專利名稱：：表達(dá)抗傳染性法氏囊病病毒微小rna重組禽腺聯(lián)病毒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程和生物制品研究領(lǐng)域。具體涉及一種表達(dá)抗傳染性法氏囊病病毒微小RNA重組禽腺聯(lián)病毒的制備方法。
背景技術(shù)：
：RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是近年來(lái)快速發(fā)展的一種序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術(shù),在功能基因組研究、新藥開發(fā)、癌癥治療和抗病毒感染等方面具有廣泛的應(yīng)用。在抗病毒感染方面，現(xiàn)有的研究資料顯示，RNAi幾乎能不同程度地抑制所有病毒(包括DNA和RNA病毒)的復(fù)制。具有RNAi作用的干擾RNA包括短干擾RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)。目前獲得siRNA或miRNA的方法主要有化學(xué)合成法、體外轉(zhuǎn)錄法和載體表達(dá)法。其中，人工合成的siRNA能獲得滿意的基因沉默效果，但其合成成本昂貴且作用時(shí)間短暫；質(zhì)粒載體表達(dá)siRNA或miRNA的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，表達(dá)載體易于大規(guī)模制備且費(fèi)用較低，是目前最常用的方法，但表達(dá)的siRNA或miRNA的抑制作用受細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的限制。腺聯(lián)病毒(AAV)是一類復(fù)制缺陷型DNA病毒，需在腺病毒等輔助病毒存在下才能復(fù)制和增殖。作為基因轉(zhuǎn)移載體，AAV具有無(wú)致病性、免疫原性低、細(xì)胞感染譜廣和外源基因表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，是很有應(yīng)用前景的基因轉(zhuǎn)移載體。哺乳動(dòng)物的AAV已被用做siRNA或miRNA的傳遞載體，表達(dá)時(shí)間及基因沉默作用能維持?jǐn)?shù)月之久，有的已進(jìn)入人體臨床試驗(yàn)。禽腺聯(lián)病毒(AAAV)具有與哺乳動(dòng)物AAV類似的潛伏感染特性和基因組結(jié)構(gòu)，已被證明能在禽源細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)外源基因，但尚無(wú)用AAAV傳遞抗禽病毒siRNA或miRNA的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于建立能用于雞體內(nèi)外試驗(yàn)、通用表達(dá)抗禽病毒miRNA重組AAAV的制備和使用方法。發(fā)明的技術(shù)方案包括siRNA的選擇、短發(fā)夾雙鏈寡核苷酸的合成與克隆、含RNAi表達(dá)盒AAAV轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建、表達(dá)miRNA重組AAAV的制備以及抑制病毒復(fù)制效果的檢測(cè)a、siRNA的選擇用GenScrriptCorporation(http:〃www.genscript.com)的siRNA分析軟件siRNATargetFinder分析雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)序列，獲得針對(duì)不同毒株VP1或VP2基因保守區(qū)的候選siRNA;b、短發(fā)夾寡核苷酸的合成與克隆根據(jù)禽源細(xì)胞RNAi專用載體pRFPRNAiC說(shuō)明書，用通用引物和DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)合成短發(fā)夾寡核苷酸，將PCR產(chǎn)物定向克隆入pRFPRNAiC載體；c、含RNAi表達(dá)盒AAAV轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建用限制酶尸m/1和萬(wàn)smBI消化含AAAV全基因組的pCR-AAAV載體，電泳分離后回收包括兩端ITR的4.1kb載體片段，用Klenow酶補(bǔ)平；用限制酶&/I和BamHI雙酶切含RNAi表達(dá)盒的pRFPRNAiC載體，電泳分離后回收RNAi表達(dá)盒，經(jīng)Klenow酶補(bǔ)平后與AAAV轉(zhuǎn)移載體片段連接，獲得含RNAi表達(dá)盒的重組AAAV轉(zhuǎn)移載體；d、表達(dá)miRNA重組AAAV的制備將含RNAi表達(dá)盒的重組AAAV轉(zhuǎn)移載體、AAAV輔助載體pcDNA-ARC和腺病毒輔助載體pHelper組成三質(zhì)粒系統(tǒng)，用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72h收獲細(xì)胞，-2(TC/37。C凍融4次后，用氯仿抽提和聚乙二醇沉淀重組病毒。