專利名稱：錳離子診斷/測(cè)定試劑盒及錳離子濃度測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種錳離子診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定 錳離子濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
錳作為一種微量元素在人體中是不可或缺的必需成分，同時(shí)也是對(duì) 人體有毒的物質(zhì)。在自然狀態(tài)下，以兩價(jià)、三價(jià)和四價(jià)的形式存在， 氧化程度越低，毒性越高。通常錳有八種不同的氧化狀態(tài)。錳的生物 學(xué)意義是作為人體中輔助因子有多種多樣的功能。然而，在許多酶激
活反應(yīng)中，M^+和Mg^可互相替代。
常用石墨爐原子吸收分光光度測(cè)定法、原子發(fā)射ICP-OES。中子激 發(fā)分析(NAA)是最好的方法，但僅能在一些條件好的實(shí)驗(yàn)室才能測(cè) 定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，監(jiān)測(cè) 還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長(zhǎng)處吸光度的變化，得 以測(cè)定錳離子濃度的方法，同時(shí)，本發(fā)明還將給出用以實(shí)現(xiàn)該方法的 錳離子診斷/測(cè)定試劑盒，采用該試劑不僅可以在紫外/可見(jiàn)光分析儀或 半、全自動(dòng)生化分析儀上進(jìn)行錳離子濃度測(cè)定，而且測(cè)定速度快、準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實(shí)的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明錳離子濃度測(cè)定方法原理如下
草酰乙酸草酰乙酸脫羧酶/Ml^ 丙酮酸+ 二氧化碳 二氧化碳+還原型輔酶甲醛脫氫酶甲酸+輔酶
這種方法應(yīng)用需要錳離子激活的草酰乙酸脫羧酶(oxaloacetate
decarboxylase ; EC 4.1.1.3)酶(偶)聯(lián)甲醛脫氫酶(Formate dehydrogenase ; EC 1.2.1.2; EC 1.2丄43)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)法/速率 比色法。草酰乙酸脫羧酶，在錳離子的激活下，酶解草酰乙酸反應(yīng)產(chǎn) 生二氧化碳，再通過(guò)(偶)聯(lián)合甲醛脫氫酶的作用，最終將還原型輔 酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nrn處沒(méi)有吸收峰)， 從而得以測(cè)定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的速度，通過(guò)測(cè)量 340nm處吸光度下降的速度，可以測(cè)算錳離子的濃度大小。
實(shí)驗(yàn)表明，從測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟(jì)性兩方面綜合考 慮，無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明錳離子診斷/ 測(cè)定試劑盒較為理想
緩沖液
穩(wěn)定劑
還原型輔酶
草酰乙酸
草酰乙酸脫羧f(wàn)
1Q0mmol/L 500 mmol/L 0.25 mmol/L 20 mmol/L 10000U/L
甲醛脫氫酶 10000 U/L
本發(fā)明的錳離子診斷/測(cè)定試劑盒可以是單劑，包括緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、草酰乙酸脫羧酶、 甲醛脫氫酶。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑 試劑l緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶、甲醛脫氫酶。 還原型輔酶、草酰乙酸、草酰乙酸脫羧酶、甲醛脫氫酶在試劑1或 試劑2中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶 解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑 試劑1緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸。 試劑2緩沖液、穩(wěn)定劑、甲醛脫氫酶。 試劑3緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶。 還原型輔酶、草酰乙酸、草酰乙酸脫羧酶、甲醛脫氫酶在試劑l、 試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用 前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。無(wú)論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測(cè)定錳離子濃度的方法，其還原型輔酶可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例子對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。 實(shí)施例一本實(shí)施例的錳離子診斷/測(cè)定試劑為單試劑，包括三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500 mmol/L還原型輔酶 0.25 mmol/L草酰乙酸 20mmol/L 草酰乙酸脫羧酶 10000 U/L甲醛脫氫酶 10000 U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復(fù)溶后使用。在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)錳離 子樣品與試劑的體積比例為1/25，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延 遲時(shí)間大約l分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出錳離子 的濃度大小。 