專利名稱：一種棉花花粉發(fā)育過程中細(xì)胞dna的熒光標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種棉花花粉母細(xì)胞DNA物質(zhì)的熒光標(biāo)記方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
二背景技術(shù)：
植物的小孢子發(fā)生到花粉母細(xì)胞的成熟的變化過程一直是生殖生物學(xué)研究的重要 內(nèi)容之一。對于棉花小孢子發(fā)生和雄配子發(fā)育過程的研究從20世紀(jì)就開始了，早期的 研究方法主要是石蠟切片法，用蘇木精或番紅、固綠染色，隨后發(fā)展到用超薄切片、電 鏡觀測或離體培養(yǎng)、熒光染色。但直到現(xiàn)在為止，由于這些方法操作復(fù)雜，難以快速觀 察雄配子體發(fā)育的全過程，觀察效果不理想。這主要有兩方面的原因， 一是實(shí)驗(yàn)材料自 身的局限性；二是檢測方法的局限性。
植物成熟的花粉粒的壁可分為外壁和內(nèi)壁，外壁主要由孢粉素和纖維素等物質(zhì)組 成。其中孢粉素是一種難以分解、抗逆性強(qiáng)、耐高溫的物質(zhì)，穩(wěn)定性強(qiáng)，具有抗強(qiáng)酸、 強(qiáng)堿的特性，它使花粉粒的外壁非常牢固。內(nèi)壁主要由纖維素和果膠質(zhì)組成，易被酶類 物質(zhì)分解。棉屬植物的花粉粒成熟時(shí)體積較大，直徑大約為85-105pm左右，從四分體 釋放出來以后，形成一層不透明的結(jié)構(gòu)非常致密的外壁，外壁的自發(fā)熒光非常強(qiáng)，使得 染料滲透不到花粉內(nèi)。因此如果采用染色薄壁花粉粒(如水稻、小麥花粉粒)的方法來 對棉花成熟花粉粒進(jìn)行染色，則完全觀察不到它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。此外，前人在檢測棉花雄 配子體發(fā)育的過程時(shí)所用的染料的特異性不強(qiáng)，而且實(shí)驗(yàn)程序比較繁瑣，周期較長。因 此尚沒有妥善的解決方法。
脫外壁花粉粒是指花粉粒被脫去外壁后，留下的內(nèi)壁與原生質(zhì)體，是介于完整花粉 粒與花粉粒原生質(zhì)體之間的一種結(jié)構(gòu)單位，是一種可用于研究花粉形態(tài)與生理特性的獨(dú) 特材料。脫外壁花粉?？捎脕硌芯績?nèi)壁的表面結(jié)構(gòu)、剝離的外壁結(jié)構(gòu)與成分、內(nèi)壁的沉 積、新壁的合成等多方面的內(nèi)容；脫外壁花粉粒由于排除了外壁對生物大分子的屏障作 用，有利于染料分子的進(jìn)入。用熒光染料對核DNA進(jìn)行染色后，再用熒光顯微鏡或激 光掃描共聚焦顯微鏡觀察，可研究花粉粒內(nèi)部的核結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律。本方法通過熱激 -氧化法制備脫外壁花粉粒，再用DNA熒光染料DAPI (4, 6- diamidino- 2- phenylindole， 4， 6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)進(jìn)行染色，建立了一種簡便的制片程序，熒光顯微鏡研究了棉 花花粉粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及其細(xì)胞核的狀態(tài)。DAPI是一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，它能粘附在DNA雙螺旋的小溝區(qū)。