一種辣椒花粉發(fā)育相關(guān)基因CaMS1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于辣椒育種技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種辣椒花粉發(fā)育相關(guān)基因Ca#57 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒（Ca/wicwa? a/Mi/a?)屬于前科（Solanaceae)辣椒屬一年或多年生草本植物，其 果實(shí)是一種世界性的蔬菜和加工調(diào)味品。辣椒為常異花授粉植物，雜種優(yōu)勢(shì)非常明顯，優(yōu)良 雜種一代比常規(guī)品種可增產(chǎn)30% ~50%。雜種優(yōu)勢(shì)的利用，已成為辣椒生產(chǎn)上提高產(chǎn)量和 增加經(jīng)濟(jì)效益的重要手段。但目前我國(guó)雜交制種多采用蕾期人工去雄、授粉，不但制種成本 高而且很難保證種子純度。利用雄性不育系配制一代雜種，不僅可以簡(jiǎn)化制種程序，降低種 子生產(chǎn)成本，而且可以提高雜種的純度。因此，雄性不育系的選育及其應(yīng)用研究越來(lái)越受到 人們的重視。
[0003] 花粉敗育是植物雄性不育發(fā)生的表型體現(xiàn)，弄清花粉發(fā)育的全過(guò)程和分子機(jī)理是 研究植物雄性不育的基礎(chǔ)和關(guān)鍵所在。花粉發(fā)育涉及眾多基因的表達(dá)調(diào)控，對(duì)花粉發(fā)育相 關(guān)基因的研究不僅可以了解花粉發(fā)育的分子機(jī)制，還可以為人工創(chuàng)制雄性不育提供理論基 礎(chǔ)。這些基因的敲除能導(dǎo)致植物部分或完全不育，然而在辣椒中對(duì)花粉發(fā)育相關(guān)基因的研 究甚少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種辣椒花粉發(fā)育相關(guān)基因^#57。
[0005] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述基因仏#57編碼的蛋白。
[0006] 本發(fā)明的另一目的在于提供含有上述基因仏#57的重組載體。
[0007] 本發(fā)明的另一目的在于提供上述重組載體轉(zhuǎn)化的重組菌。
[0008] 本發(fā)明的另一目的在于提供RT-PCR和qRT-PCR分析上述基因的特異引物 對(duì)。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供擴(kuò)增上述基因的RNAi正、反義片段的引物對(duì)。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述基因^#57的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的上述目的是通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的。
[0012] -種辣椒花粉發(fā)育相關(guān)基因仏#57,所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:l~2所示。其中，所述基因的cDNA序列如SEQ ID N0:1所示，長(zhǎng)1919bp;所述基 因仏#57的開(kāi)放閱讀框序列如3￡〇10勵(lì):2所示，長(zhǎng)1758匕口。
[0013] 本發(fā)明還提供所述辣椒花粉發(fā)育相關(guān)基因^#57編碼的蛋白，其氨基酸序列如 SEQ ID N0:3所示，含585個(gè)氨基酸序列。
[0014] 本發(fā)明還提供含有所述辣椒花粉發(fā)育相關(guān)基因的重組載體。所述重組載體 可以是重組真核表達(dá)載體、重組原核表達(dá)載體或RNAi干擾載體。
[0015] 所述重組載體為RNAi干擾載體時(shí)，優(yōu)選地，將所述基因仏#57的RNAi正、反義片 段與大腸桿菌PFGC5941質(zhì)粒連接。
[0016] 本發(fā)明還提供所述重組載體轉(zhuǎn)化的重組菌。所述菌可以是大腸桿菌或農(nóng)桿菌。
[0017] 本發(fā)明還提供RT-PCR分析所述基因的特異引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4~5所示。利用RT-PCR分析上述基因的表達(dá)特性，其上游特異引物為：5' -AAATCTTCCCTCAGGAGTCAATCAG -3 ' ；下游特異引物為：5，-AATCACAAGTCCTTCGGAAAGAAAA _3'。
