專利名稱：多步發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的高產(chǎn)方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物化工技術領域，特別涉及多步發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的高產(chǎn)方法。
背景技術：
甘油即丙三醇是一種重要的多羥基醇，其用途廣泛，應用于牙膏、煙草、化妝品、 涂料工業(yè)等行業(yè)，己知在1700多種產(chǎn)品的生產(chǎn)中直接或間接以甘油為原料，甘油的生 產(chǎn)方法有化學合成法、油脂皂化水解法和微生物發(fā)酵法，在前兩種方法生產(chǎn)的甘油無 法滿足市場需求時，人們將注意力集中在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的研究上，其中研究 最多的是耐高滲酵母的發(fā)酵生產(chǎn)，提出了流加、連續(xù)生產(chǎn)及細胞固定化等技術，無錫 輕工學院與中科院化冶所等共同承擔的"發(fā)酵法生產(chǎn)甘油"專題攻關任務(諸葛健、
方慧英，微生物好氧發(fā)酵法生產(chǎn)甘油，精細與專用化學品，2001-20: 22-23)中，發(fā)酵 水平平均達到甘油含量106.9g/l，對糖轉(zhuǎn)化率達到50.39%;但發(fā)酵法生產(chǎn)甘油工藝 產(chǎn)業(yè)化的技術"瓶頸"在于甘油的提取(P.kishore, Concentration of Glycerol in Fermentation Baths by Reverse Osmosis, J.Microbio，Biotechnol, 1987,2(1): 22-27),原 因是在發(fā)酵后期，細胞對糖的消耗速率降低，盡管發(fā)酵液中殘?zhí)菨舛冗€處于一定水平， 但甘油卻開始被細胞消耗(Liu YQ, Liu DH, Su Q, Xie DM， Glycerol production by Ca"^/" Arww/ employing NaCl as an osmoregulator in batch and continuous fermentations., Biotechnol Lett 2002， 24: 1137-1140)。使得發(fā)酵被迫中止，這不僅影響 了最終甘油產(chǎn)量，而且在甘油蒸餾提取時，過高濃度的殘?zhí)窃诟邷叵乱捉够Y(jié)垢，使 甘油蒸餾十分困難，甚至無法進行；為此，人們相繼提出樹脂吸附法、載體蒸餾法(諸 葛建，中國專利，申請?zhí)?9103615)、殘?zhí)茄趸?蔡水洪，中國專利，申請?zhí)?94112202.6)、溶劑抽提(蔡水洪，中國專利，申請?zhí)?4112180.1)等方法，這些方 法的出發(fā)點是一致的，既不是通過發(fā)酵工藝優(yōu)化或菌種選擇來降低殘?zhí)?，而是待發(fā)教 停止后再設法將殘?zhí)呛透视头珠_，雖有一定效果，但受技術和成本的限制，都不盡理 想。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種多步發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的高產(chǎn)方法，通過通氣量和轉(zhuǎn)速 的調(diào)節(jié)將發(fā)酵分為四個階段，從而使發(fā)酵后期殘?zhí)秋@著降低，而甘油不返耗，同時能 夠得到較高的發(fā)酵甘油濃度和總糖轉(zhuǎn)化率，拉大了甘油和殘?zhí)呛康谋壤垢视偷?后提取更加容易。所述發(fā)酵工藝過程為
將酵母接入含IO-50g/l葡萄糖的種子培養(yǎng)基中，30'C 37'C培養(yǎng)20 24h,再將 種子液按體積5 10%的接種量加入含葡萄糖濃度為250~380g/l的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，
30 40'C條件下進行有氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中監(jiān)測發(fā)酵液的pH值、菌濃、葡萄糖和甘油 濃度，發(fā)酵12—24小時為第一階段，每間隔5 — 7小時調(diào)高一次通空氣量，根據(jù)發(fā)酵 罐的容量及罐型，最終通氣量調(diào)到0. 6 3. 5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速70 600rpm,繼續(xù)發(fā)酵進 入第二階段，保持通氣量和轉(zhuǎn)速不變并監(jiān)測葡萄糖、甘油濃度，當葡萄糖濃度低于30~ 50g/l時，進入第三階段的發(fā)酵，即每間隔4 6小時調(diào)低一次通氣量，最終通氣量調(diào) 到Ovvm，攪拌轉(zhuǎn)速10 50rpra，則進入第四階段的厭氧發(fā)酵，整個發(fā)酵過程中，當葡 萄糖濃度低于2g/l時即可中止發(fā)酵， 一般發(fā)酵周期為72-96小時，發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)束后， 采用板框、膜過濾、離心等手段將發(fā)酵液固液分離，清液通過濃縮、蒸餾、離子交換 和脫色等步驟將甘油分離、提純，制備成產(chǎn)品。
