專利名稱：一種提高枯草芽孢桿菌surfactin產(chǎn)量的啟動(dòng)子置換方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提高枯草芽孢桿菌surfactin產(chǎn)量的啟動(dòng)子置換方法，是利用啟動(dòng) 子置換技術(shù)提高枯草芽孢桿菌的脂肽類抗生素surfactin產(chǎn)量方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。二、 背景技術(shù)5ac77/w wZ)rifc在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中能夠產(chǎn)生不同種類的抗菌物質(zhì)，其中抗菌肽占 主導(dǎo)地位。文摘Bacillus subtilis產(chǎn)生的抗菌肽通常分為兩大類 一類是核糖體合成 的羊毛硫抗生素(lantibiotics),主要包括subtilin、 Erisin、 sublancin、禾卩subtilosin等， (Applied Microbiol Biotechnol, 1997, 48: 80-82. Journal Biotenology, 2002, 5:1-8. rchive Microbiology, 1996, 165:243-251. J. Biol.Chem. 1998, 273: 23134-23142. Rev Microbiol, 1993, 47: 535-564.)，通常抑制革蘭氏陽(yáng)性菌生長(zhǎng)，另一類非核糖體合成的脂肽類抗生 素(lipopeptides)，它們是由多個(gè)酶催化合成的主要包括surfactin、 iturin家族iturin、 bacillomycin和mycosubtilin、 fengycin等。具有抗細(xì)菌、真菌、病毒活性。文摘由于它的廣譜的抗菌活性、生物降解和降低表面活性的特點(diǎn).(Molecular Microbiology, 2005, 56: 845-857.精細(xì)化工,2006, (2):121-125.生物技術(shù)通報(bào),2004, (6):11-16.化學(xué)學(xué)報(bào)，2004,(21):2200-2204.)，因此越來(lái)越受到人們的重視。文摘在植 物病害生物防治(Phytichemistry, 2002, 61 : 693-698)、食品防腐(食品工業(yè)科技)，2006, (4 ) :91-93.Journal of Food Protection, 2000, 63: 1123-1132.)以及飼料添加劑等方面具有 潛在的應(yīng)用前景。特別是目前農(nóng)藥殘留、化學(xué)食品和飼料添加劑對(duì)于食品安全的嚴(yán)重 影響，探索天然的抗菌物質(zhì)對(duì)于農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。國(guó)內(nèi)外針對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件下抗菌肽的發(fā)酵工藝和分離技術(shù)已經(jīng)開(kāi)展大量研究。雖然 通過(guò)發(fā)酵工藝的優(yōu)化和誘變育種能夠提高surfactin的生產(chǎn)水平，但surfactin的發(fā)酵產(chǎn) 量相對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)還是很低。因此，研究采用分子生物學(xué)方法，直接對(duì)負(fù)責(zé)surfactin 合成的操縱子進(jìn)行改造，從而提高surfactin的生產(chǎn)水平。對(duì)于surfacin合成機(jī)理的研 究具有重要的理論意義，同時(shí)對(duì)于對(duì)于提高surfactin產(chǎn)量，應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)具有重要 意義。同源整合技術(shù)就是通過(guò)同源重組將外源基因定點(diǎn)整合入耙細(xì)胞基因組上某一確定 的位點(diǎn),以達(dá)到定點(diǎn)修飾改造染色體上某一基因?yàn)槟康牡囊豁?xiàng)技術(shù)。它克服了隨機(jī)整合 的盲目性和危險(xiǎn)性，是一種理想的修飾、改造生物遺傳物質(zhì)的方法。這項(xiàng)術(shù)的誕生可以 說(shuō)是分子生物學(xué)技術(shù)上繼轉(zhuǎn)基因技術(shù)后的又一革命。尤其是條件性、可誘導(dǎo)性基因同 源整合系統(tǒng)的建立，使得對(duì)基因靶位點(diǎn)在時(shí)間和空間上的調(diào)控更加精確。文摘(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Aug. 2005, p. 45774584. J. Bacteriol. 183:6265—6273.)。 目前已有通過(guò)同源整合技術(shù)使強(qiáng)啟動(dòng)子來(lái)置換抗菌肽合成酶操縱子的啟動(dòng)子，并提高了該抗菌肽的產(chǎn)量。 三
