專利名稱：核盤菌群體中抗藥性基因頻率的高通量實時檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種核盤菌群體中抗藥性基因頻率的實時檢測方法，可用于監(jiān)測苯 唑類殺菌劑抗性核 盤菌群體發(fā)展動態(tài)，進行抗藥性油菜菌核病的流行預(yù)測。 二、技術(shù)背褒
油菜菌核病是由核盤菌&&rotfn'a sc/mtftorum(Lib.) de Bay引起的一種世界性病害，嚴(yán)重影響油菜 的產(chǎn)紫和品質(zhì)，長期以來采用苯并味唑類殺菌劑或以這類藥劑為主的復(fù)配劑進行化學(xué)防治。苯并味唑 類殺菌劑作為一類高效、廣譜內(nèi)吸性殺菌劑在生產(chǎn)上應(yīng)用，解決了保護性殺菌劑的環(huán)境毒性問題，提 髙了人類控制該病害的能力。苯并咪唑類殺菌劑包括多菌靈、苯菌靈、噻菌靈、硫竄靈等。這些殺菌 劑具有相同的抗菌譜和抗菌機制，他們也具有相同的抗藥性機制，相互之間存在正交互抗藥性。由于 這類藥劑的商度專化性，作用位點單一，加上施用頻率離，使用2~3年后許多植物病原真菌群體中就 會出現(xiàn)抗藥性優(yōu)勢生理小種，使藥劑防治完全失去效果。近年研究證明，核盤菌對多菌靈的抗藥性產(chǎn) 生是因為細胞中P-微管蛋白基因發(fā)生突變，使編碼的蛋A質(zhì)二維構(gòu)象和電性分布改變，從而失去了與 藥劑分子的親和性。&魂管蛋白基因編碼198或200位氨基酸的密碼子發(fā)生點突變是導(dǎo)致大多數(shù)病原 菌產(chǎn)生田間抗藥性的主要原因。
由亍病原菌在自然界的數(shù)量巨大，抗藥性個體在群體中的比例很低時(1%~5%)即可引起抗藥性病害 流行，使藥劑防治失敗，傳統(tǒng)的檢測方法霈要分離培養(yǎng)病原菌，然后在含藥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，再根據(jù)藥劑對 齒絲生長的效應(yīng)鑒別抗藥性，這種對藥劑的敏感性測定方法通常霜要幾周時間，工作量大，測定樣本數(shù)量 有限，抗藥性基閔頻率在1%以下時難以發(fā)現(xiàn)。因此，傳統(tǒng)的抗藥性監(jiān)擁方法只能核實藥劑防治失敗是否 由于抗藥性造成，不能早期預(yù)醬。早期檢測病原群體中抗藥性生理小種航藥性基閉的頻率，及早實施抗 藥性治理策略和實施早期預(yù)警，是抗藥性治理最有效的措施。在抗藥性機制研究基礎(chǔ)上，根據(jù)基芮點突變 的原理，應(yīng)用常規(guī)的核黢技術(shù)如ASO"PCR技術(shù)等檢測病原真菌對多菌靈等苯并咪嗖類殺菌劑的抗藥性， 則能快速、準(zhǔn)確檢測樣本，但一個PCR反應(yīng)體系只能檢測一個菌株對多菌靈殺菌剤的敏感性，而且也只 能在整個PCR反應(yīng)體系結(jié)束之后通過電泳檢測獲得所擁定的單個菌株對多菌靈敏感性。實時定量PCR (Real-time qu旭titotive PCR) ^則改變了病原菌對殺菌劑敏感性的檢測只錄單個樣本進行檢翻， 它具有(1)檢測的高通量，即在一個腿體系中，可以對所有待檢樣品對殺菌劑的敏感性翻定(2〉檢 糖結(jié)果的實時性，在PCR反應(yīng)進行中可以了解樣品中抗藥性菌株亞群體的大小(3)離效性，經(jīng)典的平 皿法、常規(guī)的ASOuPCR^術(shù)測定抗藥性菌株只能進行單個對殺苗劑的敏感性的M定，而這種方法則同
時對燭樣品進行測定，耗時僅為6小時，可以準(zhǔn)確了解當(dāng)年的抗藥性苗tiaE群體發(fā)生、發(fā)展、流行的態(tài)
勢，有效的指導(dǎo)當(dāng)年用藥，(4)使在早期4^H低頻率的抗苗性基因成為可能，
作者已研究實時定量PCR (Real-time quantitative PCR)方法檢測抗多菌靈的核盤菌，包括樣品的 前處理、基閔組DNA的提取、實時定量PCR擴增的過程。

