專利名稱：一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵純化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)，又名透明酸或玻璃酸，是一種大分子粘多糖，廣 泛存在于生物體的結(jié)締組織中。在不同組織中HA的生理作用有所不同，如在關(guān)節(jié)滑液中主 要為潤(rùn)滑作用；在血管壁中主要是調(diào)節(jié)通透性；在皮膚中主要表現(xiàn)為保水作用。另外，HA作 為聚陰離子電解質(zhì)，分子上所帶的大量負(fù)電荷，可調(diào)節(jié)周圍正負(fù)離子的濃度，抑制多種酶的 活性，廣泛應(yīng)用于眼科粘性手術(shù)、治療關(guān)節(jié)病、軟組織修復(fù)和作為藥物載體等，特別是預(yù)防 和減少外科手術(shù)后組織粘連中取得了較大的進(jìn)展。生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法有動(dòng)物提取法，即直接從動(dòng)物體中提取，受原料的限制，該方 法所生產(chǎn)的透明質(zhì)酸產(chǎn)量并不能滿足人們的需要，而且由于該方法是從動(dòng)物體中直接提取 透明質(zhì)酸，所得到的透明質(zhì)酸的質(zhì)量也不能控制，從而導(dǎo)致透明質(zhì)酸產(chǎn)量和質(zhì)量的不穩(wěn)定。 為提高透明質(zhì)酸的產(chǎn)量和質(zhì)量，近年來(lái)，人們開始利用微生物發(fā)酵的方式生產(chǎn)透明質(zhì)酸，微 生物發(fā)酵后的發(fā)酵液需要采用合適的提純方法對(duì)該發(fā)酵液進(jìn)行提純，現(xiàn)有提純方法一般有 過濾法，該法采用生物膜過濾，由于發(fā)酵液中菌體等雜質(zhì)較多，極易造成膜孔堵塞，過濾時(shí) 間長(zhǎng)，濾液中所含蛋白等雜質(zhì)較多，所生產(chǎn)的透明質(zhì)酸產(chǎn)品質(zhì)量較低，不能應(yīng)用于醫(yī)藥行 業(yè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是透明質(zhì)酸分離純化過程中，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過濾的耗 時(shí)長(zhǎng)，濾液中所含蛋白等雜質(zhì)較多，從而使生產(chǎn)出的透明質(zhì)酸不能應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)的問題， 并提供一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案解決該技術(shù)問題一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，至少包括純化方法部分，所述純化方法部分以 透明質(zhì)酸發(fā)酵液為原料，所述純化方法部分包括a、用第一乙醇稀釋透明質(zhì)酸發(fā)酵液，所得稀釋液用硅藻土和珍珠巖預(yù)涂的板框進(jìn) 行過濾，得到透明質(zhì)酸濾液；b、將透明質(zhì)酸濾液加入第二乙醇進(jìn)行沉淀，沉淀用水溶解，所得溶解液加入十六 烷基三甲基氯化銨溶液進(jìn)行絡(luò)合，所得沉淀用水清洗，得到絡(luò)合沉淀，將絡(luò)合沉淀加入到第 一氯化鈉溶液進(jìn)行解離，得到解離液；C、將解離液用第三乙醇沉淀，所得沉淀脫水干燥得到透明質(zhì)酸。本發(fā)明采用硅藻土和珍珠巖預(yù)涂的板框進(jìn)行過濾，其中珍珠巖作為助濾劑，使得 到的透明質(zhì)酸濾液濁度、蛋白等雜質(zhì)含量均有大幅度下降。作為一種優(yōu)選，本發(fā)明所采用的硅藻土為細(xì)號(hào)硅藻土，珍珠巖為中號(hào)珍珠巖，中號(hào) 珍珠巖介于粗號(hào)和細(xì)號(hào)珍珠巖之間，既保留了粗號(hào)珍珠巖的架橋作用又起到細(xì)號(hào)珍珠巖的吸附作用，保持較高空隙率，縮短過濾時(shí)間，同時(shí)，細(xì)號(hào)硅藻土的吸咐作用較好，能保障被過 濾液體的透光好。為使上述有益效果能夠順利實(shí)現(xiàn)，a步驟中所使用的板框是采用預(yù)涂比例為 10 1-100的中號(hào)珍珠巖與細(xì)號(hào)硅藻土進(jìn)行預(yù)涂的。表1是某兩次生產(chǎn)透明質(zhì)酸的產(chǎn)品質(zhì)量的對(duì)比，這兩次生產(chǎn)透明質(zhì)酸的純化方法 以相同的透明質(zhì)酸發(fā)酵液為原料，除了過濾透明質(zhì)酸發(fā)酵液是否使用珍珠巖有所不同，透 明質(zhì)酸發(fā)酵液的純化所涉及的其它各種條件均在本發(fā)明所限定的范圍內(nèi)進(jìn)行且一致。表 權(quán)利要求