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是通過(guò)分子生物方法提高surfactin合成酶基因簇的表達(dá)，獲得 surfactin產(chǎn)量提高的枯草芽孢桿菌菌株。 技術(shù)方案本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)克隆枯草芽孢桿菌fmbR基因組DNA的surfactin的一個(gè)合 成酶srfA-A基因(圖1所示)5，端帶有啟動(dòng)子Psrf的同源片段，其序列為SEQ ID NO.l， 大小1081bp，并將該片段連接到pMUTIN4載體上，然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌fmbR,并 通過(guò)紅霉素抗性篩選得到的一株啟動(dòng)子發(fā)生置換的菌株。最終通過(guò)高效液相檢測(cè) surfactin產(chǎn)量。獲得surfactin產(chǎn)量提高的菌株。上述方法所獲得的枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子Pspac置換菌株的DNA序列為SEQ ID N0.2?？莶菅挎邨U菌啟動(dòng)子Pspac置換菌株的鑒定方法，包括，設(shè)計(jì)引物， 上游弓l物5，-TTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTG-3; 下游引物5，- TGAGTTTCCCAGTATCCC -3， 以啟動(dòng)子Pspac置換的菌株基因組DNA為模板，在100nl體系中，引物終濃度各 為lpM，dNTPs終濃度為0.2mM,枯草芽孢桿菌基因組DNA10ng,4U pfU DNA聚合 酶；擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 2min;30個(gè)循環(huán)94°C 50s，53。C 50s,72。C 1， 30min; 72°C 10min;將回收的PCR產(chǎn)物與TaKaRa公司pMD19-T vector連接，轉(zhuǎn)化DH5a，涂 于含有IPTG、 X-gal、氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)13-14小時(shí)，挑白色菌落， 振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測(cè)序，如果擴(kuò)增得到大小約1344bp的DNA片段即SEQ ID N0.2，即啟動(dòng)子Pspac片段和枯草芽孢桿菌fmbR surfactin合成酶基因5，端部分DNA 片段連接到一起，并整合到野生枯草芽孢桿菌finbR的基因組DNA中的DNA片段， 則為枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子pSpac置換菌株。有益效果迄今為止，人們已經(jīng)采用同源整合技術(shù)已經(jīng)采用強(qiáng)啟動(dòng)子repU置換了 iturin和 mycosubtilin的啟動(dòng)子，并最終獲得該抗菌肽產(chǎn)量提高的菌株。本發(fā)明人通過(guò)同源整 合技術(shù)獲得的啟動(dòng)子Pspac置換surfactin合成酶原來(lái)啟動(dòng)子的枯草芽孢桿菌菌株，在 國(guó)際中首次報(bào)道通過(guò)同源整合技術(shù)獲得surfactin產(chǎn)量提高的菌株。本發(fā)明通過(guò)PCR技術(shù)從本實(shí)驗(yàn)室保存的枯草芽孢桿菌菌株finbR基因組中擴(kuò)增得 到surfactin合成酶基因的長(zhǎng)約1081bp的同源片段，在該同源片段兩端分別加上Hind III和BamH I限制酶識(shí)別序列，與經(jīng)相同限制酶消化的pMUTIN4連接并轉(zhuǎn)化枯草芽 孢桿菌fmbR，獲得了強(qiáng)啟動(dòng)子置換的菌株。通過(guò)牛津杯法和高效液相技術(shù)檢測(cè) surfactin產(chǎn)量提高的菌株。在沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)情況下，surfactin產(chǎn)量提高約4.85倍，在300 u M IPTG誘導(dǎo)情況下，surfactin產(chǎn)量約提高10倍。利用本發(fā)明獲得surfactin產(chǎn)量提高菌株的方法，具有直接的目的性，可以直接從 遺傳上改良抗菌肽生產(chǎn)菌株，在工業(yè)上具潛在的應(yīng)用價(jià)值。四

