專利名稱：酵母展示脂肪酶催化合成l-抗壞血酸油酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸油酸酯的方法。
背景技術(shù)：
BHA、BHT、PG、TBHQ等合成抗氧化劑廣泛用于食品工業(yè)，但是由于存在致癌，體內(nèi)消化后有毒性等安全隱患，其食用越來越受質(zhì)疑，天然抗氧化劑也因此備受青睞。L-抗壞血酸 (維生素C)是目前使用最多的天然抗氧化劑之一，隨著兩步發(fā)酵法生產(chǎn)維生素C技術(shù)的不斷成熟，我國生產(chǎn)維生素C產(chǎn)量已居世界之首，生產(chǎn)成本也相對較低。然而，維生素C是水溶性的天然抗氧化劑，只能在水相體系發(fā)揮作用，但食品體系往往是油相或者是多相的，這就大大局限了維生素C的使用范圍。將合適的親油性基團(tuán)“嫁接”到維生素C上合成脂溶性衍生物，從而改變其親水性及溶解性可有效解決這一問題。L-抗壞血酸油酸酯(L-ascorbyl oleate)是維生素C上“嫁接”油酸的衍生物，同廣泛使用的L-抗壞血酸棕櫚酸酯一樣， L-抗壞血酸油酸酯的穩(wěn)定性及溶解性好，且無體內(nèi)消化毒性。此外，其營養(yǎng)性和溶解性較 L-抗壞血酸棕櫚酸酯高，因此作為一種營養(yǎng)型抗氧化劑，L-抗壞血酸油酸酯在食品中具有巨大的應(yīng)用潛力。目前實(shí)現(xiàn)這一“嫁接”有化學(xué)法和生物酶法，由于化學(xué)法存在轉(zhuǎn)化條件苛刻(強(qiáng)酸、堿催化、高溫高壓)、無特異性、產(chǎn)物復(fù)雜、副產(chǎn)物多、分離難、安全性差等弊端，生物酶法越來越受青睞。脂肪酶是目前維生素酯合成中使用最廣泛的酶，但是生產(chǎn)成本高、固定化過程繁雜費(fèi)時(shí)大大局限了其商業(yè)化應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸油酸酯的方法，可顯著降低L-抗壞血酸油酸酯生產(chǎn)成本，同時(shí)達(dá)到較高的酯化反應(yīng)效率和產(chǎn)率。一種酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸油酸酯的方法，包括將L-抗壞血酸和油酸溶于有機(jī)溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，無氧條件下于50 60°C反應(yīng)4 8小時(shí)，分離、純化制得L-抗壞血酸油酸酯。優(yōu)選的，所述的有機(jī)溶劑為四氫呋喃。優(yōu)選的，每升有機(jī)溶劑中L-抗壞血酸、油酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為 15 35g、100 300ml、50 100g。攪拌速率為200 250轉(zhuǎn)/分鐘。優(yōu)選的，在分離純化前加入分子篩，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 12h，鎖住水分，促進(jìn)酯化
反應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行。所述的分離、純化為離心取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，水洗后溶于正己烷，
重結(jié)晶。所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備
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將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 144小時(shí)后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重組質(zhì)粒由原始載體pPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因組成。所述的脂肪酶基因可選用Genbank號為AF229435的序列，畢赤酵母(Pichia paStoriS)GS115為商業(yè)化產(chǎn)品，可從^witrogen公司購得。它的細(xì)胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 號為]\C8164。載體PPIC9K為商業(yè)化產(chǎn)品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信號肽序列(Genbank號Μ17301)，同時(shí)該載體內(nèi)信號肽序列上游存在AOXl啟動(dòng)子(Genbank號 Ζ46233)。重組質(zhì)粒線性化處理的目的是為了與胞內(nèi)基因組發(fā)生同源重組，提高表達(dá)穩(wěn)定性。優(yōu)選的，所述生物印跡所用配體為油酸，它可以誘導(dǎo)酶結(jié)構(gòu)改變，提高轉(zhuǎn)化率。本發(fā)明通過將脂肪酶基因和細(xì)胞壁α凝集素基因?qū)氘叧嘟湍讣?xì)胞GS115，畢赤酵母細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后，脂肪酶表達(dá)并分泌到胞外，同時(shí)利用細(xì)胞壁α凝集素將該脂肪酶固定在細(xì)胞表面。利用該酵母展示脂肪酶對酯化反應(yīng)進(jìn)行催化，不僅提高了操作穩(wěn)定性、耐熱性以及重復(fù)性，而且反應(yīng)產(chǎn)物單一(為6-O-Oleoly-L-ascorbic acid)，轉(zhuǎn)化率(以L-抗壞血酸計(jì))在89%以上，產(chǎn)率高達(dá)86%。