在上述步驟d中，利用重組AAAV轉(zhuǎn)移載體、AAAV輔助載體pcDNA-ARC和腺病毒輔助載體pHelper共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，產(chǎn)生的純化重組AAAV的感染性滴度大于5xl()S病毒顆粒/毫升。抑制病毒復(fù)制效果的檢測(cè)以10病毒顆粒/細(xì)胞的劑量，用重組AAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)雞DF-1細(xì)胞系，轉(zhuǎn)導(dǎo)后48h用IBDV感染，感染后24h用半定量RT-PCR、50%組織細(xì)胞感染劑量(TCID5Q)測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)中的IBDV滴度。利用重組病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)雞細(xì)胞，對(duì)IBDV基因表達(dá)的抑制效率大于90%，能使IBDV的TCID5Q降低71g以上；在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，這種抑制作用至少維持96h，具有嚴(yán)格的序列特異性；不僅可用于抗IBDVmiRNA的表達(dá)，也可以用于抗其它禽病毒miRNA的表達(dá)；不僅可用于體外試驗(yàn)，還可作為抗禽病毒感染的新型生物制劑進(jìn)行開發(fā)。本發(fā)明中，用GenScrriptCorporation的siRNATargetFinder軟件分析IBDV序列，是因?yàn)樵摴臼翘峁㏑NAi產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)的專業(yè)公司，用其軟件預(yù)測(cè)siRNA的可靠性已被我們和其他人的實(shí)驗(yàn)證實(shí)；用pRFPRNAiC作為miRNA的表達(dá)載體，是因?yàn)樵撦d體專為禽源細(xì)胞RNAi試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可同時(shí)表達(dá)針對(duì)相同或不同病毒(基因)的兩個(gè)miRNA，而目前常用的含人或鼠HI或U6啟動(dòng)子的其它RNAi載體不能在禽源細(xì)胞有效表達(dá)siRNA或miRNA;將mIRNA表達(dá)盒插在AAAV轉(zhuǎn)移載體的ITR之間，構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移載體可作為單獨(dú)或同時(shí)表達(dá)不同miRNA的通用載體；用含miRNA表達(dá)盒的AAAV轉(zhuǎn)移載體、AAAV輔助載體pcDNA-ARC和腺病毒輔助載體pHelper組成的三質(zhì)粒系統(tǒng)轉(zhuǎn)染法，可在禽源細(xì)胞中有效產(chǎn)生重組AAAV;產(chǎn)生的重組AAAV能在禽源細(xì)胞中有效表達(dá)miRNA，表達(dá)的miRNA能特異、持久地抑制IBDV復(fù)制和基因表達(dá)。與現(xiàn)有的其他技術(shù)相比，以AAAV作為miRNA傳送載體不僅能在禽源細(xì)胞中有效、持久地表達(dá)miRNA，而且對(duì)家禽無(wú)任何致病作用，不僅可用于體外實(shí)驗(yàn)，而且可作為抗禽病毒感染的新型生物制劑進(jìn)行開發(fā)。圖1為miRNA表達(dá)重組載體的結(jié)構(gòu)示意圖。Amp代表氨卞青霉素抗性基因；PACTiN代表雞肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子；RFP代表紅色熒光蛋白基因；polyA代表轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)；U6為雞U6啟動(dòng)子；27ntU6leader為U6前導(dǎo)序歹ij;miRNAflank為miRNA30樣側(cè)翼序歹!j;polIIIterminator為miRNA轉(zhuǎn)錄終止序歹U。圖2為miRNA表達(dá)AAAV轉(zhuǎn)移載體的結(jié)構(gòu)示意圖。pAITR-RFP-miRNA分另ij代表pAITR-RFP-miVPl、pAITR-RFP-miVP2E和pAITR-RFP-miVP2con;Amp代表氨卞青霉素抗性基因；ITR代表AAAV末端反轉(zhuǎn)重復(fù)序列；RFP代表紅色熒光蛋白基因表達(dá)盒；RNAi代表miVPl、miVP2E和miVP2con表達(dá)盒。圖3為重組AAAV的電鏡照片。圖4為重組AAAV感染DF-1細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。圖5為重組AAAV中miRNA表達(dá)盒的PCR檢測(cè)結(jié)果。M代表DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為pRFPRNAiC載體作為陰性對(duì)照；2為pRFPRNAiVP2E載體陽(yáng)性對(duì)照；3為AAAV-RFP-miVP2E;4為AAAV-RFP-miVPl;5為AAAV-RFP-miVP2con;6為AAAV-RFP。