖。[0019]圖3是不同濃度NADPH與OD (340nm)吸收值的關(guān)系圖。
[0020]圖4是NADP生成量與時(shí)間的關(guān)系圖。
[0021]圖5A是不同溫度、5B是不同pH值、5C是不同濃度Mg2+、5D是不同底物濃度DXP對(duì)重組His-DXR催化反應(yīng)的影響圖。
[0022]圖6是磷胺霉素不同濃度的抑制率圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0024]實(shí)施例1:從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑 菌種和質(zhì)粒
pET-22b載體、大腸桿菌DH5a、BL21 (DE3)均由本實(shí)驗(yàn)室保存，創(chuàng)傷弧菌(MCCC E1758)輪蟲弧菌(MCCC E385),坎氏弧菌(MCCC E333)保存于中國海洋微生物菌種保藏管理中心。
[0025]主要試劑
引物由廈門安特奧生物科技有限公司合成，DNA序列由Invitrogen公司測定。
[0026]限制性內(nèi)切酶(Xho 1、EcoR I)、EcoR III連接酶、高保真DNA聚合酶Primerstar、DL 2 kb DNA Marker 均購自 TaKaRa 公司；Unstained Protein Molecular WeightMarker及BCA Protein Assay Kit購自美國Thermo公司；異丙基-β -D-硫代半乳糖(isopropyl-β -D-thiogalactoside, IPTG)、二硫蘇糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT)、氨芐青霉素、氯化鈉(NaCl)購自上海生工；Ni2+-NTA親和樹脂購自MACHEREY NAGEL公司；l-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate sodium salt (DXP)、還原型 β -煙酸胺腺嘌呤二核苷酸2'-磷酸四鈉鹽水合物(NADPH)、二甲基亞砜(DMSO)、二水乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、Triton-X 100、苯甲橫氟(phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF)、十二烷基橫酸鈉(SDS)購自美國 Sigma公司；Tryptone、Yeast Extract、Agar 購自英國 0X0ID 公司；AmiconUltra-4 Centrifugal Filter Devices購自美國Millipore公司，刃天青:國藥化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào):71035931)
培養(yǎng)基
實(shí)驗(yàn)所用菌種活化培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，蛋白表達(dá)培養(yǎng)基為2 X YT培養(yǎng)基，并根據(jù)需要添加氨芐青霉素(50 μ g/mL)。
[0027]1、海洋微生物發(fā)酵液樣品的制備:
以海洋真菌為發(fā)酵菌種，先后采用固體發(fā)酵，溶劑萃取和硅膠色譜柱得到次級(jí)餾分；
1)采用海水PDA液體培養(yǎng)基；于高溫滅菌后，嚴(yán)格無菌操作，超凈臺(tái)接種真菌，28V振蕩培養(yǎng)2-3天，將該培養(yǎng)物作為種子液；
2)采用大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，每IL的三角錐瓶裝大米105g，小米45g，加入150 mLPDA培養(yǎng)液，121°C，20min高溫滅菌，15%接種量接種，室溫放置28天；
3)待真菌發(fā)酵成熟后，采用乙酸乙酯浸泡發(fā)酵產(chǎn)物，提取代謝產(chǎn)物，反復(fù)提取3次，每次浸泡24h。并采用高壓乳化切割機(jī)以乙酸乙酯為溶劑處理發(fā)酵產(chǎn)物，提取胞內(nèi)物質(zhì)，提取的液體采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏，得到初級(jí)浸膏；
4)初級(jí)浸膏利用正相硅膠柱，設(shè)置正己烷，乙酸乙酯比例進(jìn)行等度洗脫，通過紫外檢測器檢測信號(hào)，220nm下接收信號(hào)，根據(jù)信號(hào)峰出峰的時(shí)間收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮，得到初級(jí)餾分；