DAPI-DNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為360 nm和460nm具有很高的光漂白承受水平。而且它還可以透過完整的細(xì)胞膜，用于活細(xì) 胞和固定細(xì)胞的染色。本方法探索了用DAPI熒光染料進(jìn)行檢測棉花雄性配子體發(fā)育過 程的試驗(yàn)，建立了完整可行的試驗(yàn)方法，操作步驟簡單，試驗(yàn)效果穩(wěn)定、清晰，因此無 論是在科研、檢測以及學(xué)生試驗(yàn)中都能得到很好的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供一種較快速、有效的的檢測棉花雄性配子體發(fā)育 過程的方法?；ɡ僦睆酱笥?mm時(shí)，花粉母細(xì)胞已經(jīng)發(fā)育為幼嫩花粉粒，需通過次氯 酸鈉氧化熱激脫去花粉粒外壁，再通過DAPI染色檢測細(xì)胞內(nèi)含DNA物質(zhì)的核變化。 花蕾直徑小于7mm時(shí)，花粉母細(xì)胞還沒有發(fā)育成幼嫩花粉粒，花粉壁還未形成，則不 需要經(jīng)過脫外壁處理即可染色鏡檢。
技術(shù)方案
一種棉花花粉母細(xì)胞DNA物質(zhì)的熒光標(biāo)記方法，包括以下步驟
1) 晴天早晨6 — 7點(diǎn)間隨機(jī)摘取不同大小的棉花花蕾，剝?nèi)グ~，固定于無水乙醇
冰醋酸配成體積比3:1的卡諾氏固定液，12—24h后轉(zhuǎn)入體積比為70%的乙醇中，保存 于4'C冰箱；
2) 固定好的樣品經(jīng)體積濃度為50%、 30%、 10%的乙醇逐級(jí)下行至蒸餾水；
3) 直徑小于7mm的花蕾，用解剖針剝離出其中的花粉母細(xì)胞，置于體積比0.1—0.2 %的甘油中滲透2-3h;用pH7-8的磷酸緩沖液洗滌花粉母細(xì)胞，將花粉母細(xì)胞用0.5 -lpg/ml的DAPI避光染色l-2h，細(xì)胞內(nèi)DNA物質(zhì)被熒光標(biāo)記；
4) 直徑大于7mm的花蕾，用鑷子剝離出其中的成熟花粉粒，加入質(zhì)量體積比10% 的次氯酸鈉水溶液，室溫振蕩放置10min，再于60°C水浴處理10 min;用pH7-8的磷 酸緩沖液洗滌花粉粒；花粉粒置于體積比0.1—0.2X的甘油中滲透2-3h;用pH7-8的磷 酸緩沖液洗滌花粉粒；再將花粉粒移至載玻片，加入100-20(^L濃度為2pg/ml的DAPI 溶液，蓋片，適度用力斜壓至外壁脫掉而花粉粒細(xì)胞不破裂為度，放在暗盒中靜置10min 后鏡檢，細(xì)胞內(nèi)DNA物質(zhì)被熒光標(biāo)記。上述的方法中所述棉花為陸地棉。
有益效果
本發(fā)明提供了一種對棉花雄性配子體發(fā)育過程的快速檢測方法。本發(fā)明的標(biāo)記和成 熟花粉粒脫外壁方法具有以下優(yōu)點(diǎn)l)操作簡單，快速省略了常規(guī)石蠟切片中的切片 步驟；2)用甘油作為滲透試劑，使得熒光染色效率更高；3)標(biāo)記效果好；4)成熟花粉脫外壁后花粉粒依然完整。本發(fā)明方法和結(jié)果為開展與棉花花粉粒有關(guān)的生殖生物學(xué) 研究和開發(fā)提供了新的途徑和依據(jù)。
四、 說明書附圖


圖1棉花雄性配子體發(fā)育到不同時(shí)期的觀察
A， F) 偶線期(X400), Bar=90nm; B) 減I后期(X400), Bar=100nm; C)減I末
期(X400), Bar=10CVm; D) 二分體時(shí)期(X400)， Bar=90nm; E)末期II; F-I)四分
體時(shí)期(X400)， Bar=90nm; J-L)成熟花粉粒單核、二核、三核期(X400), Bar=9CVm
圖2檢測魯棉21雄性配子體發(fā)育過程的技術(shù)流程圖