圖1 Surfactin合成酶的操縱子結(jié)構(gòu)2啟動(dòng)子Pspac置換surfactin合成酶基因原來(lái)啟動(dòng)子的原理圖 (Pspac:啟動(dòng)子Pspac， srf':從枯草芽孢桿菌fmbR中擴(kuò)增并連接到質(zhì)粒pMUTIN4 上的1081bp的DNA片段，Psrf: surfactin合成酶基因原來(lái)的啟動(dòng)子，srf:基因組中srf， 的同源序列，lacl:啟動(dòng)子Pspac的抑制基因)。五具體實(shí)施方式
本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)是通過(guò)克隆枯草芽孢桿菌fmbR (別小妹等.5a"7/w ra^7/s fmbR 抗菌物質(zhì)的分離和鑒定.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006,(11): 2327-2334)基因組DNA的surfactin 的一個(gè)合成酶srfA-A基因(圖1所示)5'端帶有啟動(dòng)子Psrf的同源片段(SEQ ID NO.l)，大小為1081bp，并將該片段連接到帶有啟動(dòng)子的pMUTIN4載體上，然后轉(zhuǎn) 化枯草芽孢桿菌fmbR,并通過(guò)紅霉素抗性篩選得到啟動(dòng)子發(fā)生置換的菌株。最終通過(guò) 高效液相檢測(cè)surfactin產(chǎn)量，從而獲得surfactin產(chǎn)量提高的置換菌株。 ( 一 )含有啟動(dòng)子Pspac的載體pMUTIN4 選擇帶有IPTG誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子Pspac的載體pMUTIN4(購(gòu)自BGSC)構(gòu)建同源整 合載體，該載體pMUTIN4上啟動(dòng)子Pspac下游有一個(gè)多克隆位點(diǎn)，在這個(gè)多克隆位 點(diǎn)連接上同源片段(SEQIDNO.l)，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，載體上的同源片段和枯草芽 孢桿菌基因組上相應(yīng)DNA片段發(fā)生單交換，使同源片段以及下游的基因處于啟動(dòng)子 Pspac的控制之下，從而可以得到啟動(dòng)子置換菌株。 (二) surfactin合成酶基因同源片段的的克隆 將枯草芽孢桿菌fmbR培養(yǎng)液(別小妹等.5a"7/M fmbR抗菌物質(zhì)的分離和鑒定.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,(11): 2327-2334)離心收集菌體，用上海生物工程公司基 因組DNA試劑盒提取基因組DNA。參考Genbank (編號(hào)D13262)中枯草芽孢桿菌168的surfactin基因序列，利用 primer primier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)枯草芽孢桿菌surfactin合成酶基因引物序列， 上游引物5'-cccaagc微cggctgttagttcata-3， HindIII 下游引物5'國(guó)cggatccgtttggtggcgaagtgtct國(guó)3, BamH I 由上海生工合成。在lOOpl體系中，引物終濃度各為lpM,dNTPs終濃度為0.2mM,枯草芽孢桿菌 fmbR基因組DNA10ng，4U pfu DNA聚合酶。擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 2min;30X(94°C 50s,53°C 50s，72°C 1: 30min);72。C 10min。瓊脂糖凝膠電泳，切膠，采用上海生工試劑 盒回收，將回收的PCR產(chǎn)物與TaKaRa公司pMD19-T vector連接，轉(zhuǎn)化co// DH5a， 涂于含有IPTG、 X-gal、氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)13-14小時(shí)，挑白色菌落，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，確定連接成功后送到金斯特公司測(cè)序。用計(jì)算機(jī)分析測(cè)序結(jié)果， 獲得一個(gè)長(zhǎng)1081bp的surfactin合成酶基因同源片段SEQ ID NO.l，即枯草芽孢桿菌 surfactin合成酶基因5'端部分片段。