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1制備酵母展示脂肪酶通過人工合成的方法，合成米根霉(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 號AF229435)和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因(Genbank號為Μ28164)，同時(shí)在脂肪酶基因C端加上連接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，連接后得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同時(shí)在序列兩端添加EcoR I和Not I酶切位點(diǎn)，其中 pro-ROL為脂肪酶基因，α-agglutinin為細(xì)胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列為模板，利用下述引物對，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反應(yīng)體系為模板DNA為1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下游引物各0. 5 μ 1，10XPCR緩沖液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR運(yùn)行條件為94°C 3分鐘，；35個(gè)循環(huán)(94°C 30秒，60°C 1分鐘，72°C 30秒)， 72 V 10分鐘。用EocR I和Not I同時(shí)酶切PCR產(chǎn)物和pPIC9K質(zhì)粒，并在T4連接酶的作用下過夜連接形成PPIC9K-R0L質(zhì)粒，通過電泳檢驗(yàn)并回收質(zhì)粒。為使目的基因與畢赤酵母GS115 發(fā)生His 4單位點(diǎn)置換重組，用Ml I對pPIC9K-R0L質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化處理。將酶切線性化處理好的目的基因約15 μ 1加入到事先準(zhǔn)備好的畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)入電轉(zhuǎn)杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Q，25uF條件下電擊10ms，并加入約Iml預(yù)冷的山梨醇。將上述混勻的電轉(zhuǎn)產(chǎn)物約400μ 1涂于MD平板上，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，然后將陽性轉(zhuǎn)化子涂于不同濃度的G418平板上，根據(jù)陽性轉(zhuǎn)化子對G418的抗性篩選出Mut表型的多拷貝陽性重組菌株。將多拷貝陽性重組菌株接種在BMGY培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)30h，離心收集細(xì)胞；再將細(xì)胞置于含有0.5% (體積百分比)甲醇的BMMY培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)144h，離心收集細(xì)胞， 用水沖洗后，接種至YGC培養(yǎng)基中30°C培養(yǎng)120h，然后3000g離心分鐘收集菌體，蒸餾水洗滌后再用50mM pH7. 0磷酸緩沖液洗滌，然后與2倍體積油酸混合，-80°C下預(yù)凍后再經(jīng)德國 Christ真空冷凍干燥機(jī)干燥Mh，用己烷洗滌除去油酸，再進(jìn)行再真空干燥去除己烷，即得到經(jīng)生物印跡處理的酵母展示脂肪酶。實(shí)施例2酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸油酸酯實(shí)例1取L-抗壞血酸0. 176g、油酸1. 27ml，加入含有IOmL四氫呋喃的磨口三角瓶，混合、預(yù)熱lOmin，然后加入上述酵母展示脂肪酶0. 5g，充隊(duì)密封，置于85_1型磁力攪拌器中攪拌開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在45°C，反應(yīng)他后加入0. 5g分子篩(孔徑小于2nm)，繼續(xù)反應(yīng)1 后停止攪拌，離心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子篩， 取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去四氫呋喃，水洗3次后加入正己烷于4°C結(jié)晶得L-抗壞血酸油酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實(shí)例2取L-抗壞血酸0.352g、油酸2. Mml加入含有IOmL四氫呋喃的磨口三角瓶，混合、預(yù)熱lOmin，然后加入上述酵母展示脂肪酶lg，充隊(duì)密封，置于85-1型磁力攪拌器中攪拌開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，反應(yīng)溫度保持在50°C，反應(yīng)他后加入1. 5g分子篩(孔徑小于2nm)，繼續(xù)反應(yīng)1 后停止攪拌，離心沉淀除去全細(xì)胞催化劑及分子篩，取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去四氫呋喃，水洗3次后加入正己烷于4°C結(jié)晶得L-抗壞血酸油酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實(shí)施例3采用傳統(tǒng)化學(xué)法合成L-抗壞血酸油酸酯實(shí)例1取L-抗壞血酸0. 