專利名稱：乙醇診斷/測定試劑盒及乙醇的濃度測定方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種乙醇診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定乙 醇濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領域。
技術(shù)背景乙醇具成癮性，酒濫用和酒依賴是當今世界范圍內(nèi)最嚴重的社會經(jīng) 濟和公共衛(wèi)生問題之一。在西方國家，酒精相關性肝病已成為死亡的第六位原因。在我國，近20年來，隨著社會經(jīng)濟發(fā)展，人均酒消耗量 大幅度上升，酒依賴的患病率日趨增高。生物樣品中乙醇的定量測定方法主要有化學比色法，酶終點比色 法，均相酶免疫測定法(EIA)，氣相色譜法(GC)和呼出氣乙醇分析。 此外血清滲透量法可作乙醇半定量分析。有多種化學比色法曾用于乙醇定量測定，微量擴散法是其中較簡單 實用的一種，微量溢出的乙醇可使鉻酸還原成藍色的氧化袼。根據(jù)所用的試劑酶不同，乙醇的酶法測定分為二種乙醇氧化酶法 和乙醇脫氫酶法，與乙醇氧化酶法相比，乙醇脫氫酶法的專一性高， 不會與甲醇和丙酮起催化反應。一般認為氣相色譜法可作為參考方法，尤其在準確性和精密度要求 高的法醫(yī)學乙醇測定中應用最廣。GC法的獨特優(yōu)點在于特異、靈敏， 且能同時分析多種揮發(fā)性醇類物質(zhì)，如乙醇、甲醇、丙酮、乙醛和異丙醇。其他乙醇的測定方法還有均相酶免疫分析(Homogeneous enzyme immunoassay),滲透量法、呼出氣乙醇分析法；用呼出氣乙醇分析儀 檢測乙醇操作簡單、快速，在交通執(zhí)法部門應用較多。這類儀器中一 種是根據(jù)紅外光吸收原理設計的，該法測定的乙醇濃度與酶法測得的 血乙醇濃度相關性很好。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，計量/ 連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的 變化，得以測定乙醇濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該 方法的乙醇診斷/測定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析 儀或半、全自動生化分析儀上進行乙醇濃度測定，而且測定速度快、 準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發(fā)明乙醇濃度測定方法原理如下乙醇+過氧化氫過氧化氫酶乙醛+水 乙醛+輔酶+水醛脫氫酶乙酸+還原型輔酶 這種方法應用過氧化氫酶(catalase ; EC 1.1L1.6)酶(偶)聯(lián)醛脫氫 酶(Aldehyde dehydrogenase ; EC 1.2.1.3; EC 1.2.1.4; EC 1.2.1.5)酶 促反應速率比色法/終點法。過氧化氫酶酶解乙醇反應產(chǎn)生乙醛，再通 過(偶)聯(lián)合醛脫氫酶的作用，最終將輔酶(在340nm處沒有吸收峰) 還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的程度/速度，通過測量340nrn處吸光度 上升的程度/速度，可以測算乙醇的濃度大小。實驗表明，從測定結(jié)果的準確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明乙醇診斷/測定試劑盒較為理想緩沖液 100mmol/L穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L過氧化氫 3 mmol/L過氧化氫酶 10000 U/L醛脫氫酶 10000 U/L本發(fā)明的乙醇診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、過氧化氫酶、醛脫氫酶。 試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化氫酶、醛脫氫酶。 輔酶、過氧化氫、過氧化氫酶、醛脫氫酶在試劑1或試劑2中的位 置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、醛脫氫酶。試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化氫酶。輔酶、過氧化氫、過氧化氫酶、醛脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后 使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定乙醇濃度的方法，其輔酶 可以是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。 實施例一.本實施例的乙醇診斷/測定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L輔酶 3 mmol/L過氧化氫 3 mmol/L過氧化氫酶 10000 U/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37"C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm,被測乙醇樣 品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時 間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出乙 醇的濃度大小。 實施例二本實施例的乙醇診斷/測定試劑為雙試劑，包括-試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑過氧化氫100 mmol/L 50 mmol/L 3 mmol/L 3 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑過氧化氫酶100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L10簡U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。在全自動生化分析儀上設定溫度37'C，反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測乙醇樣 品與試劑l、試劑2的體積比例為2/20/5，反應方向為正反應(上升反 應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出乙 醇的濃度大小。 實施例三本實施例的乙醇診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 10Ommol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L輔酶 3 mmol/L過氧化氫 3 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100 mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L醛脫氫酶畫00U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L穩(wěn)定劑500 mmol/L過氧化氫酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定乙醇濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應 時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長 405nm，被測乙醇樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5， 反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間 5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，從而測算出乙 醇的濃度大小。申請人經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉?？傊瑢嶒炞C明，采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應 用。
權(quán)利要求
1.一種酶比色法及酶聯(lián)法的乙醇的濃度測定方法，其方法原理如下乙醇+過氧化氫 過氧化氫酶 乙醛+水乙醛+輔酶+水 醛脫氫酶 乙酸+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的程度/速度，測算出乙醇的濃度大小測定結(jié)果。
2. —種乙醇診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20-500 mmol/L穩(wěn)定劑 1——4000 mmol/L輔酶 1- 6 mmol/L過氧化氫 1——6mmol/L過氧化氫酶 1000——80000 U/L醛脫氫酶 1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑盒，其特征在于-由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、過氧化氫酶、醛脫氫酶組成 單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、過氧化氫酶、醛脫氫酶組成 雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、過氧化氫酶、醛脫氫酶組成。輔酶、過 氧化氫、過氧化氫酶、醛脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不 限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫、過氧化氫酶、醛脫氫酶組成 多劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、過氧化氫組成；試 劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、醛脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、過氧化氫酶組成。輔酶、過氧化氫、過氧化氫酶、醛脫氫酶 在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述乙醇診斷/測定試劑盒，其特征在于還包括 穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為硫 酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的乙醇診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定乙醇濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術(shù)領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、過氧化氫、過氧化氫酶、醛脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑混合，使之發(fā)生酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的程度/速度，從而測算出乙醇的濃度大小。
文檔編號C12Q1/00GK101324630SQ200710023209
公開日2008年12月17日 申請日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司