發(fā)明內(nèi)容
4技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供核盤菌抗多菌靈菌株亞群體一種快速檢測方法?，F(xiàn)有技術(shù)針對ASO-PCR探針特異性較差，為Real-time PCR進行探針的重新設(shè)計，反應(yīng)體系優(yōu)化。經(jīng)過優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件后，實時定量PCR (Real-time quantitative PCR)能在油菜發(fā)病期6小時內(nèi)進行大量、簡便的抗藥性亞群體的檢測，檢測準(zhǔn)確率達到95%以上，對及時采取有效措施控制當(dāng)季抗藥性病害流行，具有實用價值。
技術(shù)方案核盤菌抗多菌靈的檢測基因，其e-微管蛋白基因，長度為1685 bp,相應(yīng)的編碼e-微管蛋白的477個貧基酸，包含第l訴位筑基酸的抗藥性突變位點Glu(GAG)—Ala(GCG).
一種核盤糖抗多苗靈的檢菊方法， 一種核盤菌抗多菌靈的糊方法，共分三步，
第一步:采用常規(guī)的苯酴■氯仿■異戊醇法，分別提取已知抗藥性菌林、敏感性菌抹和待測樣品的核基因組DNA。
第二步運用抗藥性菌抹和核盤菌菌抹的特異性檢測引物和SY肌Green I為發(fā)光材料進行實時定量PCR反應(yīng)，分別建立抗藥性菌抹和核盤菌菌^測的標(biāo)準(zhǔn)曲線.
核盤菌群體中抗藥性基因頻率的髙通量實時檢測技術(shù)的關(guān)鍵是用于實時定量PCR的引物具有特異性，設(shè)計的依據(jù)是抗藥性菌株在P-微管蛋白第198為由Glu(GAG)—Ala(GCG)。
① 擴增核盤菌P-微管蛋白基因片斷的特異性引物對
上游引物SclSF: 5， - CTCAAATCTCCGAAAGTT -3'下游引物SclAF: 5， - TGCAGAfGGGTAATATG -3，
② 擴增核盤菌抗藥性基因片段的特異性引物對
上游引物RFP4: 5， -TGGTCGAGAACTCTGACAC-3,
下游引物RRP: 5， -TTCAAACGGTATAATGGGC-3，實時定量PCR (Real-time quantitative PCR)反應(yīng)體系及其擴增程序(1)核盤酋總量檢擁的標(biāo)準(zhǔn)曲線腿體系，
dH20 (滅菌蒸餾水) 9jjLSYBRa/^iwicficrag (2x) 12單SclSF(10)iM) 0'25mLSclAF(10(iM) 0.25mLROX Reference Dye (50X) 0.5|iL
DNA植板_2.0nL
總體積 25jiL
rw綠
預(yù)變性95°C 10s變性951C 5s
5退火55.8" 31s40個循環(huán)
延伸72"C 5minDissociation protocol 58*C(2)抗性核盤苗量的標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)體系，
dH20 (滅菌蒸餾水) 9jiLSYBR* i>>ie iix及21^ (2 X ) 12.5jiLRFP4(10pM) 0.25jjLRRPUOmM) 0.25jjLROX Reference Dye (50X) 0.5pL
DNA鄉(xiāng)_2.0uL
總體積 25nL擴坩綠
預(yù)變性951 10s
變性95" 5s退火621C 33s40個循環(huán)
1
延伸72" 5min
Dissociation protocol 58"C第三步待測樣品分別運用上述兩種特異性引物進行相應(yīng)的擴增體系和擴增M進行實時定量PCR反應(yīng)，根據(jù)已經(jīng)建立好的兩個標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出相應(yīng)的抗藥性菌林和敏感性菌林的數(shù)量和抗藥性菌^Mt核盤菌總量中的比例.