本發(fā)明所述的酵母為假絲酵母，屬產(chǎn)甘油的菌株。通氣量和轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)方式為單
獨或同時調(diào)節(jié)發(fā)酵通氣量和轉(zhuǎn)速。所述發(fā)酵方式包括批次流加發(fā)酵和連續(xù)發(fā)酵。
本發(fā)明的優(yōu)點在于，多步發(fā)酵法的新工藝使發(fā)酵后期殘?zhí)秋@著降低，而甘油不返 耗，同時能夠得到較高的發(fā)酵甘油濃度和總糖轉(zhuǎn)化率，拉大了甘油和殘?zhí)呛康谋壤?使甘油的后提取更加容易。
具體實施例方式
本發(fā)明提出了通過通氣量和轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)采用多步發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的高產(chǎn)工藝，下
面再以具體實施例對本發(fā)明予以進一步說明
實例l
(1) 菌種克魯斯假絲酵母(C朋^/fl ^rww/)
(2) 發(fā)酵方式2L機械攪拌發(fā)酵罐，通空氣批次發(fā)酵
(3) 發(fā)酵過程2L發(fā)酵罐，裝液量1.5L，發(fā)酵溫度控制在37'C,采用自然pH值。 發(fā)酵培養(yǎng)基初始含葡萄糖濃度為343.7g/L，通入空氣，通氣量1.5vvm,發(fā)酵罐攪 拌轉(zhuǎn)速400rpm，發(fā)酵過程中監(jiān)測發(fā)酵液的pH值、菌濃、葡萄糖和甘油濃度，第一階 段于發(fā)酵6、 12、 18、 24hr分別調(diào)高通氣量為2.0、 2.5、 3.0、 3.5vvm，轉(zhuǎn)速450、 500、 550、 600rpm;第二階段維持通氣量3.5vvm，轉(zhuǎn)速600rpm，并繼續(xù)監(jiān)測葡萄 糖、甘油濃度，發(fā)酵54hr時葡萄糖濃度為45.3g/1，則進入第三階段的發(fā)酵，于發(fā)酵 54、 58、 62hr分別調(diào)低通氣量為3.0、 2.5、 2.0vvm，轉(zhuǎn)速550、 500、 450rpm;此 時葡萄糖濃度分別為45.3、 17.7、 6.5g/l,甘油濃度為168、 181.1、 182.7g/l， 66hr 時葡萄糖濃度為O，甘油濃度為183.8g/l，尚未進入第四階段即可停止發(fā)酵，此時 對糖轉(zhuǎn)化率為53.48%。
同樣條件下，不采用多步發(fā)酵工藝進行發(fā)酵，則發(fā)酵到66hr葡萄糖濃度分別 為52.8g/l，甘油濃度為150.3g/l，84hr時葡萄糖和甘油濃度分別為21.5g/l、142.3g/1, 耗糖的同時甘油被反耗，發(fā)酵不得不停止，相比之下，采用多步發(fā)酵工藝甘油濃度由142.3g/L上升到182.7g/L，葡萄糖濃度濃度由21.5 g/L下降到0g/L,轉(zhuǎn)化率 由44.17%上升到53.48%，效果顯著。
實例2
(1) 菌種克魯斯假絲酵母(Om^Wfl ;bme0
(2) 發(fā)酵方式5噸機械攪拌發(fā)酵罐，通空氣批次發(fā)酵
(3) 發(fā)酵過程5噸發(fā)酵罐，裝液量4噸，發(fā)酵溫度控制在37'C，采用自然pH值。 發(fā)酵培養(yǎng)基初始含葡萄糖濃度為308.5g/L,通空氣量0.2vvm,發(fā)酵罐攪拌電機不 可調(diào)，固定轉(zhuǎn)速126rpm，發(fā)酵過程中監(jiān)測發(fā)酵液的pH值、菌濃、葡萄糖和甘油濃度, 第一階段于發(fā)酵6、 12、 18、 24hr分別調(diào)高通氣量為0.3、 0.4、 0.5、 0.6vvm,轉(zhuǎn) 速126rpm不變；第二階段維持通氣量0.6vvm，轉(zhuǎn)速126rpm，繼續(xù)監(jiān)測葡萄糖、 甘油濃度，發(fā)酵72hr時葡萄糖濃度為48.4g/1，則進入第三階段的發(fā)酵，于發(fā)酵72、 76、 80、 84hr分別調(diào)低通氣量為0.5、 0.4、 0.3、 Ovvm，在84hr時停止攪拌；用 蠕動泵進行罐外液體循環(huán)，此時葡萄糖濃度分別為48.4、 37.2、 20.4、 7.1g/l，甘 油濃度為136.2、 139.6、 147.6、 152.2g/l，然后進入第四階段的厭氧發(fā)酵，88hr時 葡萄糖濃度為0，甘油濃度為152.8g/l，停止發(fā)酵，轉(zhuǎn)化率為49.53%。發(fā)酵生產(chǎn)結(jié) 束后，采用板框過濾將發(fā)酵液固液分離，清液通過濃宿、蒸餾、離交和脫色等步驟將 甘油分離、提純，后提取總收率達到88.93%，產(chǎn)品甘油濃度為99.2%，并達到國家質(zhì) 量標準。