五具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所述百分含量如無特別說明均 為體積百分含量。
實(shí)施例l、魯棉21雄性配子體的熒光標(biāo)記及其顯微鏡觀測(主要技術(shù)流程見圖2) 首先用本發(fā)明的方法對魯棉21 (生產(chǎn)用種)雄配子體進(jìn)行熒光標(biāo)記，包括以下步
驟
1) 早晨6: 30左右采集不同大小的花蕾，剝?nèi)グ~，迅速固定于新鮮配制的卡諾氏
固定液(無水乙醇冰醋酸配成體積比3: l的溶液)，抽氣固定12—24h后轉(zhuǎn)入70X乙
醇中，保存于4"C冰箱，備用；
2) 固定好的樣品經(jīng)濃度為50%、 30%、 10%的乙醇(蒸餾水配制)逐級(jí)下行至蒸
餾水，每級(jí)停留2h;
3.1虔徑小于7mm的花蕾，用解剖針剝離出其中的花粉母細(xì)胞(除去全部的花藥碎 片等雜質(zhì))，置于0.15%的甘油(PBS緩沖液稀釋)中，在室溫下靜置滲透2h;
3丄1)用pH7.4的PBS緩沖液洗滌3次，每次在緩沖液中停留10—20min后，靜置 幾分鐘待樣品沉淀后再用移液槍將上層緩沖液吸出；
3丄2)將花粉母細(xì)胞用0.5Mg/ml的DAPI (Sigma公司，USA)在室溫下暗孵育lh， 然后不經(jīng)洗滌直接在熒光顯微鏡下檢測(觀察結(jié)果如圖l， A-I)。
通過固定、滲透、染色及鏡檢等操作，觀察到了棉花雄配子體的不同發(fā)育時(shí)期。減
數(shù)分裂的偶線期染色體分布比較松散(圖l-A);后期I:同源染色體被紡錘絲牽引 分離，均勻拉向兩級(jí)(圖l-B);末期I :染色體平均分配，分別到達(dá)兩極(圖l-C)，細(xì)胞壁沒有形成，細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行分裂，形成二分體，說明其不是同時(shí)型胞質(zhì)分裂(圖l-D); 末期II:染色體逐漸進(jìn)入解螺旋(圖l-E);四分體時(shí)期四分體的排列為四面體結(jié)構(gòu)， 4個(gè)小孢子被共同的胼胝質(zhì)包被，小孢子之間也被胼胝質(zhì)分割(圖1-F-I)。
在對棉花雄配子體發(fā)育過程的觀察中還發(fā)現(xiàn)，不同植株、同一植株的不同花序以及 同一花蕾不同小花的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的速度亦不同步，甚至同一花藥內(nèi)的細(xì)胞分裂 速度也存在差異。因此，實(shí)驗(yàn)中在同一制片中可以觀察到多于l個(gè)的不同時(shí)期的分裂相 (圖l-F)。
3.2)直徑大于7mm的花蕾，用鑷子剝離出其中的成熟花粉粒，加入10%次氯酸鈉 水溶液，室溫振蕩放置10min，再于6(TC水浴處理10min;
3.2.1) 用pH7.4的PBS緩沖液洗滌3次，每次在緩沖液中停留10—20min后，靜置
幾分鐘待樣品沉淀后再用移液槍將上層緩沖液吸出；
3.2.2) 洗滌后的樣品再置于0.15%的甘油(PBS緩沖液稀釋)中滲透2h;
3.2.3) 用pH7.4的PBS緩沖液洗滌3次，每次在緩沖液中停留10—20min后，靜置
幾分鐘待樣品沉淀后再用移液槍將上層緩沖液吸出；
3.2.4) 再用移液槍將花粉粒細(xì)胞移至載玻片，加入100nL濃度為2pg/ml的DAPI (Sigma公司，USA)溶液，迅速蓋片，適度用力斜壓至外壁脫掉而花粉粒細(xì)胞不破裂
為度，放在暗盒中靜置10min后再在熒光顯微鏡下鏡檢(觀察結(jié)果如圖l， J-L)。