一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，至少包括純化方法部分，所述純化方法部分以透明質(zhì)酸發(fā)酵液為原料，所述純化方法部分包括a、用第一乙醇稀釋透明質(zhì)酸發(fā)酵液，所得稀釋液用硅藻土和珍珠巖預(yù)涂的板框進(jìn)行過濾，得到透明質(zhì)酸濾液；b、將透明質(zhì)酸濾液加入第二乙醇進(jìn)行沉淀，沉淀用水溶解，所得溶解液加入十六烷基三甲基氯化銨溶液進(jìn)行絡(luò)合，所得沉淀用水清洗，得到絡(luò)合沉淀，將絡(luò)合沉淀加入到第一氯化鈉溶液進(jìn)行解離，得到解離液；c、將解離液用第三乙醇沉淀，所得沉淀脫水干燥得到透明質(zhì)酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于該方法還包括 發(fā)酵方法部分，所述發(fā)酵方法部分以獸疫鏈球菌H23為發(fā)酵菌株，所述發(fā)酵方法部分包括(1)、將獸疫鏈球菌H23接種至腦心浸出粉瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，得到獸疫鏈球菌 H23菌體；(2)、配置種子培養(yǎng)基，所述種子培養(yǎng)基由蔗糖、酵母粉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸錳、 微量元素液、緩沖液組成，所述微量元素液由氯化鈣、氯化鋅、硫酸錳、硫酸銅組成，所述緩 沖液由磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉組成，配置種子培養(yǎng)基所用的水為注射用水，種子培養(yǎng)基預(yù) 先用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至7. 2后滅菌，將獸疫鏈球菌H23菌體接種至種子培養(yǎng)基培養(yǎng)，得 到獸疫鏈球菌H23種子培養(yǎng)液；(3)、配置發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由蔗糖、酵母粉、硫酸鎂、磷酸二氫鈉、硫酸鉀、 精氨酸、微量元素液、緩沖液組成，所述微量元素液由氯化鈣、氯化鋅、硫酸錳、硫酸銅組成， 所述緩沖液由磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉組成，配置發(fā)酵培養(yǎng)基所用的水為注射用水，發(fā)酵培 養(yǎng)基預(yù)先用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至7. 2后滅菌，將獸疫鏈球菌H23種子培養(yǎng)液接種至發(fā)酵培 養(yǎng)液，得到透明質(zhì)酸發(fā)酵液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于a步驟中所使 用的珍珠巖為中號(hào)珍珠巖，所使用的硅藻土為細(xì)號(hào)硅藻土，珍珠巖與硅藻土的預(yù)涂比例為 10 1-100。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于在b步驟 和c步驟之間，還包括對(duì)b步驟的解離液進(jìn)行吸附純化處理步驟，所述吸附純化處理步驟包 括向b步驟解離液加入活性炭進(jìn)行第一次吸附，得到第一中間產(chǎn)物；第一中間產(chǎn)物加入硅藻土進(jìn)行脫碳過濾，所得濾液再經(jīng)過濾芯進(jìn)行除菌過濾，得到第 一濾液；第一濾液用第四乙醇進(jìn)行沉淀，收集沉淀，加入第二氯化鈉溶液溶解，再加入活性炭進(jìn) 行第二次吸附，得到第二中間產(chǎn)物；第二中間產(chǎn)物加入硅藻土進(jìn)行脫碳過濾，所得濾液再經(jīng)過濾芯進(jìn)行除菌過濾，得到第 二濾液，所述第二濾液為c步驟的解離液。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于b步驟中 十六烷基三甲基氯化銨的加入量為透明質(zhì)酸濾液經(jīng)第二乙醇所得沉淀質(zhì)量的1-10倍，所 述十六烷基氯化銨溶液的質(zhì)量百分比濃度為10%。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于b步驟中十六烷基三甲基氯化銨的加入量為透明質(zhì)酸濾液經(jīng)第二乙醇所得沉淀質(zhì)量的1-10倍，所述 十六烷基氯化銨溶液的質(zhì)量百分比濃度為10%。