圖6為miRNA抑制IBDV基因表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果。圖7為miRNA抑制同源株IBDV復(fù)制的TCID5。檢測(cè)結(jié)果。圖8為miRNA抑制同源株IBDV復(fù)制的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果。圖9為miRNA抑制異源株IBDV復(fù)制的TCID5o檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施例方式載體來(lái)源pRFPRNAiC載體從英國(guó)ARK-GENOMICS公司引進(jìn)。(文獻(xiàn)Das，R.Metal.DevelopmentalBiology,2006,294:554-563)pCR-AAAV載體揚(yáng)州大學(xué)孫懷昌實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。(文獻(xiàn)王建業(yè)等.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2005，26:1-4)pcDNA-ARC:揚(yáng)州大學(xué)孫懷昌實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。(Wang,A.P.etal.ChineseJournalofVirology,2007,23:292-297)pEGFP-Nl:從美國(guó)BDBiosciencesClontech公司引進(jìn)。(GenBankAccession#U55762;Catalog#6085-1;PT3027-5)pHelper:從美國(guó)Stratagene公司引進(jìn)。(文獻(xiàn)Matsushita,T.,etal.GeneTherapy,1998，5:938-945)具體操作步驟如下一、siRNA的選擇用GenScriptCorporation(http:〃www.genscript.com)的siRNATargetFinder軟件及使用方法分析IBDVVP1基因序列(GenBank登錄號(hào)AY918947),選擇其中1個(gè)(命名為miVPl)進(jìn)行本試驗(yàn)，其序列(5'-GTACCCAGAAGTCAAGAAC-3')與已報(bào)道的能有效抑制IBDV復(fù)制的抗VP1干擾RNA相同(參考文獻(xiàn)1:以DNA載體為基礎(chǔ)的有效抑制傳染性法氏囊病病毒的體外復(fù)制.抗病毒研究，2008,79(2),87-94.EffectiveinhibitionofinfectiousbursaldiseasevirusreplicationinvitrobyDNAvector-basedRNAinterference.AntiviralResearch,2008,79(2),87-94.)。用同樣方法分析IBDVVP2基因序列(GenBank登錄號(hào)AY918948),獲得10個(gè)候選siRNA。選擇其中1個(gè)siRNA(命名miVP2E)和1個(gè)對(duì)照siRNA(miVP2con)進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)，序列分別為miVP2E:5'-ACAGCCAATCACATCCATCAAA-3';miVP2con:5'-ACGTCTACCCTATAGGCTATGA畫3'。二、短發(fā)夾寡核苷酸的合成與克隆根據(jù)禽源細(xì)胞RNAi載體pRFPRNAiC(ARK-GENOMICS，UK)說(shuō)明書，設(shè)計(jì)針對(duì)miVPl、miVP2E和miVP2con的雙鏈寡核苷酸，序列如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>分別取每對(duì)寡核苷酸各3pg溶于48pl退火緩沖液(lOmMTris.HCI，100mMNaCl，pH7.4)中，經(jīng)90°C/4min—70°C/10min—37°C/15min退火后，自然冷卻至室溫獲得雙鏈shRNA。將短發(fā)夾雙鏈寡核苷酸定向克隆入pRFPRNAiC載體的BglII和HindIII位點(diǎn)，獲得的重組載體分別命名為pRFPRNAmiVPl、pRFPRNAmiVP2E和pRFPRNAmiVP2con(圖1)。三、含RNAi表達(dá)盒AAAV轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建先后用限制酶PmlI和BsmBI消化含AAAV全基因組的pCR-AAAV載體(參考文獻(xiàn)2:禽腺聯(lián)病毒的分離及基因組鑒定.揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào),2005,26(2):1-4。)