5)初級(jí)餾分使用反相C18制備柱進(jìn)行次級(jí)餾分的制備，設(shè)置乙腈:水梯度洗脫條件，通過紫外檢測器檢測信號(hào)，220nm下接收信號(hào)，根據(jù)信號(hào)峰出峰的時(shí)間收集洗脫液，減壓蒸餾至浸膏，得到次級(jí)餾分；
6)將餾分等體積(與蒸餾前體積相等)溶于DMSO待用；
2、His-DXR的制備
1、創(chuàng)傷弧菌E1758總基因組的提取(參照北京艾德萊生物科技有限公司——細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒貨號(hào):DN12)
1_ 脫氧木酮糖 _5 憐酸消旋酶(l-Deoxy-D-xylulose-5-phosphatereductoisomerase)基因克隆及測序
根據(jù)在NCBI上16S比對(duì)結(jié)果，創(chuàng)傷弧菌(MCCC E1758)與Vibrio vulnificusQAC?&相似性達(dá)99%,故根據(jù)Vibrio vulnificusCMCP6基因1-脫氧木酮糖_5磷酸消旋酶(以下簡稱DXR)序列[NP_760741.1 ]設(shè)計(jì)引物(Dl和D2)，并在上下游引物5’端添加EcoR 1、Xho I酶切位點(diǎn)，引物序列如下:
Dl:5’- TTCGGATCCGAATTCGATGCAAAAGCTAACGATTCT-3’,下劃線為 EcoR I 酶切位點(diǎn)，序列見 SEQ ID NO:1
D2:5’ -GTGGTGGTGCTCGAGTTTTGCAAGATAGTGGCG-3，，不含終止密碼子，下劃線為 Xho I酶切位點(diǎn)。序列見SEQ ID NO:2
采用常規(guī)分子克隆技術(shù)，以E1758全基因組為模板，用高保真DNA聚合酶Primerstar進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件:94°C變性30s ;53°C退火30s ;72°C延伸1.5min共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，將其克隆到pET_22b載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，在加氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)12h。挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖過夜。小量提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR、酶切及測序鑒定。構(gòu)建質(zhì)粒命名為pET22b-DXR。從轉(zhuǎn)化子提取重組質(zhì)粒pET22b-DXR，采取EcoR 1-Xho I雙酶切該質(zhì)粒，獲得1209bp的DNA片段，說明DXR成功插入pET_22b載體中(結(jié)果見圖1)。通過核苷酸測序結(jié)果顯示插入的DXR與已知序列完全一致(NP_760741.1)。
[0028]His-DXR融合蛋白的原核表達(dá)及純化
將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21 (DE3)。挑取單菌落，置于5ml LB (Amp + )培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)至D_約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG 28°C誘導(dǎo)，繼續(xù)振搖6h。利用12%SDS-PAGE來鑒定表達(dá)融合蛋白的菌落。將重組正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為大腸桿菌BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，細(xì)菌裂解液在約44kD處得到一條蛋白條帶(結(jié)果見圖2)對(duì)有His-DXR融合蛋白表達(dá)的菌落進(jìn)行(100mL)菌液擴(kuò)增誘導(dǎo)，菌體細(xì)胞進(jìn)行離心收集7800rpm/min, 4°C離心 5min 后，重懸于 10 ml 結(jié)合緩沖液 NP1-10 (50mmoI /T, NaH2PO4, 300mmoI/L NaCl, 10mmol/L 咪唑，pH 8.0)，并加入 1.5%TriotonX 100，lmmol/L 的 DTT，lmmol/L 的PMSF，在冰上超聲裂解菌體(超5s，停58，50%功率)，41:離心收集上清7800 rpmX 20min,將上清轉(zhuǎn)入經(jīng)結(jié)合緩沖液平衡過的Ni2 + -NTA親合層析柱中，4 0C下輕緩旋轉(zhuǎn)結(jié)合60min后，棄流出液。