[0018] 本發(fā)明還提供qRT-PCR分析所述基因的特異引物對(duì)，其核苷酸序列如 SEQ ID N0:6~7所示。利用qRT-PCR分析上述基因的表達(dá)特性，其上游特異引物 為：5 ' -ATGATGGCGAAAGAGGITGACG-3 ' ；下游特異引物為：5 ' -CCAITTACATACGCTGTGGATACT TG-3'。
[0019] 本發(fā)明還提供擴(kuò)增所述基因的RNAi正、反義片段的引物對(duì)，正義序列的引 物對(duì)如SEQ ID N0:8~9所示，反義序列的引物對(duì)如SEQ ID N0:10~ll所示。正、反義序列的 引物對(duì)分別為： UP-SP4-1 :5, -CGGATTTAAATAGTCAGTGGAGCAAGCAA-3,， UP-SP4-2：5' -CGCGGATCCAGTCAGTGGAGCAAGCAA-3'； DW-SP4-1：5'-CATGCCATGGTTAGCCCTGGAATGTGGA-3r， DW-SP4-2 ：5r -TCCCCCGGGTTAGCCCTGGAATGTGGA-3'。
[0020] 本發(fā)明還提供所述基因^#57在花粉敗育中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明還提供所述基因^#57在制備雄性不育辣椒中的應(yīng)用。
[0022] 優(yōu)選地，在制備雄性不育辣椒時(shí)，將上述的重組載體轉(zhuǎn)化到辣椒中，并篩選出雄性 不育的植株。
[0023] 優(yōu)選地，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將所述基因?qū)肜苯分?。?jīng)過(guò)2~3 代篩選，獲得抗性辣椒，T。代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率達(dá)39. 6%，Ti代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性率達(dá)29. 2%。T。代 干擾植株的花粉萌發(fā)率為21. 84%，而野生型對(duì)照為52. 63%，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因植株有一定的雄性 不育性。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果在于：本發(fā)明提供了一種新的辣椒花粉發(fā)育相 關(guān)基因，命名為仏#57。通過(guò)RT-PCR和qRT-PCR表達(dá)分析，確定該基因是一個(gè)花粉發(fā)育早期 表達(dá)花藥特異基因，并且，本發(fā)明通過(guò)對(duì)該基因的干擾沉默，制備了花粉活力降低的材料。 通過(guò)對(duì)該材料的改進(jìn)與優(yōu)化可進(jìn)一步創(chuàng)制出辣椒雄性不育材料，對(duì)辣椒新品種的選育有重 要價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為提取的辣椒可育株或不育株八個(gè)等級(jí)混合花蕾RNA普通瓊脂糖凝膠電泳 圖；其中，F(xiàn)為可育株，S為不育株。
[0026] 圖2為的cDNA全長(zhǎng)和推導(dǎo)的氨基酸序列；起始密碼子和終止密碼子用黑體 表示；雙畫(huà)線部分為FAR-N-SDR-e保守域；單下劃線部分為STERILE保守域。
[0027] 圖3為在辣椒花蕾不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)；a. RT-PCR分析，Jc (ii?為內(nèi)參基 因；b. qRT-PCR分析；Fl~8, Sl~8分別為可育株和不育株1~8級(jí)花蕾。
[0028] 圖4為在辣椒不同組織部位的表達(dá)分析；a. RT-PCR分析，如仏?為內(nèi)參基 因；b. qRT-PCR分析；Fl~8, Sl~8分別為可育株和不育株根、莖、葉、開(kāi)放花、花萼、花瓣、花 藥以及雌蕊。
[0029] 圖5為正、反義片段PCR電泳圖；M :DL2000 Marker ;1-正義片段；2-反義 片段。
[0030] 圖6為的正義片段測(cè)序結(jié)果。
[0031] 圖7為的反義片段測(cè)序結(jié)果。
[0032] 圖8為的目的片段測(cè)序blastn比對(duì)結(jié)果。
[0033]圖9為pFGC5941-B質(zhì)粒的酶切電泳圖（及I、I);M :DL2000 ;1~5 為重組質(zhì)粒。