權(quán)利要求
1.一種多步發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的高產(chǎn)工藝，通過通氣量和轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)將發(fā)酵分為四個階段分段發(fā)酵，具體工藝過程為將酵母接入含10-50g/l葡萄糖的種子培養(yǎng)基中，30℃～37℃培養(yǎng)20～24小時，再將種子液按體積5～10％的接種量加入含葡萄糖濃度為250～380g/l的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，30～40℃條件下進行有氧發(fā)酵，發(fā)酵過程中監(jiān)測發(fā)酵液的pH值、菌濃、葡萄糖和甘油濃度，發(fā)酵12-24小時為第一階段，每間隔5-7小時調(diào)高一次通空氣量，根據(jù)罐子的容量及罐型，最終通氣量調(diào)到0.6～3.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速70～600rpm，繼續(xù)發(fā)酵進入第二階段，保持通氣量和轉(zhuǎn)速不變并監(jiān)測葡萄糖、甘油濃度，當葡萄糖濃度低于30～50g/l時，進入第三階段的發(fā)酵，每間隔4～6小時調(diào)低一次通氣量，最終通氣量調(diào)到0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速10～50rpm，則進入第四階段的厭氧發(fā)酵，無論進入那個階段，當葡萄糖濃度低于2g/l時中止發(fā)酵，發(fā)酵周期為72-96小時，發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)束后，采用板框、膜過濾、離心手段將發(fā)酵液固液分離，清液通過濃宿、蒸餾、離子交換和脫色等步驟將甘油分離、提純，制備成產(chǎn)品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于所述的酵母為假絲酵母屬產(chǎn) 甘油的菌株。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于所述通氣量和轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)方 式為單獨或同時調(diào)節(jié)發(fā)酵通氣量和轉(zhuǎn)速。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，其特征在于所述發(fā)酵方式包括批次流 加發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。
全文摘要
一種多步發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的高產(chǎn)方法，屬于生物化工技術領域。通過通氣量和轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)將發(fā)酵分為四個階段分段發(fā)酵，工藝步驟為將耐高滲酵母種子液按體積5～10％的接種量加入含葡萄糖濃度為250～380g/l的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，30～40℃條件下進行有氧發(fā)酵；每間隔6hr調(diào)高一次通空氣量，最終通氣量調(diào)到0.6～3.5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速70～600rpm，當葡萄糖濃度低于30～50g/l時，進入第三階段的發(fā)酵，每間隔4～6hr調(diào)低一次通氣量，最終通氣量調(diào)到0vvm，攪拌轉(zhuǎn)速10～50rpm，則進入第四階段的厭氧發(fā)酵，當葡萄糖濃度低于2g/l時中止發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液固液分離，將甘油分離、提純，制備成產(chǎn)品。優(yōu)點在于，使發(fā)酵后期殘?zhí)秋@著降低，而甘油不返耗。
文檔編號C12P7/02GK101343643SQ200810222028
公開日2009年1月14日 申請日期2008年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月5日
發(fā)明者劉宏娟, 劉德華, 燕 孫, 張建安 申請人:清華大學