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于第一乙醇、 第二乙醇及第三乙醇的質(zhì)量百分比濃度為95%，第一氯化鈉溶液濃度為0. 5mol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于第四乙醇的質(zhì)量百分比濃度為95%，第二氯化鈉溶液濃度為0. 5mol/L ；活性炭的加入量以以下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行每一百毫升待加入活性炭的液體中，活性炭的加入量為0. 05g-5g。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于(2)步驟的種子培養(yǎng)液中蔗糖濃度為10-30g/L，酵母粉濃度為15.0-25.0g/L，硫酸鎂 濃度為1. 0-5. Og/L，磷酸二氫鉀濃度為1. 0-4. Og/L，硫酸錳濃度為0. 01-0. 2g/L，微量元素 液濃度為0. 5-10ml/L,緩沖液為10-200ml/L ；所述微量元素液中氯化鈣濃度為500-5000mg/L，氯化鋅濃度為10-200mg/L，硫酸錳濃 度為l_50mg/L，硫酸銅濃度為l-100mg/L ；所述緩沖液中磷酸氫二鈉濃度為10_70g/L，磷酸二氫鈉濃度為5-30g/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求2或9所述的一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于(3)步驟的發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30-120g/L，酵母粉濃度為15.0-25. Og/L，硫酸鎂 濃度為1. 0-5. Og/L，磷酸二氫鈉濃度為1. 0-6. Og/L，硫酸鉀濃度為0. 5-4. 0g/L，精氨酸濃 度為0. 01-0. 2g/L，微量元素液濃度為l-10ml/L，緩沖液濃度為5_200ml/L ；所述微量元素液中氯化鈣濃度為200-5000mg/L，氯化鋅濃度為5_300mg/L，硫酸錳濃 度為l_50mg/L，硫酸銅濃度為l-200mg/L ；所述緩沖液中磷酸氫二鈉濃度為10_70g/L，磷酸二氫鈉濃度為5-30g/L。
11.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于(2)步驟中種 子培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37°C，震蕩培養(yǎng)10-14小時(shí)。
12.根據(jù)權(quán)利要求2或11所述的一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，其特征在于(3)步 驟中的發(fā)酵過程中，發(fā)酵攪拌速度為100-400rpm，發(fā)酵溫度為37°C，用30%氫氧化鈉溶液 調(diào)節(jié)，使發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值在7. 0士0. 1之間，通氣量為lvvm，發(fā)酵時(shí)間為18-22小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明屬于發(fā)酵純化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種生產(chǎn)醫(yī)藥級(jí)透明質(zhì)酸的方法，為了解決現(xiàn)有透明質(zhì)酸分離純化過程中，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過濾的耗時(shí)長(zhǎng)，濾液中所含蛋白等雜質(zhì)較多的問題，本發(fā)明采用硅藻土和珍珠巖預(yù)涂的板框?qū)ν该髻|(zhì)酸發(fā)酵液進(jìn)行過濾，采用該方案可以使得到的透明質(zhì)酸濾液濁度、蛋白等雜質(zhì)含量均有大幅度下降，生產(chǎn)出的透明質(zhì)酸質(zhì)量高，符合醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用要求。
文檔編號(hào)A61K47/36GK101935363SQ20091005415
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月30日
發(fā)明者付愛玲, 張延良, 曾輝, 黃宇 申請(qǐng)人:上海佰加壹醫(yī)藥有限公司