176g、油酸1. 27ml，加入含有IOmL四氫呋喃的磨口三角瓶，混合、預(yù)熱lOmin，充N2密封，置于85_1型磁力攪拌器中攪拌開始反應(yīng)，轉(zhuǎn)速為250轉(zhuǎn)/ 分鐘，反應(yīng)溫度保持在45°C，反應(yīng)Mi后加入0. 5g分子篩(孔徑小于2nm)，繼續(xù)反應(yīng)1 后停止攪拌，離心沉淀除去分子篩，取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去四氫呋喃，水洗3次后加入正己烷于4°C結(jié)晶得L-抗壞血酸油酸酯產(chǎn)品，烘干、粉碎即可。實(shí)施例4測定轉(zhuǎn)化產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率取ImL未分離的反應(yīng)產(chǎn)物，離心去除催化劑和分子篩，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，用100%甲醇準(zhǔn)確定容至10mL，該溶液經(jīng)0. 22 μ m有機(jī)濾膜過濾后用高效液相色譜(HPLC)測定溶液各組分濃度。HPLC條件如下Agilent Technologies 1200系列高效液相色譜液，色譜柱 Grace Prevail Organic Acid 5u 150mmX4. 6mm，柱溫40 °C，流動(dòng)相甲醇 / 水 / 磷酸 (85/15/0. 1)，流速lmL/min，進(jìn)樣量10 μ L，檢測波長:254nm0產(chǎn)率計(jì)算公式如下產(chǎn)率=C ester/ (C L-ascorbic acid+C ester),式中C ester為HPLC測定樣品中L-抗壞血酸油酸酯的濃度，CL-ascorbic acid 為樣品中L-抗壞血酸的濃度。酯化反應(yīng)效率轉(zhuǎn)化率=CL-ascorbic acid(反應(yīng)后)/C L-ascorbic acid(反應(yīng)前)X 100%。
通過上述方法檢測計(jì)算，實(shí)施例2中，實(shí)例1合成L-抗壞血酸油酸酯的產(chǎn)率和反應(yīng)效率分別為86%和89%，實(shí)例2合成L-抗壞血酸油酸酯的產(chǎn)率和反應(yīng)效率分別為84% 和88%。而實(shí)施例3采用傳統(tǒng)化學(xué)法合成L-抗壞血酸油酸酯的產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化效率分別僅為 44%和 63%。
權(quán)利要求
1.一種酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸油酸酯的方法，包括將L-抗壞血酸和油酸溶于有機(jī)溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，無氧條件下于50 60°C 反應(yīng)4 8小時(shí)，分離、純化制得L-抗壞血酸油酸酯； 所述的酵母展示脂肪酶通過如下方法制備將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia paSt0riS)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72 144小時(shí)后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重組質(zhì)粒由原始載體PPIC9K和依次插入原始載體PPIC9K中MF α 1信號肽下游的脂肪酶基因和畢赤酵母GS115的細(xì)胞壁α凝集素基因組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，以每升有機(jī)溶劑計(jì)，L-抗壞血酸、油酸和酵母展示脂肪酶的加入量分別為15 35g、100 300ml、50 100g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑為四氫呋喃。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物印跡所采用配體為油酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種酵母展示脂肪酶催化合成L-抗壞血酸油酸酯的方法，包括將L-抗壞血酸和油酸溶于有機(jī)溶劑中，加入酵母展示脂肪酶，無氧條件下于50～60℃反應(yīng)4～8小時(shí)，分離、純化制得L-抗壞血酸油酸酯；將經(jīng)線性化處理的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115，將所得轉(zhuǎn)化子接種于BMMY培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)72～144小時(shí)后離心收集菌體，菌體經(jīng)沖洗、生物印跡和冷凍干燥制得酵母展示脂肪酶；本發(fā)明通過將脂肪酶展示在細(xì)胞外，利用該酶制劑催化合成L-抗壞血酸油酸酯，不僅提高了轉(zhuǎn)化效率，而且縮短了反應(yīng)時(shí)間，降低了生產(chǎn)成本。
文檔編號C12N1/19GK102212572SQ201110109010
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月28日
發(fā)明者何國慶, 周陳偉, 地里熱巴, 徐娟, 林吉恒, 王睿之, 阮暉 申請人:浙江大學(xué)