有Ji效果本發(fā)明核盤菌抗多菌靈亞群體的檢測方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，
1.實時定JtPCR (Real-tl鵬quantitative POO旅彼了病原菌對殺飾敏感性的糊只雌行單個樣本檢翻，與常規(guī)的平JMtt測和AS(hrcR^^檢l8相比，具有如下優(yōu)點和積極效果.
(1) 檢測的高通量，即在一個反應(yīng)體系中，可以對所有待檢樣品對殺菌劑的敏感性測定
(2) 檢測結(jié)果的實時性，在PCR反應(yīng)進行中可以了解樣品中抗藥性菌株亞群體的大小
(3) 髙效性，經(jīng)典的平皿法、常規(guī)的ASO-PCR等技術(shù)測定抗藥性菌株只能進行單個對殺菌劑的敏感性的測定，而這種方法則同時對大量樣品進行測定，耗時僅為6小時，可以準(zhǔn)確了解當(dāng)年的抗藥性菌株亞群體發(fā)生、發(fā)展、流行的態(tài)勢，有效的指導(dǎo)當(dāng)年用藥。
(4) 使在早期檢測低頻率的抗藥性基因成為可能，(5) 本發(fā)明是國際上首次對核盤菌抗多菌靈的檢測基因的擴增引物引入人為的錯配，提高對抗藥性基因擴增的特異性和擴增效率，并將獲得的優(yōu)化引物運用到實時定量PCR (Real-time quantitativePCR),進行抗多菌靈殺菌劑的抗藥性亞群體檢測
2、 目前國內(nèi)其他研究單位均采用菌絲生長法檢測核盤菌抗藥性，但該方法涉及采樣、分離培養(yǎng)需要3d和室內(nèi)大量的藥劑敏感性測定實驗至少要6天，周期較長。ASO-PCR技術(shù)雖然可以快速、簡便地檢測和監(jiān)測抗藥性菌株，但是每個反應(yīng)只能檢測一個菌株對多菌靈的敏感性。實時定量PCR則可以在一個反應(yīng)體系里將全部待測樣品對多菌靈抗藥性水平檢測出來，在PCR反應(yīng)的進行中即可知道該反應(yīng)的動態(tài)結(jié)果。這種方法具有髙通量、快速、節(jié)本。這對及時了解抗藥性病原菌亞群體的發(fā)展動態(tài)，及時、合理地指導(dǎo)科學(xué)用藥，有效治理抗藥性，以及降低成本和減少環(huán)境污染具有現(xiàn)實意義，
3、 在所測定的200株核盤菌中約有38%的菌株對多菌靈具有抗藥性(表3)，這個實時定量PCR瀏定結(jié)果與
傳統(tǒng)菌落直徑法測得的結(jié)果(36.9%)相吻合，
四

圖1引物(RFP4、 RRP)濃度為0.2jiM時的擴增圖譜
圖2優(yōu)化后的擴增圖譜(引物RFP4、 RRP)
圖3不同濃度模板的定量擴增曲線
圖4不同濃度模板的定量擴增產(chǎn)物電泳圖譜
(上圖為引物RFP4、RRP,下圖引物為SclSF、SclAF, 1 6引物濃度分別為1.4X 10-3ng/pL 、 1.4X l(T2ng^L、1.4X1(TVjjL、 1.4ng/nL、 14ng/^L、 140ng/nL)圖5引物對SclSF、 SclAF的PCR擴增條件
圖6弓l物SclSF、 SclAF的定量擴增曲線
圖7核盤菌定量標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖8引物對RFP4、 RRP的PCR擴增條件
圖9引物RFP4、 RRP的定量擴增曲線圖IO抗性核盤菌定量標(biāo)準(zhǔn)曲線圖ll引物SclSF、 SclAF擴增產(chǎn)物的熔解曲線圖12引物RFP4、 RRP擴增產(chǎn)物的熔解曲線圖13模板濃度過髙時(未稀釋)的擴增曲線
五具體實施例方式
實維例1、適用于實時定量PCR (Raaltim quantitative PCR)特異性引物簾逸.