，經(jīng)USA)回收含AAAV左右ITR的4.1kb載體片段(命名為pAITR)，用常規(guī)的Klenow酶將兩端補(bǔ)平；用限制酶SalI和BamHI將miRNA表達(dá)盒與RFP表達(dá)盒一起從pRFPRNAmiVPl、pRFPRNAmiVP2E和pRFPRNAmiVP2con載體上切下，經(jīng)Klenow酶補(bǔ)平后，與AAAV載體片段連接，連接產(chǎn)物用常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，獲得的重組轉(zhuǎn)移載體分別命名為pAITR-RFP-miVP2E、pAITR-RFP-miVP2con和pAITR-RFP-miVPl(圖2)。用限制酶SalI和DmI消化pRFPRNAiC載體，切下的RFP表達(dá)盒經(jīng)電泳分離、凝膠回收和末端補(bǔ)平后，與AAAV轉(zhuǎn)移載體pAITR連接，獲得的對(duì)照轉(zhuǎn)移載體命名為pAITR-RFP(圖2)。四、表達(dá)miRNA重組AAAV的制備分別將重組載體pAITR-RFP-miVPl、pAITR-RFPmiVP2E、PAITR-RFP-miVP2con和pAITR-RFP與AAAV輔助載體pcDNA-ARC(表達(dá)綠色熒光蛋白報(bào)告基因重組禽腺聯(lián)病毒的構(gòu)建與鑒定.病毒學(xué)報(bào)，2007,23(4):292-297)和腺病毒輔助載體pHelper(Stratagene)組成三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(參考文獻(xiàn)3:不需輔助病毒的腺聯(lián)病毒載體有效制備方法.基因療法，1998，5:938-945.Adeno-associatedvirusvectorscanbeefficientlyproducedwithouthelpervirus.GeneTher,1998，5:938-945)，用常規(guī)的磷酸l^沉淀法共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞(Stratagene),轉(zhuǎn)染后72h收獲細(xì)胞，于-20。C乙醇浴/37。C水浴反復(fù)凍融4次，10000rpm離心10min，收集的上清液即為重組AAAV病毒液。用氯仿抽提和聚乙二醇沉淀法獲得1000倍濃縮的純化重組病毒。(參考文獻(xiàn)4:一種快速高效分離和純化重組腺病毒伴隨病毒載體的方法.科學(xué)通報(bào)，2000，45:2071-2075)五、重組AAAV的鑒定將50pi初步純化的重組AAAV滴在支持膜的銅網(wǎng)上，10min后用濾紙吸去多余液體，滴加3X磷鎢酸溶液(pH6.0)染色2-3min，立即進(jìn)行透射電鏡觀察，觀察到的重組AAAV形態(tài)如圖3所示。將DF-1細(xì)胞接種24孔培養(yǎng)板，lxl()S細(xì)胞/L，以含10。/。犢牛血清(FCS)的DMEM為培養(yǎng)液，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；次日吸棄培養(yǎng)液，每孔細(xì)胞接種200^il未純化的重組AAAV，37°C、5%C02孵育2h后，每孔補(bǔ)加300^含10%FCS的DMEM和終濃度為10mmol/L的丁酸鈉，37°C、5G/oC02孵育48h后，直接在熒光顯微鏡下觀察，觀察到的RFP陽(yáng)性細(xì)胞如圖4所示，說(shuō)明重組AAAV對(duì)禽細(xì)胞具有感染性。將DF-1細(xì)胞按口104細(xì)胞/孔的密度接種96孔培養(yǎng)板，以含10%FCS的DMEM為培養(yǎng)液，37°C、5。/。C02培養(yǎng)過(guò)夜后，用含2%FCS的DMEM將純化的重組AAAV做連續(xù)倍比稀釋，每孔細(xì)胞接種50^d，37。C孵育2h，每孔補(bǔ)加50^1含10%FCS的DMEM,繼續(xù)孵育48h，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)各孔紅色熒光陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算重組AAAV的感染性滴度為每毫升5X1()S個(gè)病毒顆粒。按照(參考文獻(xiàn)5:重組AAAV載體的制備.人類遺傳學(xué)最新分析程序,1996.Productionofrecombinantadeno-associatedviralvectors.In:DracopoliN,ed.CurrentProtocolsinHumanGenetics.NewYork:JohnWiley,1996)提取重組AAAV的病毒核酸，根據(jù)miRNA表達(dá)盒上、下游序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，正、反向序列分別為正向引物TCCCTCGACCTGCAGCCCAAGCTTGCGGCCGCGACAACACAAGCATCGAGCCC;反向引物CCGATTCATTAATGCAGCGGATCCATCGATAAAAAAGCTTACCGT。擴(kuò)增miRNA表達(dá)盒的50^1PCR體系為5pllOx緩沖液，2|al病毒核酸，15pmol正、反向引物，5UDNAPolymerase;30次循環(huán)PCR程序?yàn)?4。C/45s(第一循環(huán)為4min)，69°C/45s，72°C/lmin(最后一次循環(huán)為10min)。