(二) 同源整合載體的構(gòu)建將PCR產(chǎn)物純化后，加HindIII、 BamHI雙酶切，PCR產(chǎn)物重新回收，ddH20重 溶，與適量的HindIII、 BamHl限制酶消化的載體pMUTIN4(購(gòu)自BGSC)連接，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌TOP10F (購(gòu)自深圳勤寶升公司),從轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取幾個(gè)菌落，接入LB 液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)，小量提取質(zhì)粒，電泳，以電泳滯后的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 驗(yàn)證，確定連接成功后送到金斯特公司測(cè)序，獲得同源整合載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 TOP10F。(三) 同源整合載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌野生菌株fmbR將同源整合載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌TOP10F在37'C培養(yǎng)10-11小時(shí)后挑取小菌落,接 入含有氨芐青霉素的50ml LB液體培養(yǎng)基,70-90rpm 3(TC培養(yǎng)過(guò)夜,采用質(zhì)粒提取試劑 盒(購(gòu)自上海生工)提取同源整合載體質(zhì)粒，作為轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌fmbR用?？莶菅?孢桿菌電轉(zhuǎn)化方法如下1、 感受態(tài)細(xì)胞的準(zhǔn)備過(guò)夜培養(yǎng)菌體，稀釋16倍置于生長(zhǎng)培養(yǎng)基(LB含有0.5M的山梨醇)，37'C培養(yǎng) 至OD600為0.85-0.95，將菌體細(xì)胞在冰水中冷凍10分鐘。4。C5000xG離心5分鐘 收集菌體細(xì)胞，在冰冷的電轉(zhuǎn)化液中洗四次。(0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%的甘 油)。用培養(yǎng)量的1/40電轉(zhuǎn)化液重新懸浮菌體細(xì)胞。使細(xì)胞濃度達(dá)到1-1.3 x 1010cfii/ml;2、 轉(zhuǎn)化在60uL感受態(tài)細(xì)胞中加如lixL (50ng克/yL) DNA，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中(lmm的 電擊杯)，保溫1-1.5分鐘，加電壓25uF、 200Q。時(shí)間4.5-5.0ms。釋放電壓后，立 即象轉(zhuǎn)化過(guò)的細(xì)胞中加入lmL恢復(fù)培養(yǎng)基(LB含0.5M山梨醇、0.38M甘露醇)。在 37。C培養(yǎng)3h后，置于選擇培養(yǎng)基上篩選。37。C過(guò)夜培養(yǎng)。獲得同源整合載體轉(zhuǎn)化的 枯草芽孢桿菌fmbR菌株，即啟動(dòng)子Pspac置換的菌株。(四) 啟動(dòng)子置換菌株的鑒定方法參考Genbank中枯草芽孢桿菌168的surfactin合成酶操縱子基因序列(編號(hào) D13262)(1285bp)和質(zhì)粒pMUTIN2上啟動(dòng)子Pspac的序列(編號(hào)AF072806) (59bp), 利用primer primier 5.0軟件自行設(shè)計(jì)啟動(dòng)子Pspac DNA序列(59bp)和枯草芽孢桿 菌surfactin合成酶基因部分DNA序列(1285bp)引物。上游引物5，- TTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTG -3;下游引物5，- TGAGTTTCCCAGTATCCC隱3 ， 以啟動(dòng)子Pspac置換的菌株基因組DNA為模板，在100pl體系中，引物終濃度各 為lpM,dNTPs終濃度為0.2mM，枯草芽孢桿菌基因組DNA10ng,4U pfii DNA聚合酶。擴(kuò)增程序?yàn)?4。C 2min;30X(94。C 50s,53。C 50s，72。C 1: 30min);72。C 10min。將回收的PCR產(chǎn)物與TaKaRa公司pMD19-T vector連接，轉(zhuǎn)化五.co/z' DH5a， 涂于含有IPTG、 X-gal、氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)13-14小時(shí)，挑白色菌 落，振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，確定連接成功后送到金斯特公司測(cè)序。