實(shí)施例本實(shí)施例的錳離子診斷/測(cè)定試劑為雙試劑，包括: 試劑1三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶草酰乙酸100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑草酰乙酸脫羧酶 甲醛脫氫酶100mmol/L 500腿ol/L10000U/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37'C，反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始 吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波長(zhǎng)405nm，被測(cè)錳離 子樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下 降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右，檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出錳離子 的濃度大小。. 實(shí)施例三本實(shí)施例的錳離子診斷/測(cè)定試劑為三試劑，包括 試劑l三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液穩(wěn)定劑還原型輔酶草酰乙酸100 mmol/L 50 mmol/L0.25 mmol/L 20 mmol/L試劑2三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑甲醛脫氫酶100 mmol/L 500 mmol/L 10000U/L試劑3三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 穩(wěn)定劑草酰乙酸脫羧酶100mmol/L500 mmol/L10000U/L試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。測(cè)定錳離子濃度時(shí)，在全自動(dòng)生化分析儀上設(shè)定溫度37°C,反應(yīng)時(shí)間10分鐘，起始吸光度1.8±0.7，測(cè)試主波長(zhǎng)340nm，測(cè)試副波 長(zhǎng)405nm，被測(cè)錳離子樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應(yīng)方向?yàn)樨?fù)反應(yīng)(下降反應(yīng))，延遲時(shí)間大約1分鐘左右， 檢測(cè)時(shí)間5分鐘左右。加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化 分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，從而測(cè)算出錳離子 的濃度大小。申請(qǐng)人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他各種還原型色原體組合均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測(cè)定步驟等情況與以上實(shí) 施例類同，不另一一例舉?？傊?，實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明的測(cè)定方法完全可以通過(guò)一般生化分 析儀器得出所需的測(cè)定結(jié)果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應(yīng) 用。
權(quán)利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳離子濃度測(cè)定方法，其方法原理如下草酰乙酸 草酰乙酸脫羧酶/Mn2+ 丙酮酸+二氧化碳二氧化碳+還原型輔酶 甲醛脫氫酶 甲酸+輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀或半、全自動(dòng)生化分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm吸光度下降的速度，測(cè)算出錳離子的濃度大小測(cè)定結(jié)果。
2. —種錳離子診斷/測(cè)定試劑盒，主要成分包括: 緩沖液 穩(wěn)定劑20-500 mmol/L1— 4000mmol/L還原型輔酶 草酰乙酸 草酰乙酸脫羧酶 甲醛脫氫酶0.1-—0.35 mmol/L-50 'mmol/L畫(huà)腦00 U/L1000-1000——80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、草酰乙酸脫羧酶、甲 醛脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、草酰乙酸脫羧酶、甲醛脫氫酶組成雙劑試劑；試劑l，由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、 草酰乙酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶、甲 醛脫氫酶組成。還原型輔酶、草酰乙酸、草酰乙酸脫羧酶、甲醛脫 氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、草酰乙酸、草酰乙酸脫羧酶、甲 醛脫氫酶組成多劑試劑；試劑l,由緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、 草酰乙酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、甲醛脫氫酶組成；試 劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、草酰乙酸脫羧酶組成。還原型輔酶、草 酰乙酸、草酰乙酸脫羧酶、甲醛脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3 中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述錳離子診斷/測(cè)定試劑盒，其特征在于還包 括穩(wěn)定劑1~4000 mmol/L或0.1%-100°/。體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的錳離子診斷/測(cè)定試劑盒，同時(shí)本發(fā)明還涉及測(cè)定錳離子濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)/食品/環(huán)境檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、還原型輔酶、草酰乙酸、草酰乙酸脫羧酶、甲醛脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過(guò)將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見(jiàn)光分析儀下，檢測(cè)主波長(zhǎng)340nm處吸光度下降的速度，從而測(cè)算出錳離子的濃度大小。
文檔編號(hào)C12Q1/00GK101324594SQ20071002320
公開(kāi)日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2007年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者王爾中 申請(qǐng)人:蘇州艾杰生物科技有限公司