擴(kuò)增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見圖5，說(shuō)明重組AAAV基因組含有miRNA表達(dá)盒。六、miRNA抑制IBDV基因表達(dá)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)根據(jù)IBDVVP2基因序列(GenBank登錄號(hào)AY918948)設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，其序列分別為5'-CGAAGCTTATGACAAACCTGACAGATCAAAC-3'和5'-GCGTCGACCTCCTTATGGCCCGGATTATG國(guó)3'。以從IBDV感染DF-1細(xì)胞提取的RNA為模板，根據(jù)MMLVReverseTranscriptaseKit(BioBasicInc，USA)說(shuō)明書擴(kuò)增VP2cDNA。20^1反轉(zhuǎn)錄體系組成為4|igRNA,10pmol反向引物,40URNasin，10mmoldNTP和200U反轉(zhuǎn)錄酶。50piPCR反應(yīng)體系為4pi反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10pmol正反向引物，10mmoldNTP，1.5mMMgCl2和3UTaqDNA聚合酶。30個(gè)循環(huán)的PCR程序?yàn)?4°C熱變性45s(第一循環(huán)為4min,58°C退火90s，72°C延伸45s(最后1個(gè)循環(huán)為10min)。將PCR產(chǎn)物克隆入表達(dá)載體pEGFP-Nl(BDBiosciencesClontech,USA)的Hindlll/Sall位點(diǎn)，使其與載體中綠色熒光蛋白(EGFP)報(bào)告基因的5'端融合，獲得的報(bào)告載體命名為pVP2-EGFP。將DF-1細(xì)胞接種24孔培養(yǎng)板，"105細(xì)胞/孔，以含10%FCS的DMEM為培養(yǎng)液，在37t、5%C02培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為80%;棄去培養(yǎng)液，按照10個(gè)病毒顆粒/細(xì)胞劑量，用重組AAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，500pl/L;在感染后48h，按0.4pg/孔劑量用報(bào)告載體pVP2-EGFP轉(zhuǎn)染；在轉(zhuǎn)染后24、48、72、96h，按照常規(guī)胰酶消化法分散細(xì)胞，200g離心5min，收集的細(xì)胞用PBS離心洗滌3次(1000g離心5min)，最終用400h1PBS將細(xì)胞稀釋至1()6個(gè)細(xì)胞/ml，按照流式細(xì)胞儀(BDBiosciencesClontech,USA)說(shuō)明書檢測(cè)每孔3X104個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。與對(duì)照病毒AAAV-RFP-miVP2con或AAAV-RFP相比，AAAV-RFP-miVP2E轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的VP2基因表達(dá)抑制率為90.2%,而AAAV-RFP-miVPl轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的VP2基因表達(dá)未受抑制(圖6)，說(shuō)明重組病毒AAAV-RFP-miVP2E表達(dá)的miVP2E對(duì)VP2基因表達(dá)的抑制作用強(qiáng)且具有序列特異性。七、miRNA抑制同源株IBDV復(fù)制的TCID5o檢測(cè)將DF-1細(xì)胞接種24孔培養(yǎng)板，lxl()S細(xì)胞/孔，以含10%FCS的DMEM為培養(yǎng)液，在37'C、5%C02培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為80%;棄去培養(yǎng)液，按照10個(gè)病毒顆粒/細(xì)胞的劑量，用重組AAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(500pl/孔，37'C吸附2h);在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48h，每孔細(xì)胞以400TCID5Q劑量，用同源Lukert株IBDV感染(n=3);在感染后24、48、72、96h，分別取100jal細(xì)胞上清液，按照(參考文獻(xiàn)6:傳染性法氏囊病病毒抗原制備與免疫.獸醫(yī)研究雜志，1975,36:539-540.Infectiousbursaldiseasevirus:antigenproductionandimmunity./附36,539-540)進(jìn)行病毒TCID5。測(cè)定，以AAAV-RFP轉(zhuǎn)導(dǎo)組為對(duì)照，計(jì)算重組IBDV復(fù)制抑制率。