用計(jì)算機(jī)分析測(cè) 序結(jié)果，擴(kuò)增得到大小約1344bp的DNA片段(SEQIDN0.2)，即啟動(dòng)子Pspac片 段和枯草芽孢桿菌fmbR surfactin合成酶基因5'端部分DNA片段連接到一起，并整 合到野生枯草芽孢桿菌fmbR的基因組DNA中的DNA片段。從而使surfactin合成 酶基因置于啟動(dòng)子Pspac的控制之下。(五) 啟動(dòng)子置換的菌株fmbR脂肽類抗生素surfactin的發(fā)酵和提取5.1菌株抗菌物質(zhì)的發(fā)酵將種子液以5%濃度接種于Landy發(fā)酵培養(yǎng)基中，在 30 33。C和180rpm/min下培養(yǎng)33-35h，得抗菌物質(zhì)發(fā)酵液。5.2抗菌提取物的制備發(fā)酵液在11.000 g下離心15min除去菌體，用HC1將上 清夜調(diào)節(jié)pH至2，然后輕微攪動(dòng)或靜止過(guò)夜，離心收集沉淀，再用NaOH中和，加 入甲醇抽提幾次，獲得抗菌提取物。(六) 啟動(dòng)子置換菌株fmbR surfactin產(chǎn)量的提高按照(五)所述的方法同時(shí)對(duì)finbR野生菌和啟動(dòng)子置換菌株發(fā)酵并提取抗菌物 質(zhì)，并通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)surfactin的產(chǎn)量，最終獲得產(chǎn)surfactin的啟動(dòng)子置換菌 株在沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)的情況下為1597.01 ±3.55mg/L，在300 u M IPTG誘導(dǎo)的情況 下為3860.10±88.10mg/L。野生菌為355.91 ± 11.29mg/L。 即在沒(méi)有IPTG誘導(dǎo)情 況下，surfactin產(chǎn)量提高約4.85倍，在300 u M IPTG誘導(dǎo)情況下，surfactin產(chǎn)量約提 高10倍。序列表<110><120><130><140><141><160><170><210><211><212><213><220><221><222><223><400>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)一種提高枯草芽孢桿菌surfactin產(chǎn)量的啟動(dòng)子置換方法說(shuō)明書(shū)002008-11-03 6Patentln version 3.11腿 DNA PCR擴(kuò)增surfactin合成酶基因同源片段 (l)..(廳)160120180 240 300 360 420 480540600660 720 780840 卯0tttcggctgt tagttcataa gaattaaaag ctgatatgga taagaaagag aaaatgcgtt gcacatgttc actgcttata aagattaggg gaggtatgac aatatggaaa taacttttta ccctttaacg gatgcacaaa aacgaatttg gtacacagaa aaattttatc ctcacacgag catttcaaat cttgcgggga ttggtaagct ggtttcagct gatgcgattg attatgtgct tgttgagcag gcgattcaag agtttattcg cagaaatgac gccatgcgcc ttcggttgcg gctagatgaa aacggggagc ctgttcaata tattagcgag tatcggcctg ttgatataaa acatactgac actactgaag atccgaatgc gatagagttt atttcacaat ggagccggga ggaaacgaag aaacctttgc cgctatacga ttgtgatttg ttccgttttt ccttgttcac cataaaggaa aatgaagtgt gg加acgc aaatgttcat cacgtgattt ctgatggtat ctccatgaat attctcggga atgcgatcat gcacatttat ttagaattag ccagcgcgtc agagacaaaa gaaggaatct cgcattcatt tatcgatcat gttttatctg aacaggaata tgctcaatcg aagcggtttg aaaaggacaa ggcgttttgg aacaaacaat ttgaatcggt gcctgaactt gtttccttga aacggaatgc atccgcaggg ggaagtttag atgctgagag gttctctaaa gatgtgcctg aagcgcttca tcagcagatt ctgtcgtttt gtgaggcgaa taaagtcagt gttctttcgg tatttcaatc gctgctcgcc gcctatttgt acagggtcag