用10倍Ni2+ -NTA親合層析柱體積的洗滌緩沖液NP1-20 (50mmol/L NaH2PO4,300mmol/L NaCl, 20mmol/L咪唑，pH 8.0)洗滌Ni2 +-NTA親合層析柱，洗滌掉非特異結(jié)合蛋白，棄流出液，重復(fù)一次。最后用5倍Ni2 + -NTA親合層析柱體積的NP1-250 (50mmol/L NaH2P04,300mmol/L NaCl, 250mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫并收集目的蛋白溶液 His-DXR，將收集的蛋白再加回去重新洗脫1-3次。收集的蛋白溶液His-DXR溶于透析液(50mmol/LTris-HCl 緩沖液，2mmol/L DTT, pH 為 7.5)中，用 Amicon Ultra-4 Centrifugal FilterDevices反復(fù)離心超濾除鹽,用12% SDS-PAGE鑒定結(jié)果。
[0029]1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶(His-DXR)的活性測定
鑒于NADPH和NADP +在340及260nm處有各自的最大吸收峰，因此以NADPH為輔酶通過測定340nm吸光值的變化，定量測定酶的活性。以不同濃度的NADPH對(duì)應(yīng)的340nm吸光值作圖(圖3)，對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)中測出的OD34tl的值可根據(jù)所作圖的線性關(guān)系計(jì)算出NADP的生成量。His-DXR在金屬離子Mg2+的作用下催化DXP生成2-C-methyl-D_erythritol4-phosphate (MEP)使NADPH被氧化成NADP，測定340nm處吸光值的降低能反映His-DXR的活性。在實(shí)驗(yàn)組及空白對(duì)照組中反應(yīng)體系均為100 μ 1，其中都含有50mmol/LTris-HCl緩沖液，3mmol/L 的 MgCl2, 2mmol/L DTT, 0.15mmol/L 的 NADPH 及 0.5mM 的 DXP, pH 為 7.5。向?qū)嶒?yàn)組中加入5ul濃度為0.58ug/ul的(即2.9μ g的)酶(His-DXR)，在37°C下反應(yīng)，測定340nm處吸光值的變化，每Imin讀取一次，以NADP生成量對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖，取Λ NADP/min的最大值表示酶活力的大??；空白對(duì)照組中則不加His-DXR酶，每Imin讀取一次NADPH的OD34tl，根據(jù)時(shí)間的推移對(duì)其吸收值的變化作圖(圖4)；
活性測定結(jié)果如下:
不同濃度的NADPH對(duì)應(yīng)的340nm吸光值作圖發(fā)現(xiàn)成線性關(guān)系(y=l.660x+0.0537, R2=0.9915)，見圖3。根據(jù)反應(yīng)中測定的OD340的值可計(jì)算出NADPH反應(yīng)前后濃度的變化，從而可計(jì)算出NADP的生成量，從而確定His-DXR的活力；
對(duì)重組His-DXR進(jìn)行活性檢測測定，結(jié)果表明底物DXP在NADPH存在的條件下，能使NADPH被氧化成NADP，每Imin測定NADPH在340nm處的吸光值，以NADP生成量對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖(結(jié)果見圖4)，可以發(fā)現(xiàn)在5min內(nèi)的NADP的生成量與反應(yīng)時(shí)間處于良好線性關(guān)系(7=0.02281，，1?2=0.999)，其酶活力為0.0228 mmol / L.min。所以反應(yīng)時(shí)間應(yīng)選擇在5min內(nèi)，測定的酶活反應(yīng)速率是在底物充足情況下的最大反應(yīng)速率?？瞻讓?duì)照組NADPH在不加酶的情況下，隨著時(shí)間推移其0D340吸光值基本不發(fā)生變化，即NADPH在5min內(nèi)其量是不會(huì)發(fā)生變化的，即不會(huì)影響酶活的測定；