0-微管蛋白基因l訴位氨基酸由谷氨酸(Glu)突變?yōu)楸彼?Ala)是導(dǎo)致核盤菌(S. scferoft'orwm)產(chǎn)生對多菌靈田間抗藥性的主要原因，其相應(yīng)的密碼子由GAG突變?yōu)镚CG,根據(jù)這一點突變設(shè)計了可以擴增出抗性核盤菌特征性條帶的上游ASO特異性引物5，-TGGTCGAGAACTCTGACGC-3，，該引物不能用于實時定量PGRttM,因為在^ 產(chǎn)物中 二級結(jié)構(gòu)由于SYBR Green I是一種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料，但它不能選擇特定的DNA模板，所以此法定量就要求弓l物不能形成二聚體，不產(chǎn)生錯配。此外，
在本發(fā)明中抗藥性菌株與敏感菌株相比，只在e-微管蛋白基因序列上有一個堿基發(fā)生了改變(A—C),因
此就給引物的設(shè)計增添了更大的難度。在PCR反應(yīng)中，弓l物3'末端是弓l發(fā)延伸的關(guān)鍵，理論上3，末端錯配，弓l物就不能與模板正確雜交引導(dǎo)序列延伸，PCR反應(yīng)就不能進行。然而，在實際PCR過程中3'末端錯配的引物還是會擴增出條帶，造成了結(jié)果的假陽性。為了避免假陽性，對ASCWCR進行了改良(K. Hayashi，2004)。在設(shè)計引物時，設(shè)計了一系列在近3'末端加入人工錯配的引物，從中進行了特異性引物的篩選。上游引物RFP1 (5，-TGGTCGAGAACTCTGAC(K>3，)
RFP2 (5'-TGGTCGAGAACTCTGACCC-3')
RFP3 (5，-TGGTCGAGAACTCTGAC2t>3，)
鵬4 (5'-TGGTCGAGAACTCTGACSj')
RFP5 (5'-TGGTCGAGAACTCTGAA4C-3，)
RFP6 ( 5，-TGGTCGAGAACTCTGAG4C-3，)
RFP7 (5'-TGGTCGAGAACTCTGAC 7C-3，)
RFP8 (5，誦TGGTCGAGAACTCTGAy4rc-3，)
RFP9 (5'-1001\:0八6^(:7070八17103,)
RFP10 (5，-TGGTCGAGAACTCTO71E403')
RFP11 (5'-TGGTCGAGAACTCTG( G4C-3，)下游引物RRP (5'-TTCAAACGGTATAATGGGC-3，)
篩選的反應(yīng)體系
10 x buffer 5fiL
MgCl2(25mM) 5pL
dNTP U0mM) l^iL
RFP4、 RRP (10pM) 各0.8pL
DNA模板(50jig/mL) 2^L
T叫DNA聚合酶(5U/pL) 0.5pL
dH,O (滅菌蒸餾水)_補充至50uL
總體積篩選的擴增條件
預(yù)變性951C
50pL
10min
35個循環(huán)
延伸72t: 5min4
s s s
5 o o
3 4 4
9 6 7
性火伸
變退延4t:保存
先用以上弓I物分別對標(biāo)準(zhǔn)菌株JSJ2 (對多菌靈敏感菌株，釆自江蘇省)和JSJ6 (抗多菌靈菌株，采自江蘇)進行梯度PCR (52~641C)擴增，結(jié)果以引物對RFP4、 RRP在62TC擴增結(jié)果最好，即保證了對抗性模板DNA的特異性又有較好的擴增效率。而其它引物要么不具有對抗性模板DNA的特異性，要么就因為加入的人工錯配太多無法擴增出目的片段。用篩選出的引物對RFP4、 RRP對其它十二個不同抗性表型的核盤菌菌株進行擴增，結(jié)果證明，RFP4、 RRP只能從抗性核盤菌株的基因組DNA中擴增出條帶，十二個菌株中的抗性菌株檢出率為100%,對敏感菌株無擴增.實旌併2. SYBR Qreen I熒光染料定釁PCR體系優(yōu)化
2.1退火濕度為了保證檢測的穩(wěn)定性和可靠性，實驗選用了寶生物工程(大連)有限公司的SYBR iV wix fit fag (Perfect Real Time) DRR041S試劑盒。該試劑盒中的酶、M^+、 dNTP等已經(jīng)過優(yōu)化，只需加入自己的模板和引物，因此，實驗只對退火溫度和引物濃度進行了優(yōu)化。