[0034] 圖10為的RNAi載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的菌液PCR電泳圖；M :DL2000 ;CK:陰性對(duì) 照：1 ~13 為 pFGC5941-B 菌液。
[0035] 圖11為T(mén)。代轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)（Bar基因引物);M :DL2000 Marker ; 1-陽(yáng) 性對(duì)照；2-空白對(duì)照；3-陰性對(duì)照；4~24為T(mén)。代抗性植株。
[0036] 圖12為T(mén)。代轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)（35S啟動(dòng)子引物）；M :DL2000 Marker; 1-陽(yáng)性對(duì)照；2-空白對(duì)照；3-陰性對(duì)照；4~24為T(mén)。代抗性植株 圖13為轉(zhuǎn)基因植株擴(kuò)增片段序列比對(duì)結(jié)果。
[0037] 圖14為轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照生長(zhǎng)狀況。
[0038] 圖15為干擾植株與對(duì)照花器官形態(tài)。
[0039] 圖16為花粉離體萌發(fā)顯微視圖；A_G#57沉默植株；B-野生型。
[0040] 圖17為T(mén)0代轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)（35S啟動(dòng)子引物）:DL2000 ;1_陰性 對(duì)照；2-陽(yáng)性對(duì)照；3~9為1\代轉(zhuǎn)基因植株。
【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但實(shí)施例并不對(duì) 本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常 規(guī)試劑、方法和設(shè)備。
[0042] 實(shí)施例1辣椒核雄性不育兩用系RNA的提取及cDNA的合成 以辣椒核雄性不育兩用系A(chǔ)B114為材料，采用Trizol法分別提取該材料可育株和不 育株的共8個(gè)等級(jí)花蕾(分別為：1心葉卷曲成條狀，花萼緊裹花冠；2心葉半展，花萼緊裹 花冠；3心葉展開(kāi)，花萼緊裹花冠，花柄直立；4花萼稍微裂開(kāi)，微露花冠，花柄彎曲；5花萼 與花冠齊平；6花冠伸出花萼部分約為花萼長(zhǎng)的一半；7花冠伸出花萼部分與花萼等長(zhǎng)；8 次日將開(kāi)的花）以及根、莖、葉、開(kāi)放花、花萼、花瓣、花藥以及雌蕊的總RNA，具體步驟如下： 51. 向2. 0 mL離心管中加入1 mL Trizol提取液，稱取0. 1 g材料于液氮中迅速研磨 成粉末狀后轉(zhuǎn)移到裝有提取液的離心管中，振蕩混勻，冰上靜置5 min; 52. 加入0.25 mL氯仿，劇烈振蕩30 s，冰上靜置5 min; 53. 4°C下，13000 rpm 離心 15 min ; 54. 重復(fù)步驟S2、S3-次； 55. 將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的離心管，加入2/3體積異丙醇，振蕩混勻，冰上靜置10 1^11，4。(：下，12000 鄺111離心1〇111111; 56. 棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2~3次； 57. 10000 rpm離心5 min收集沉淀，徹底去除75%乙醇，稍干燥后用適量 RNase-free水溶解RNA，-75°C保存?zhèn)溆谩?br>[0043] 取經(jīng)過(guò)DNase I (RNase Free)處理和純化的辣椒可育株或不育株八個(gè)等級(jí)混合 花蕾總RNA樣品，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28S和18S條帶清晰，見(jiàn)圖1。
[0044] 將辣椒花蕾總RNA樣品用TE溶液適當(dāng)稀釋之后，用核酸蛋白儀測(cè)得A260/A280比 值在2. 0左右，A260/A230比值大于2. 0,表明RNA純度高，完整性良好，具體結(jié)果見(jiàn)表1。
[0045] 表1辣椒可育株或不育株八個(gè)等級(jí)混合花蕾的RNA吸光度值測(cè)定
接著，以提取的RNA為模板，采用市售試劑盒完成辣椒各組織部位cDNA的合成，得到不 育株和可育株8個(gè)等級(jí)花蕾以及根、莖、葉、開(kāi)放花、