對(duì)重組His-DXR進(jìn)行活性檢測測定，結(jié)果表明底物DXP在NADPH存在的條件下，能使NADPH被氧化成NADP，每2min測定NADPH在340nm處的吸光值，以NADP生成量對(duì)反應(yīng)時(shí)間作圖，可以發(fā)現(xiàn)在8min內(nèi)的NADP的生成量與反應(yīng)時(shí)間處于良好線性關(guān)系，反應(yīng)時(shí)間超過ISmin后，NADP的生成量曲線明顯趨于平直而不再上升，說明反應(yīng)已達(dá)終末，此后的數(shù)據(jù)不應(yīng)再作為統(tǒng)計(jì)NADP生成量變化的依據(jù)。所以反應(yīng)時(shí)間應(yīng)選擇在5min內(nèi)，測定的酶活反應(yīng)速率是在底物充 足情況下的最大反應(yīng)速率；
為了優(yōu)化重組His-DXR酶活性的測定條件，分別對(duì)不同溫度、不同pH值及不同濃度底物DXP、Mg2+對(duì)酶活性影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明His-DXR的最適反應(yīng)溫度為55_60°C (圖5A)，最適反應(yīng)pH值7.5-8 (圖5B)，Mg2+的最佳濃度為3mmol/L (圖5C)，DXP的最適濃度為
0.25mmol/L (圖 5D)；
酶性質(zhì)的測定
O最適反應(yīng)溫度:在32飛8 °C范圍內(nèi)，在含有50mmol/LTris-HCl緩沖液，3mmol/L的MgCl2, 2mmol/L DTT, 0.15mmol/L 的 NADPH 及 0.5mmol/L 的 DXP，pH 為 7.5 的反應(yīng)液中分別測定酶活。以底物NADP生成量對(duì)溫度作圖。見圖5A ;
2)最適反應(yīng)pH值:37°C下，在不同的pH條件下分別測定酶活，以NADP生成量對(duì)反應(yīng)pH值作圖，所用反應(yīng)液中含有 50mmol/L 的 Tris，3mmol/L 的 MgCl2, 2mmol/L DTT, 0.15mmol/L的NADPH及0.5mmol/L的DXP，用HCl調(diào)節(jié)pH值為3~10。見圖5B ;
3)最適金屬離子濃度:在不同的Mg2+濃度下分別測定酶活，以NADP生成量對(duì)Mg2+濃度作圖，所用反應(yīng)液中含有50mmol/L的Tris，2mmol/L DTT，0.15mmol/L的NADPH及
0.5mmol/L 的 DXP 及 0~8mmol/L 不同濃度的 Mg2+，pH 為 7.5。見圖 5C ;
4)底物濃度的測定:37°C下測定底物DXP在不同濃度時(shí)的酶活，以NADP的生成量對(duì)底物DXP的濃度作圖。所用反應(yīng)液中含有50mmol/LTris-HCl緩沖液，3mmol/L的MgCl2, 2mmol/L DTT, 0.15mmol/L 的 NADPH 及0-θ.5mmol/L 的 DXP，pH 為 7.5。見圖 5D ;
3、抑菌活性篩選:
采用刃天青顯色法作為檢測活性的方法，刃天青顯色法的原理是:活細(xì)胞中的乳酸脫氫酶能將刃天青(藍(lán)色)轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)試鹵靈(粉紅紅色)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，在激發(fā)波長為530nm、發(fā)射波長為590nm下能檢測到突光值。試鹵靈會(huì)繼續(xù)被細(xì)胞還原為無突光的物質(zhì)二氫試鹵靈(白色)，使熒光信號(hào)下降，無活性的或死亡的細(xì)胞喪失了代謝能力而不能還原刃天青，也就不能產(chǎn)生熒光信號(hào)，所以該法能特異性檢測活性細(xì)胞；
實(shí)驗(yàn)采用96孔板操作，根據(jù)96孔板孔的顏色及熒光值計(jì)算出的抑制率判定物質(zhì)是否具有抑菌活性?？字蓄伾仕{(lán)色，則代表樣品對(duì)目標(biāo)菌株有抑制活性；96孔中顏色呈粉紅色或紅色，則代表樣品對(duì)目標(biāo)菌株沒有抑制活性。抑制率公式的計(jì)算公式為
抑制率％=100%_ (實(shí)驗(yàn)孔熒光值-陽性對(duì)照熒光值)/ (陰性對(duì)照熒光值-陽性對(duì)照熒光值)X 100%。抑制率在80%以上，則代 表樣品對(duì)目標(biāo)菌株有較強(qiáng)的抑制作用；
實(shí)驗(yàn)菌株輪蟲弧菌(MCCC E385),坎氏弧菌(MCCC E333)，創(chuàng)傷弧菌(MCCC E1758)分離于廣東湛江感染對(duì)蝦，保存于在30%甘油中，-80°C凍存。將三株菌分別接種于5mL LB培養(yǎng)液中，于37°C振蕩培養(yǎng)3小時(shí)后，收集菌體，用0.9%生理鹽水稀釋，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用LB培養(yǎng)液稀釋調(diào)整菌懸液濃度為IO4 CFU/mL (輪蟲弧菌和坎式弧菌)和IO5 CFU/mL (創(chuàng)傷弧菌);