退火mSTm值是反應(yīng)特異性的重要保證，如果退火MS過低就會產(chǎn)生4辨異性擴增，所以選擇較商的退火^a能夠大大減少引物與模板之間的非特異性結(jié)合，提髙PCR反應(yīng)的特異性，但太髙的退火Mfi又會,擴增效率，因此需要對其進行優(yōu)化。實驗中對引物RFP4、 RRP和SclSF、 SclAF的退火溫度分別以62"和57TC為基礎(chǔ)，以0.3 1C的幅度微調(diào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)引物RFP4、 RRP在退ikmS為62TC魄抓擴增效率高，JiT增信號納擴增曲線平滑，且ARn駄，而未優(yōu)化前，擴增信號Jg^(擴增曲線呈鋸齒狀，厶Rn值小。引物SclSF、 SclAF在退火aS為55.81CBm測結(jié)果旨。
2.2引物泉dt當(dāng)PCR引物濃度太低，則產(chǎn)物量降低，會出現(xiàn)假陰性，引物濃度過髙會促進引物的錯誤
引導(dǎo)非特異性產(chǎn)物合成,還會增加引物二聚體的形成，造成假陽性或定量誤差。根據(jù)SYBR*1 iSc 3^
(PerfectReal Time)DRR041S試劑盒說明書推薦的反應(yīng)體系進行擴增時，發(fā)現(xiàn)由于引物濃度(0.2jiM)太髙，
即使未加模板的陰性水對照(NTC)在反應(yīng)進入35個循環(huán)后也會產(chǎn)生非特異性擴增信號,因此在0.1 0.2jiM
范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度，最終確定引物最佳濃度為O.ljiM。此時擴增效率較離，且基線平整，陰性對照(NTC)
無信號檢出(圖1〉。
在退火溫度和引物濃度優(yōu)化條件下，實時定量PCR擴增圖譜見圖2。
實施例3 SYBR O關(guān)I熒艦料定JtPCR的靈敏
將菌株JSJ6基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋成10個梯度140 ng^iL 、 14ng/nL、 1.4ng/i止、1.4X10.VnL、 1.4X10-2ng/nL、 1.4X 10-3ng/nL、 1.4X10"VnL、 1.4X10-ing/nL、 1.4Xl(^ng/!jL、 1.4Xl(r7ng/|jL，分別用兩對引物定量擴增；得到的擴增圖譜(圖3)中，當(dāng)模板濃度小于1.4X10—Sng/iiL以后其擴增曲線的熒光值低于域值;而產(chǎn)物經(jīng)1.5y魂脂糖凝膠電泳檢測，當(dāng)模板濃度小于1.4X10-Zng/jiL后無電泳條帶(圖4)。由此可知，SYBR Green I熒光染料定量PCR可檢測到的樣本濃度最低值為1.4Xl(r3ng/jiL (每25jiL體系2.8X 10-3吸3.17X 1(^copy)，靈敏度至少是普通PCR檢測方法的10 100倍。
實施併4.核盤苗總量的標(biāo)準(zhǔn)曲線
將核盤菌".scferoft'onwi)與其它常見植物病原線狀真菌e-微管蛋白基因通過BLAST比較，發(fā)現(xiàn)氨基酸水平上同源性較髙，為95.78%~97.66%，但所含內(nèi)含子數(shù)目及大小不同，根據(jù)這一差異設(shè)計了可以擴 增出抗性核盤菌特征性條帶的下游引物RRP (5'-TTCAAACGGTATAATGGG03,和可以特異性擴增核盤 菌(S.wfeTOrion卵〉片斷的引物對SclSF(S，- CTCAAATCTCCGAAAGTT -3，)、 SclAF(5，- TGCAGACGGG TAATATG -3，)'
反應(yīng)體系:
擴增條件:
dH20 (滅菌蒸餾水) 9jiL SYBR②/V i ir fic Tog (2 X ) 12.5pL SclSF(lO一) 0.25^L SclAF(lOpM) 0.25fiL ROX Reference Dye (50 X ) 0.5iiL DNA樓板_2攀
總體積
預(yù)變性951C
25pL
10s
變性95X: 退火55.8TC 40個循環(huán)
延伸72" Dissociation protocol
5s 31s
5min 581C