cggccagaat gatgttgtga cgggaacatt tatgggcaac cggacaaatg cgaaagagaa 960 gcagatgctt ggcatgtttg tttctacggt tccgcttcgg acaaacattg acggcgggca 1020 ggcgttttca gaatttgtca aagaccggat gaaggatctg atgaagacac ttcgccacca1080<210> 2 <211> 28 <212> DNA <213>人工合成 <400> 2cccaagcttt ttcggctgtt agttcata 28 <210> 3 26DNA人工合成 3cggatccgtt tggtggcgaa gtgtct 26 <210> 4 <211> 1344 <212> DNA1081<211> <212> <213〉 <400><213> PCR擴(kuò)增 <400> 4ttgttgactt tatctacaag gtgtggcata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60tcggctgtta gttcataaga attaaaagct gatatggata agaaagagaa aatgcgttgc 120acatgttcac tgcttataaa gattagggga ggtatgacaa tatggaaata actttttatc 180ctttaacgga tgcacaaaaa cgaatttggt acacagaaaa attttatcct cacacgagca 240tttcaaatct tgcggggatt ggtaagctgg tttcagctga tgcgattgat tatgtgcttg 300ttgagcaggc gattcaagag tttattcgca gaaatgacgc catgcgcctt cggttgcggc 360tagatgaaaa cggggagcct gtacaatata ttagcgagta tcggcctgtt gatataaaac 420atactgacac tactgaagat ccgaatgcga tagagtttat ttcacaatgg agccgggagg 480 aaacgaaaaa acctttgccg ttgtaegatt gtgatttatt ccgtttttcc ttgttcacca 540taaaggaaaa tgaagtatgg ttttacgcaa atgttcatca cgtgatttct gatggtatct 600ccatgaatat tctcgggaat gcgatcatgc acatttattt agaattagcc agcggctcag 660aggcaaaaga aggaatctcg cattcattta tcgatcatgt tttatctgaa caggactatg 720ctcaatcgaa gcggtttgaa aaggacaagg cgttttggaa caaacaattt gaatcggtgc 780ctgaacttgt ttccttgaaa cggaatgcat ccgcaggggg aagtttagat gccgagaggt 840tctctaaaga tgtgcctgaa gcgcttcatc agcagattct gtcgttttgt gaggcgaata 900aagtcagtgt tctttcggta tttcaatcgt tgctcgccgc ctacttgtac agggtcagcg 960 gccagaatga tgttgtgacg ggaaccttta tgggcaaccg gacaaatgcg aaagagaagc1020agatgcttgg catgtttgtt tctacggttc cgcttcggac aaacattgac ggcgggcagg cgtttttaga atttgtcaaa gaccggatga aggatctcat gaagacactc cgccaccaaa agtacccgta taatctcctg atcaacgatt tgcgtgaaac aaagagctct ctgaccaagc tgtttactgt ttctcttgaa tatcaagtga tgcagtggca gaaagaagag gatcttgcct ttttgactga gccgattttc agcggcagcg gattaaatga tgtctcaatt catgtaaagg atcgatggga tactgggaaa ctca <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213>人工合成 <400> 5ttgttgactt tatctacaag gtgtg <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213>人工合成 <400> 6 tgagtttccc agtatccc1080 1140 1200 1260 132013442518
權(quán)利要求