結(jié)果與AAAV-RFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相比，從感染后24h起，AAAV-RFP-miVPl和AAAV-RFP-miVP2E轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的IBDV滴度分別下降71g，這種抑制作用至少持續(xù)96h，而AAAV-RFP-miVP2con轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的IBDV滴度無(wú)明顯下降(圖7)。八、miRNA抑制同源株IBDV復(fù)制的半定量RT-PCR檢測(cè)將DF-1細(xì)胞接種24孔培養(yǎng)板，lxl()S細(xì)胞/孔，以含10y。FCS的DMEM為培養(yǎng)液，在37"C、5%(:02培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為80%;棄去培養(yǎng)液，按照10個(gè)病毒顆粒/細(xì)胞的劑量，用重組AAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(500pl/孔，37t:吸附2h);在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48h，每孔細(xì)胞以400TCID5Q劑量，用同源Lukert株IBDV感染(n=3);在感染96h，收集各孔細(xì)胞，按照MMLVReverseTranscriptaseKit(BioBasicInc,USA)說(shuō)明書提取總RNA，以O(shè)ligo(dT)18為引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；然后以P-actin基因?yàn)閮?nèi)參，用半定量RT-PCR檢測(cè)IBDVVP2基因表達(dá)。擴(kuò)增VP2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR引物序列為正向引物5-ATGACAAACCTGACAGATCAAAC-3;反向引物5-CTCCTTATGGCCCGGATTATG-3。5(^1PCR反應(yīng)體系組成為4^1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，10pmol正、反向引物，10mmoldNTP混合物，1.5mMMgC12，3UTaqDNA聚合酶。擴(kuò)增VP2轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的30次循環(huán)的PCR程序?yàn)?4°C，45s(第一循環(huán)為4min);58°C,90s;72。C,45s(最后1循環(huán)為10min)。擴(kuò)增p-actin轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR引物序列為正向引物5-TTCTACAATGAGCTGAGAGTA-3;反向引物5-GAGGTAGTCCGTCAGGTCACG-3。擴(kuò)增(3-actin轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的23次循環(huán)的PCR程序?yàn)?4°C,45s(第一循環(huán)為4min);52°C，40s;72°C,40s(最后1循環(huán)為10min).反應(yīng)結(jié)束后，各取5^dPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0。/。瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)在溴乙錠染色后，用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度掃描，以P-actin條帶為參考，根據(jù)從重組AAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞擴(kuò)增的VP2條帶的灰度變化判斷miRNA對(duì)IBDV基因表達(dá)的抑制作用。結(jié)果與AAAV-RFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相比，AAAV-RFP-miVPl和AAAV-RFP-miVP2E轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中IBDVVP2基因表達(dá)的抑制率分別為89.6%和85.2%，這種抑制作用至少持續(xù)96h，而AAAV-RFP-miVP2con轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)IBDVVP2基因表達(dá)無(wú)抑制作用(圖8)。