根據(jù)靈敏度實驗中確定的檢測限，將菌株JSJ6基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋成6個梯度:140ng/pL 、 14ng/jiL、 L4ng/pL、 1.4X10"ng/jiL、 1.4X 10-2ng/ML、 1.4X 10-3ng/(iL,用引物SclSF、 SclAF擴增，得到 的擴增圖譜中，可見到的熒光值增加時對應(yīng)的循環(huán)數(shù)與用于定量的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度成負相關(guān)性(圖6), 得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖7)為Y="3.41X+27. 30 R2=0.999 (Y:Ct,X:模板質(zhì)量對數(shù))
實施倒5.抗性核盤h的標(biāo)準(zhǔn)曲線
反應(yīng)體系:
dH20 (滅菌蒸餾水) 9jiL SYBR* /VBwir ￡r rag (2 X ) 12.5(iL RFP4 ( IOjjM ) 0,25jiL RRP(l(H)M) 0.25pL ROX Reference Dye (50X) 0單 DNA樓板_2攀
總體積
10擴增條件(兩步法，圖8)
預(yù)變性95"C 10s
變性95TC 5s 退火621C 33s 40個循環(huán)
延伸72XJ 5min
Dissociation protocol 58X1 用引物RFP4、RRP擴增菌株JSJ6基因組DNA6個濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)品，得到的擴增圖譜中，可見到的 熒光值增加時對應(yīng)的循環(huán)數(shù)與用于定量的標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度成負相關(guān)性(圖9)，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖IO) 為Y=~3.45X+25.60 R2=0. 998 (Y: Ct, X:模板質(zhì)量對數(shù))
實施例6.定懸POH的格解曲線
從熔解曲線分析定量PCR體系反應(yīng)產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物可知弓|物SclSF、 SclAF擴增得到的產(chǎn)物的熔解 溫度(Tm)為83,8TC (圖11);引物RFP4、 RRP擴增得到的產(chǎn)物的熔解溫度為85.21C (圖12):波峰髙 低與模板濃度成正相關(guān)性基線平穩(wěn)，只有一個熔解峰，證明無引物二聚體產(chǎn)生和非特異性擴增，產(chǎn)物特 異性好，
實施例7 2004^Ql蘇省通州市油mJ:的核盤菌對多菌靈抗蓊性的快速m
將采集回來的每株油菜莖桿中的菌核精確稱取15.00mg, —起混勻(共200個菌株)，提取(李紅霞， 陸悅健，周明國，王曉峰.油菜菌核病菌P-微管蛋白基因與多菌靈抗藥性相關(guān)突變的研究.中國油料作物學(xué) 報,2003,25(2):56-60.)基因組DNA，用紫外分光光度計檢查濃度，并將其稀釋致140ng/nL~1.4Xl(T3ng/nL 之間(此時結(jié)果的線性關(guān)系最好，當(dāng)模板濃度太大時，SYBR Green I會在反應(yīng)初始階段就與模板結(jié)合，造 成基線上翹，熒光背景過髙，如圖13)加樣檢測，以抗性菌株JSJ14提取的基因組作為陽性對照，敏感菌 株HM3提取的基因組作為陰性對照，檢測結(jié)果見表l、 2。
從以上結(jié)果可以得出，在所測定的200株核盤菌中約有38%的菌株對多菌靈具有抗藥性(表3),這一
結(jié)果與傳統(tǒng)菌落直徑法測得的結(jié)果(36.9%)和普通ASOPCR檢測的結(jié)果(39%)相吻合。 實施例8 2005 ^tl蘇省句容市油菜茵核病病組^J^多菌靈抗苗性Sff體的^K)iftlN