用無菌水配置刃天青濃度為5000 μ g/mL的母液,并用0.22 μ m的濾膜過濾分裝,凍存在-20°C。取一管將其分別稀釋為500 μ g/mL (適用于輪蟲弧菌及坎式弧菌)和200 μ g/mL(適用于創(chuàng)傷弧菌)；
將175 μ L菌懸液、20 μ L刃天青溶液和5 μ L步驟I的餾分同時(shí)加入到96微孔板中；在96孔板中設(shè)定陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。(陰性對(duì)照為:5 μ L DMSO+175 μ L菌懸液+20 μ L刃天青；陽性對(duì)照為:5 μ L DMSO+175 μ L LB+20 μ L刃天青)，將96孔板放入到37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，24h后觀察96微孔板中各個(gè)孔的顏色，并將96孔板放入酶標(biāo)儀中在激發(fā)波長為530nm發(fā)射波長為590nm處測定的熒光值并通過公式計(jì)數(shù)出抑制率。抑制率在80%以上的餾分留做下一步酶活篩選；
4、酶活抑制試驗(yàn)篩選:
(1)標(biāo)準(zhǔn)品膦胺霉素(Fosmidomycin)的酶活抑制實(shí)驗(yàn)
將膦胺霉素溶于DMSO中，配成濃度為50μπιΟ1/1母液，按兩倍梯度稀釋成:25μπι01/L, 12.5 μ mol/L, 6.25 μ mol/L, 3.125 μ mol/L,在 5 孔含有 50mmol/LTris-HCl 緩沖液，3mmol/L 的 MgC12，2mmol/L DTT,0.15mmol/L 的 NADPH 及 0.25mmol/L 的 DXP，pH 為 7.5 的100 μ I反應(yīng)液中，分別加入各濃度的膦胺霉素5 μ 1，即100 μ I體系中膦胺霉素的濃度為2500nmol/L, 1250nmol/L, 625nmol/L, 312.5nmol/L, 156.25nmol/L。然后分別加入步驟 2 所得濃度為0.58ug/ul (即2.9 μ g的)His-DXR 5ul開始反應(yīng)。5min后在340nm下測定吸光值。設(shè)置對(duì)照和空白組，對(duì)照組以DMSO代替膦胺霉素，空白組不加酶(即不加His-DXR)，重復(fù)三次，計(jì)算抑制率。抑制率(％)=(樣品吸光值一對(duì)照吸光值)/ (空白吸光值一對(duì)照吸光值)X 100%
膦胺霉素因其結(jié)構(gòu)與酶活反應(yīng)底物DXP異構(gòu)化產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似，故被認(rèn)為是專一性抑制 1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶(DXR)的抗生素。用GraphPad prism軟件作圖并計(jì)算出
膦胺
霉素對(duì)于創(chuàng)傷弧菌1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶(DXR)的IC5tl(半抑制濃度)為390nmol/
L,
見圖6 ；
(2)海洋微生物發(fā)酵液樣品酶活抑制實(shí)驗(yàn)
將抑菌活性> 80%的餾分按標(biāo)準(zhǔn)品膦胺霉素酶活抑制實(shí)驗(yàn)方法及抑制率計(jì)算方法，檢測待測樣品的抑制活性，^ 50%的酶活抑制率視為有活性的餾分。本實(shí)驗(yàn)共篩選了 21個(gè)餾分，抑制率見表1和2，其中6個(gè)餾分是有效的。
[0030]利用上述方法構(gòu)建的His-DXR抑制劑篩選模型，對(duì)用刃天青方法篩選出的有活性的21個(gè)微生物發(fā)酵物進(jìn)行篩選，根據(jù)抑制率大于50%確定陽性結(jié)果。
[0031]表1:6個(gè)餾分的抑制率
【權(quán)利要求】
1.一種從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法，其特征在于，包括如下步驟， 1)海洋微生物發(fā)酵液樣品的制備:海水PDA液體培養(yǎng)基接種真菌，培養(yǎng)后作為種子液繼續(xù)發(fā)酵，待真菌發(fā)酵成熟后，提取代謝產(chǎn)物；并提取胞內(nèi)物質(zhì)，提取的液體濃縮至浸膏，得到初級(jí)浸膏； 初級(jí)浸膏利用正相硅膠柱進(jìn)行等度洗脫，根據(jù)信號(hào)峰出峰的時(shí)間收集洗脫液，減壓濃縮，得到初級(jí)餾分； 初級(jí)餾分使用反相C18制備柱進(jìn)行梯度洗脫，根據(jù)信號(hào)峰出峰的時(shí)間收集洗脫液，減壓蒸餾至浸膏，得到次級(jí)餾分，次級(jí)餾分溶于DMSO使之達(dá)到次級(jí)餾分蒸餾前的體積即為海洋微生物發(fā)酵液樣品； 