在熒光顯微鏡觀察下，可清晰地看到經(jīng)過DAPI染色后的脫外壁花粉粒的內(nèi)部核結(jié) 構(gòu)，可清楚地分辨出單核花粉粒(圖l-J)、雙核花粉粒(圖l-K)和三核花粉粒(圖 l-L)等三種不同類型的花粉粒(圖中箭頭所指皆表示核)。單核花粉粒中的細(xì)胞核還沒 有進(jìn)行有絲分裂，或者已進(jìn)行過一次有絲分裂，但是，營養(yǎng)核與生殖核仍然聚集在一起。 雙核花粉粒已進(jìn)行了一次有絲分裂，形成一個(gè)營養(yǎng)核與一個(gè)生殖核，且兩者已經(jīng)明顯分 開。三核花粉粒已進(jìn)行過兩次連續(xù)的有絲分裂，包含一個(gè)營養(yǎng)核和兩個(gè)精細(xì)胞核，且三 者已經(jīng)明顯分開。
權(quán)利要求
1、一種棉花花粉發(fā)育過程中細(xì)胞DNA的熒光標(biāo)記方法，包括以下步驟1)晴天早晨6—7點(diǎn)間摘取棉花花蕾，剝?nèi)グ~，固定于無水乙醇冰醋酸配成體積比3∶1的卡諾氏固定液，12—24h后轉(zhuǎn)入體積比為70％的乙醇中，保存于4℃冰箱；2)固定好的樣品經(jīng)體積濃度為50％、30％、10％的乙醇逐級(jí)下行至蒸餾水；3)直徑小于7mm的花蕾，用解剖針剝離出其中的花粉母細(xì)胞，置于體積比0.1—0.2％的甘油中滲透2-3h；用pH7-8的磷酸緩沖液洗滌花粉母細(xì)胞，將花粉母細(xì)胞用0.5-1μg/ml的DAPI避光染色1-2h，細(xì)胞內(nèi)DNA物質(zhì)被熒光標(biāo)記；4)直徑大于7mm的花蕾，用鑷子剝離出其中的成熟花粉粒，加入質(zhì)量體積比10％的次氯酸鈉水溶液，室溫振蕩放置10min，再于60℃水浴處理10min用pH7-8的磷酸緩沖液洗滌花粉粒；花粉粒置于體積比0.1—0.2％的甘油中滲透2-3h；用pH7-8的磷酸緩沖液洗滌花粉粒；再將花粉粒移至載玻片，加入100-200μL濃度為2μg/ml的DAPI溶液，蓋片，用力斜壓至外壁脫掉而花粉粒細(xì)胞不破裂為度，放在暗盒中靜置10min后鏡檢，細(xì)胞內(nèi)DNA物質(zhì)被熒光標(biāo)記。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述棉花為陸地棉。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測棉花花粉母細(xì)胞DNA物質(zhì)的熒光標(biāo)記方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。包括晴天早晨摘取花蕾，樣品經(jīng)不同濃度乙醇逐級(jí)下行至蒸餾水；直徑小于7mm的花蕾中的花粉母細(xì)胞，置于甘油中滲透2-3h；洗滌后用DAPI避光染色1-2h，細(xì)胞內(nèi)DNA物質(zhì)被標(biāo)記。直徑大于7mm的花蕾中的成熟花粉粒，加入10％次氯酸鈉水溶液于60℃水浴中處理10min；洗滌后置于0.1-0.2％甘油中滲透2-3h；洗滌后再加入DAPI溶液，靜置10min后鏡檢，細(xì)胞內(nèi)DNA物質(zhì)被標(biāo)記。本發(fā)明具有操作簡單、快速，對細(xì)胞的損傷小，標(biāo)記效果好，易觀察的優(yōu)點(diǎn)，將在棉花雄配子體發(fā)育過程的研究中發(fā)揮重要作用，實(shí)際應(yīng)用價(jià)值高。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101413033SQ20081023456
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月21日
發(fā)明者吳李君, 吳躍進(jìn), 唐燦明, 岳潔瑜 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)