將2005年采集回來的病組織，隨機選擇100個，在每個病組織的病健交界處用取樣器取0.2mm直徑 的樣品，混合，加石英沙研磨，提取DNA，用紫外分光光度計檢査濃度，并將其稀釋致140ng/fiL 1.4X 1(^ng/^L之間，加樣檢測，以抗性菌株JSJ14提取的基因組作為陽性對照，敏感菌株HM3提取的基因組 作為陰性對照，病原菌總量(8.40±0.59) ng,抗藥性亞群體總量為(2.69±0.34) ng,抗藥性病原菌亞群 體占(32.02±0.07)%;采用常規(guī)的方法，將病原菌從所測定的病組織上分離、培養(yǎng)、PSA平皿測定病原菌 對多菌靈的敏感性水平，經(jīng)測定抗藥性菌株占總體的比例為31%。采用Real-time quantitative PCR方法測 定的準(zhǔn)確率為96.7%.
11實旌例9 ^t檢測田間^的孢^:藥性3EffiM^i!率
將2005年采集回來的孢子，隨機分離100個孢子，培養(yǎng)、PSA平皿測定病原菌對多菌靈的敏感性水 平，經(jīng)測定抗藥性菌株占總體的比例為52%。提取所采集孢子的DNA,用紫外分光光度計檢查濃度，并 將其稀釋致140ng/pL 1.4Xl(T3ng/^iL之間，加樣檢測，以抗性菌株JSJ 14提取的基因組作為陽性對照， 敏感菌株HM3提取的基因組作為陰艦照，病原菌總量(9.80±0.67) ng/jjL，抗藥性亞群體總量為(5.21 ±0.51)ng/nL，抗藥性病原菌亞群體占53.16%,采用Real-time quantitative PCR方法測定的準(zhǔn)確率97.7%。
表l核盤菌總數(shù)(引物SclSF、 SclAF)的定量結(jié)果
SampleCtStdDevCtQ yStdDevQtyMean Qty
JSJ1425.174.23
JSJ1424.910.185.050.564.42
JSJ1423.263鄰
HM326.421.82
HM323.810,322.740.492.37
HM325.912.36
sample23.939.抑
sample24.030,109.140.669.80
sample23.8310.46
表2抗性核盤菌(引物RFP4、 RRP)的定fi結(jié)果SampleCtStdDevCtQtyStdDevQlyMean Qty
JSJ1423.384.41
JSJ1423.190.215.000.614.40
JSJ1423.613,78
HM3UndetUndeL
HM3Und汰/Und汰//
HM3UndetUndeL
Sample23.663.65
sample24.190.462.571.083.65
sample23.274.73
表3抗性核盤菌占群體總數(shù)的量 Table3 Quantification of MB&resJstant&sderotforMn ingoups
SampleAmount of ￡w/ewA'omm 土SE(ng)Amount ofMBG^csistuntFaoentafMBGicsislaitSw&roCiorumiSE (%〉 (95% CL)
JSJ144.42±0.564.40±O6199.41 士0.05 (柳> 51)
HM32.37±0.49Undetected/
smaple9.80 ±0.663.65±1訴36.83 士0訴G6j6S37.01)
權(quán)利要求
1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)群體中抗藥性基因頻率的實時檢測方法，其特征在于采用實時定量PCR(Real-time quantitative PCR)技術(shù)檢測核盤菌群體中存在的對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性基因頻率。一種核盤菌抗多菌靈的檢測方法，共分三步第一步采用常規(guī)的苯酚·氯仿·異戊醇法，分別提取已知抗藥性菌株、敏感性菌株和待測樣品的核基因組DNA。第二步運用抗藥性菌株和核盤菌菌株的特異性檢測引物和SYBR Green I為發(fā)光材料進行實時定量PCR反應(yīng)，分別建立抗藥性菌株和核盤菌菌株檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。