2)His-DXR的制備:以創(chuàng)傷弧菌全基因組為模板，SEQID NO:1和SEQ ID N0:2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，克隆入pET-22b載體得到重組質(zhì)粒pET22b-DXR ;將重組質(zhì)粒pET22b_DXR轉(zhuǎn)化大腸桿菌后用IPTG誘導(dǎo)，離心收集菌體細(xì)胞后重懸，進(jìn)行超聲裂解菌體，離心收集上清，將上清經(jīng)過Ni2 + -NTA親合層析柱洗脫，收集到目的蛋白溶液His-DXR并溶于透析液中，用 Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Devices 反復(fù)離心超濾除鹽，得到 His-DXR ; 3)抑菌活性篩選:將175μ L菌懸液、20 μ L刃天青溶液和5 μ L步驟I)所得海洋微生物發(fā)酵液樣品同時(shí)加入到96微孔板中；同時(shí)設(shè)定陰性和陽性對(duì)照，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，在酶標(biāo)儀中的激發(fā)波長為530nm，發(fā)射波長為590nm處測定其熒光值，并通過公式計(jì)數(shù)出抑制率，篩選出抑制率在80%以上的餾分留做下一步酶活篩選； 所述菌懸液為輪蟲弧菌或坎式弧菌或創(chuàng)傷弧菌懸液；陰性對(duì)照為:5 μ L DMS0+175 μ L菌懸液+20 μ L刃天青；陽性對(duì)照為:5 μ L DMS0+175 μ L LB+20 μ L刃天青； 4)酶活抑制試驗(yàn)篩選:將步驟3)篩選出的餾分溶于DMSO中配置待篩選餾分，在含有Tris-HCl緩沖液，1%(:12，01'1'，應(yīng)0?!1及0乂?，一定pH的反應(yīng)液中，分別加入待篩選餾分，加入步驟2)所得His-DXR開始反應(yīng)，在340nm下測定吸光值，設(shè)置對(duì)照和空白組，對(duì)照組以DMSO代替待篩選餾分，空白組不加His-DXR，重復(fù)三次，計(jì)算抑制率；^ 50%的酶活抑制率的餾分即為篩選到的1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑。
2.權(quán)利要求1所述從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟I)中，海洋微生物發(fā)酵液樣品的制備為海水PDA液體培養(yǎng)基接種真菌，培養(yǎng)后作為種子液；大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，待真菌發(fā)酵成熟后，采用乙酸乙酯浸泡發(fā)酵產(chǎn)物，提取代謝產(chǎn)物，反復(fù)提取3次，每次浸泡24h ;并采用高壓乳化切割機(jī)以乙酸乙酯為溶劑處理發(fā)酵產(chǎn)物，提取胞內(nèi)物質(zhì)，提取的液體采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏，得到初級(jí)浸膏； 初級(jí)浸膏利用正相硅膠柱，設(shè)置正己烷，乙酸乙酯比例進(jìn)行等度洗脫，通過紫外檢測器檢測信號(hào)，220nm下接收信號(hào)，根據(jù)信號(hào)峰出峰的時(shí)間收集洗脫液，洗脫液減壓濃縮，得到初級(jí)餾分； 初級(jí)餾分使用反相C18制備柱進(jìn) 行次級(jí)餾分的制備，設(shè)置乙腈:水梯度洗脫條件，通過紫外檢測器檢測信號(hào)，220nm下接收信號(hào)，根據(jù)信號(hào)峰出峰的時(shí)間收集洗脫液，減壓蒸餾至浸膏，得到次級(jí)餾分，次級(jí)餾分溶于DMSO使之達(dá)到次級(jí)餾分蒸餾前的體積即為海洋微生物發(fā)酵液樣品。
3.權(quán)利要求1所述從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟2)中，以創(chuàng)傷弧菌E1758全基因組為模板，用高保真DNA聚合酶Primerstar進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件:94°C變性30s ;53°C退火30s ;72°C延伸1.5min共30個(gè)循環(huán)；PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收，將其克隆到pET-22b載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，在加氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)12h ;挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振搖過夜；建質(zhì)粒命名為pET22b-DXR ;將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株BL21 (DE3);挑取單菌落，置于5ml LB (Amp + )培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)至D600約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG 28°C誘導(dǎo)，繼續(xù)振搖6h ;對(duì)有His-DXR融合蛋白表達(dá)的菌落進(jìn)行；菌液擴(kuò)增誘導(dǎo)，菌體細(xì)胞進(jìn)行離心收集7800 rpm/min，4°C離心5min后，重懸于 10 ml 結(jié)合緩沖液 NP1-10，并加入 1.5%TriotonX 100, lmmol/L 的 DTT，lmmol/L 的PMSF，在冰上超聲裂解菌體，超5s，停5s，50%功率；4°C離心收集上清7800 rpmX 20min,將上清轉(zhuǎn)入經(jīng)結(jié)合緩沖液平衡過的Ni2 + -NTA親合層析柱中，4°C下輕緩旋轉(zhuǎn)結(jié)合60min后，棄流出液； 用10倍Ni2 + -NTA親合層析柱體積的洗滌緩沖液NP1-20 ;洗滌Ni2 + -NTA親合層析柱，洗滌掉非特異結(jié)合蛋白，棄流出液，重復(fù)一次； 最后用5倍Ni2 + -NTA親合層析柱體積的NP1-250 ;洗脫并收集目的蛋白溶液His-DXR，將收集的蛋白再加回去重新洗脫1-3次；收集的蛋白溶液His-DXR溶于透析液中，用 Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Devices 反復(fù)離心超濾除鹽，得到 His-DXR ; 所述結(jié)合緩沖液 NP1-10 為 50mmol/L NaH2PO4, 300mmol/L NaCl，10mmol/L 咪唑，pH 8.0 ;洗滌緩沖液 NP1-20 為 50mmol/L NaH2PO4, 300mmo I/L NaCl, 20mmol/L 咪唑，pH8.0 ；NP1-250 為 50mmol/L NaH2PO4, 300mmoI/L NaCl, 250mmol/L 咪唑，pH 8.0 ;透析液為50mmol/LTris-HCl 緩沖液，2mmol/L DTT, pH 為 7.5。
4.權(quán)利要求1所述從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟3)中所述菌懸液為IO4 CFU/mL的輪蟲弧菌或IO4 CFU/mL坎式弧菌或IO5 CFU/mL創(chuàng)傷弧菌；當(dāng)為輪蟲弧菌及坎式弧菌時(shí)，刃天青溶液為500 μ g/mL,當(dāng)為創(chuàng)傷弧菌時(shí)，刃天青溶液為200 μ g/mL ;陰性對(duì)照為:5 μ L DMS0+175 μ L菌懸液+20 μ L刃天青;陽性對(duì)照為:5μ L DMS0+175 μ L LB+20 μ L刃天青。
5.權(quán)利要求1所述從海洋微生物發(fā)酵液中篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑的方法，其特征在于，所述步驟4)為將步驟3)篩選出的餾分溶于DMSO中，在含有50mmol/LTris-HCl 緩沖液，3mmol/L 的 MgCl2, 2mmol/L DTT, 0.15mmol/L 的 NADPH 及 0.25mmol/L 的DXP, pH為7.5的100 μ I反應(yīng)液中，在37度下，分別加入5 μ I待篩選餾分，加入步驟2)所得His-DXR開始反應(yīng)，5min后在340nm下測定吸光值，設(shè)置對(duì)照和空白組，對(duì)照組以DMSO代替待篩選餾分，空白組不加His-DXR，重復(fù)三次，計(jì)算抑制率；^ 50%的酶活抑制率的餾分即為篩選到的篩選1-脫氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制劑。
【文檔編號(hào)】C12P1/02GK103911394SQ201410093680
【公開日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】王蔚, 李芊, 楊慧, 陳卓, 胡彬, 陳建明 申請(qǐng)人:國家海洋局第三海洋研究所