九、miRNA抑制異源株IBDV復(fù)制的TCID5q檢測(cè)將DF-1細(xì)胞接種24孔培養(yǎng)板，lxl()s細(xì)胞/孔，以含10%FCS的DMEM為培養(yǎng)液，在37'C、5%C02培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為80%;棄去培養(yǎng)液，按照10個(gè)病毒顆粒/細(xì)胞的劑量，用重組AAAV轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞(500ki1/L，37'C吸附2h);在轉(zhuǎn)導(dǎo)后48h，每孔細(xì)胞以400TCID5o劑量，用異源YEZ株或LYG株IBDV感染(n=3);在感染后24、48、72、96h，分別取細(xì)胞上清液，按照文獻(xiàn)6進(jìn)行病毒TCID5。測(cè)定，以AAAV-RFP轉(zhuǎn)導(dǎo)組為對(duì)照，計(jì)算重組IBDV復(fù)制抑制率。結(jié)果與AAAV-RFP轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞相比，AAAV-RFP-miVPl轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的YEZ和LYG株IBDV的TCID50分別下降7.0和6.5lg，AAAV-RFP-miVP2E轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的兩株IBDV的TCID5o分別下降7.0和2.5lg，這種抑制作用至少持續(xù)96h，而AAAV-RFP-miVP2con轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的兩株IBDV滴度無(wú)明顯下降(圖9)。權(quán)利要求1、一種表達(dá)抗傳染性法氏囊病病毒微小RNA重組禽腺聯(lián)病毒的制備方法如下a、干擾RNA的選擇用干擾RNA分析軟件siRNATargetFinder分析雞傳染性法氏囊病病毒IBDV序列，獲得針對(duì)不同毒株VP1或VP2基因保守區(qū)的候選干擾RNA；b、短發(fā)夾雙鏈寡核苷酸的合成與克隆根據(jù)RNA干擾載體pRFPRNAiC說(shuō)明書，用通用引物和PCR合成短發(fā)夾寡核苷酸，將PCR產(chǎn)物定向克隆入pRFPRNAiC載體；c、含干擾RNA表達(dá)盒AAAV轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建用限制酶PmlI和BsmBI消化含禽腺聯(lián)病毒全基因組的pCR-AAAV載體，電泳分離后回收包括末端反轉(zhuǎn)重復(fù)區(qū)的4.1kb載體片段，用Klenow酶補(bǔ)平；用限制酶SalI和BamHI雙酶切含RNAi表達(dá)盒的pRFPRNAiC載體，電泳分離后回收RNAi表達(dá)盒，經(jīng)Klenow酶補(bǔ)平后與AAAV轉(zhuǎn)移載體片段連接，獲得含RNAi表達(dá)盒的重組AAAV轉(zhuǎn)移載體；d、表達(dá)微小RNA重組AAAV的制備將含干擾RNA表達(dá)盒的重組AAAV轉(zhuǎn)移載體、AAAV輔助載體pcDNA-ARC和腺病毒輔助載體pHelper組成三質(zhì)粒系統(tǒng)，用磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后72小時(shí)收獲細(xì)胞，-20℃/37℃凍融4次后，用氯仿抽提和聚乙二醇沉淀重組病毒。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述表達(dá)抗傳染性法氏囊病病毒微小RNA重組禽腺聯(lián)病毒的制備方法，其特征在于步驟d中，利用重組AAAV轉(zhuǎn)移載體、AAAV輔助載體pcDNA-ARC和腺病毒輔助載體pHelper共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，產(chǎn)生的純化重組AAAV的感染性滴度大于5xl()S病毒顆粒/毫升。全文摘要本發(fā)明建立的表達(dá)抗傳染性法氏囊病病毒miRNA的重組禽腺聯(lián)病毒制備方法屬于基因工程和生物制品研究領(lǐng)域，包括siRNA的選擇、雙鏈短發(fā)夾寡核苷酸的合成與克隆、含miRNA表達(dá)盒禽腺聯(lián)病毒轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建、重組禽腺聯(lián)病毒的產(chǎn)生與鑒定、重組病毒表達(dá)的miRNA對(duì)傳染性法氏囊病病毒復(fù)制和基因表達(dá)抑制作用的檢測(cè)。與現(xiàn)有的其他技術(shù)相比，該系統(tǒng)不僅能在禽源細(xì)胞中有效、持久地表達(dá)miRNA，對(duì)傳染性法氏囊病病毒復(fù)制和基因表達(dá)具有特異、持久的抑制作用，而且對(duì)家禽無(wú)任何致病作用，不僅可用于體外實(shí)驗(yàn)，而且可作為抗禽病毒感染的新型生物制劑進(jìn)行開發(fā)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101402945SQ20081023468公開日2009年4月8日申請(qǐng)日期2008年11月14日優(yōu)先權(quán)日2008年11月14日發(fā)明者夏曉莉,孫懷昌,張?chǎng)斡?沈鵬鵬,王永娟申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)