專利名稱：腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)及腺苷脫氨酶活性濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定腺苷脫氨酶
活性濃度的方法，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。
背景技術：
醫(yī)學研究表明，腺苷脫氨酶是一種與機體細胞免疫活性有重要關系的核酸代謝 酶。因此，腺苷脫氨酶活性的測定被作為良惡性胸腹水，腦脊液鑒別診斷，重癥聯(lián)合免疫缺 陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鑒別的重要診斷標志。 腺苷脫氨酶的活性測定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。據(jù)申請人了 解，目前國際上普遍采用紫外光法，其測定原理是腺苷(白色結(jié)晶粉末)+水(H。0)腺苷脫 fiS肌苷(Inosine) +氨離子(NH4+)，此反映過程生成的肌苷會在波長為265nm處顯現(xiàn)，因 此可以通過測定此波長處吸光度的大小直接反映腺苷脫氨酶活性的大小。然而，此方法無 法用一般醫(yī)院的可見光分析儀測定，而需要使用專門的紫外光分析儀，因此難以切實推廣 應用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出 一 種利用間接酶循環(huán)擴增法
(IndirectEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)
及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在
340nm波長處吸光度的變化，得以測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出
用以實現(xiàn)該方法的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，采用該試劑(盒)不僅可以在紫外/可見光
分析儀或半、全自動生化分析儀上進行腺苷脫氨酶活性濃度測定，而且測定速度快、準確度
高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發(fā)明腺苷脫氨酶活性濃度測定方法如下 腺苷+水腺苷脫氨酶肌苷+氨 氨+丙酮酸+吲哚色氨酸酶/K+色氨酸+水 色胺酸+輔酶色胺酸脫氫酶/Ca2+ (吲哚-3-基)丙酮酸+氨 +還原型輔酶 這種方法應用腺苷脫氨酶(Adenosine Deaminase ;EC 3. 5. 4. 4)酶(偶)聯(lián)色 氨酸酶(tryptoph,se ;EC 4. 1.99. 1)、色氨酸脫氫酶(Tryptophan dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 19)酶促反應連續(xù)監(jiān)測法。腺苷脫氨酶及色氨酸酶都作為作用酶，功能為將腺苷酶解 產(chǎn)生氨，再生成色氨酸。色氨酸脫氫酶作為循環(huán)酶色氨酸脫氫酶的酶促作用使色胺酸再次 產(chǎn)生氨，使氨可以不斷的被重復循環(huán)利用。色氨酸脫氫酶又作為顯色酶，將輔酶(在340nm 處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在 340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算腺苷脫氨酶的活性濃度大小 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法，其輔酶可以 下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一 本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為單試劑，包括 [OO44] 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol/L








試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復溶后使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37°C，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. 1， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反 應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值 4180。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
實施例二
本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為雙試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液lOOmmol/L
50mmol/L 3mmol/L 4mmol/L 15mmol/L 12mmol/L 6mmol/L 4mmol/L












穩(wěn)定劑 輔酶 腺苷 丙酮酸 口引哚 氯化鉀 氯化鈣 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
鹽酸緩沖液lOOmmol/L 500,1/L 6000U/L
色氨酸脫氫酶 8000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測
試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為
2/20/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，
理論K值2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
實施例三 本實施例的腺苷脫氨酶診斷試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 10Ommol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
腺苷 4mmol/L
丙酮酸 15,1/L
噴哚 12mmol/L
氯化鉀 6mmol/L
氯化f丐 4mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
色氨酸脫氫酶 8000U/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
色氨酸酶 6000U/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。
測定腺苷脫氨酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間 10分鐘，起始吸光度《0. l，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測腺苷脫氨酶樣品與 試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間 大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達到本發(fā)明 的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0. 0006 ;吸光度時間反應曲線應呈直 線下降；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達700U/L ;試劑測試的不準確度，其相對偏
7差不超過±4% ;試劑測試的精密度(重復性)的變異系數(shù)(CV)《2% ;試劑的靈敏度可 達0. 0046±0. 0023 A A/min/U/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈 敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應用。
權(quán)利要求
一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的腺苷脫氨酶活性濃度測定方法，其方法如下腺苷+水 腺苷脫氨酶 肌苷+氨氨+丙酮酸+吲哚 色氨酸酶/K+ 色氨酸+水色胺酸+輔酶 色胺酸脫氫酶/Ca2+ (吲哚-3-基)丙酮酸+氨 +還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小測定結(jié)果。
2. —種腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，主要成分包括 緩沖液 20-500mmol/L穩(wěn)定劑 1-4000mmol/L輔酶 1-6mmol/L色氨酸酶 1000——80000U/L 色氨酸脫氫酶1000——80000U/L腺苷 1-50mmol/L丙酮酸 1-50mmol/L吲哚 1-50mmol/L氯化鉀 1——50mmol/L 氯化鈣 1-50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應作用。鉀離子、鈣離子是分別是色氨酸酶及色氨酸脫氫酶的激活劑，因此氯化鉀及氯化 鈣可用其它鉀鹽及鈣鹽取代。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、氯化鉀、氯化鈣組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、氯化鉀、氯化鈣組成雙劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、氯化鉀、氯化鈣組成； 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶組成。輔酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、腺 苷、丙酮酸、吲哚、氯化鉀、氯化鈣在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、氯化鉀、氯化鈣組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、氯化鉀、氯化鈣組成； 試劑2，由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶組成。輔 酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、氯化鉀、氯化鈣在試劑1、試劑2或試劑3 中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術的腺苷脫氨酶診斷試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定腺苷脫氨酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、腺苷、丙酮酸、吲哚、氯化鉀、氯化鈣、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出腺苷脫氨酶的活性濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101762546SQ20081024427
公開日2010年6月30日 申請日期2008年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月10日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司