實時定量PCR(Real-time quantitative PCR)反應(yīng)體系及其擴增程序(1)核盤菌總量檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)體系dH2O(滅菌蒸餾水) 9μLPremix Ex TaqTM(2×) 12.5μLSclSF(10μM) 0.25μLSclAF(10μM) 0.25μLROX Reference Dye(50×) 0.5μL<u>DNA模板 2.0μI</u>總體積 25μL擴增條件預(yù)變性95℃ 10s ↓變性95℃ 5s退火55. 8℃ 31s40個循環(huán) ↓延伸72℃ 5minDissociation protocol58℃(2)抗性核盤菌量的標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)體系dH2O(滅菌蒸餾水) 9μLPremix Ex TaqTM(2×) 12.5μLRFP4(10μM) 0.25μLRRP(10μM)0.25μLROX Reference Dye(50×) 0.5μL<u>DNA模板2.0μL</u>總體積 25μL擴增條件預(yù)變性95℃ 10s ↓變性95℃ 5s退火62℃ 33s40個循環(huán) ↓延伸72℃ 5minDissociation protocol58℃第三步待測樣品分別運用上述兩種特異性引物進行實時定量PCR反應(yīng)，對照已經(jīng)建立好的兩個標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出相應(yīng)的抗藥性菌株和敏感性菌株的數(shù)量和抗藥性菌株在核盤菌總量中的比例。
2、根據(jù)權(quán)利要求l，核盤菌群體中抗藥性基因頻率的高通量實時檢測技術(shù)其特征在于用 于實時定量PCR的引物具有特異性。設(shè)計的依據(jù)是抗藥性菌株在(3-微管蛋白第198為由 Glu(GAG)—Ala(GCG)。① 擴增核盤菌p-微管蛋白基因片斷的特異性引物對上游引物SclSF: 5， - CTCAAATCTCCGAAAGTT -3， 下游引物SclAF: 5， - TGCAGACGGGTAATATG -3，② 擴增核盤菌抗藥性基因片段的特異性引物對上游引物RFP4: 5， -TGGTCGAGAACTCTGAC,3， 下游引物RRP: 5， -TTCAAACGGTATAATGGGC-3'
全文摘要
本發(fā)明屬于核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)群體中抗藥性基因頻率的實時檢測方法，可用于引起油菜等作物菌核病的核盤菌對多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑抗藥性監(jiān)測和流行預(yù)警。該檢測方法共分3個主要步驟，第一步分別提取已知抗藥性菌株、敏感性菌株和待測樣品的核基因組DNA；第二步運用抗藥性菌株和核盤菌菌株的特異性檢測引物，進行實時定量PCR反應(yīng)，分別建立抗藥性菌株和核盤菌菌株檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線；第三步待測樣品分別運用上述兩種特異性引物進行實時定量PCR反應(yīng)，對照已經(jīng)建立好的兩個標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出相應(yīng)的抗藥性菌株和敏感性菌株的數(shù)量和抗藥性菌株在核盤菌總量中的比例。采用實時定量PCR(Real-time quantitative PCR)技術(shù)可以高通量、快速、準(zhǔn)確定量測出田間抗藥性核盤菌的數(shù)量及其在病原群體中的比例，具有高通量的特點。比常規(guī)的生物測定和普通的PCR檢測抗藥性菌株省時、節(jié)本、快速。直接從田間采集回來的菌核、病斑和孢子中提取基因組DNA到實時定量-PCR整個檢測過程只需6h，檢測準(zhǔn)確率達96％以上。
文檔編號C12Q1/68GK101475982SQ20081023508
公開日2009年7月8日 申請日期2008年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月17日
發(fā)明者周明國, 王建新, 陳長軍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)