1、一種提高枯草芽孢桿菌surfactin產(chǎn)量的啟動(dòng)子置換方法，是通過(guò)克隆野生型枯草芽孢桿菌基因組DNA的surfactin的一個(gè)合成酶srfA-A基因5’端帶有啟動(dòng)子Psrf的同源片段，其序列為SEQ ID NO.1，大小1081bp，并將該片段連接到帶有啟動(dòng)子Pspacp的MUTIN4載體上，然后轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，獲得surfactin產(chǎn)量提高的菌株。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種提高枯草芽孢桿菌surfactin產(chǎn)量的啟動(dòng)子置換方法， 特征在于，所用野生型枯草芽孢桿菌為枯草芽孢桿菌fmbR。
3、 權(quán)利要求2所述一種提高枯草芽孢桿菌surfactin產(chǎn)量的啟動(dòng)子置換方法獲得的 枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子置換菌株的同源片段為SEQIDNO.l。
4、 權(quán)利要求2所述一種提高枯草芽孢桿菌surfactin產(chǎn)量的啟動(dòng)子置換方法所獲得 的枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子Pspac置換菌株的DNA序列為SEQ ID N0.2。
5、 權(quán)利要求2所述方法所獲得的枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子Pspac置換菌株的鑒定方法， 包括，設(shè)計(jì)引物，上游引物5，- TTGTTGACTTTATCTACAAGGTGTG-3;下游引物5，-TGAGTTTCCCAGTATCCC-3， 以啟動(dòng)子Pspac置換的菌株基因組DNA為模板，在100ul體系中，引物終濃度各 為lpM,dNTPs終濃度為0.2mM,枯草芽孢桿菌基因組DNA10ng,4U pfo DNA聚合 酶；擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 2min;30個(gè)循環(huán):94°C 50s,53°C 50s，72°C 1， 30min; 72°C 10min; 將回收的PCR產(chǎn)物與TaKaRa公司pMD19-T vector連接，轉(zhuǎn)化co" DH5a，涂 于含有IPTG、 X-gal、氨芐青霉素的LB平板，37°C培養(yǎng)13-14小時(shí)，挑白色菌落， 振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測(cè)序，如果擴(kuò)增得到大小約1344bp的DNA片段即SEQ ID N0.2，即啟動(dòng)子Pspac片段和枯草芽孢桿菌fmbR surfactin合成酶基因5'端部分DNA 片段連接到一起，并整合到野生枯草芽孢桿菌fmbR的基因組DNA中的DNA片段， 則為枯草芽孢桿菌啟動(dòng)子PSpac置換菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高枯草芽孢桿菌surfactin產(chǎn)量的啟動(dòng)子置換方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。采用DNA同源整合技術(shù)使啟動(dòng)子Pspac置換枯草芽孢桿菌fmbR surfactin合成酶基因本身的啟動(dòng)子。通過(guò)PCR方法從fmbR菌株基因組中擴(kuò)增得到1081bp的同源序列，連接到質(zhì)粒pMUTIN4的HindIII和BamH I酶切位點(diǎn)上，并將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到野生枯草芽孢桿菌fmbR中，經(jīng)過(guò)抗生素培養(yǎng)基篩選并通過(guò)分子生物學(xué)方法鑒定獲得。本發(fā)明方法可以直接從遺傳上改良抗菌肽生產(chǎn)菌株，在工業(yè)上具潛在的應(yīng)用價(jià)值。菌株surfactin產(chǎn)量提高約4.85倍，在IPTG誘導(dǎo)下，surfactin產(chǎn)量約提高10倍。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101402959SQ20081023513
公開(kāi)日2009年4月8日 申請(qǐng)日期2008年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日
發(fā)明者別小妹, 呂鳳霞, 孫會(huì)剛, 林 曹, 煜 王, 陸兆新 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)