專利名稱:用細菌培養(yǎng)生產(chǎn)透明質(zhì)酸的制作方法
透明質(zhì)酸是從生物中提取的一種粘多糖體。已發(fā)現(xiàn)其在緩沖生理鹽水中鈉鹽即透明質(zhì)酸鈉，在眼科手術(shù)及其他醫(yī)學應(yīng)用中可作為玻璃體的替代物有重要用途。在美國專利4141，973及4，328，803中已描述了一些在這方面的應(yīng)用。為了這類醫(yī)學上的目的，到目前為止曾經(jīng)使用了分子量超過75萬的無熱原高純度透明質(zhì)酸鈉。由新澤西州Piscataway的Pharmacia公司生產(chǎn)的名為“海龍(Healon)”的商品是為這類目的而出售的透明質(zhì)酸鈉的1%溶液。例如，據(jù)報道烯海龍液(含0.1-0.2%的透明質(zhì)酸鈉)眼藥水。作為治療干性角膜炎綜合癥很有用。透明質(zhì)酸還用于試管培養(yǎng)麻瘋桿菌作為配料及用作化妝品配方中的一種成份，這在美國專利4，303，676中說明的配方中既包括低分子量組份(約10～5萬)又包括較高的分子量組份(超過1百萬)。所有上述用途的透明質(zhì)酸的來源為公雞之冠，人的臍帶或其他脊椎動物的組織。從這類組織中提取并提純的透明質(zhì)酸價格非常昂貴。用鏈球菌的A組和C組菌株能夠生產(chǎn)透明質(zhì)酸。曾經(jīng)報道的作為細菌產(chǎn)品的一種用途是在人的血清中測定抗鏈球菌的透明質(zhì)酸酶時作為試劑的，參見Kjems及Lebech在斯堪納維亞病理學微生物學學報B部分84162-164(1976)一文。在該論文中作者敘述了培養(yǎng)A組鏈球菌的限定配方的培養(yǎng)基，報道的產(chǎn)量為每公升培養(yǎng)肉湯中可分離出透明質(zhì)酸0.3克。然而用細菌生產(chǎn)的透明質(zhì)酸還未發(fā)現(xiàn)有實質(zhì)上的用途，因為該酸屬于低分子量范圍。
本發(fā)明提供的用細菌源生產(chǎn)的透明質(zhì)酸，其分子量范圍比在先有技術(shù)中已報道過的用細菌源生產(chǎn)出的透明質(zhì)酸的分子量范圍更高。本發(fā)明提供的方法，其產(chǎn)量也比以前報道過的大大提高。該方法另外還生產(chǎn)醫(yī)用的、純度可與現(xiàn)有的相比擬或更好的透明質(zhì)酸。雖然在典型情況下用本方法生產(chǎn)的透明質(zhì)酸具有的平均分子量約為五萬五千，但作為眼藥水的成份及化妝品配方的成份，它有潛在的重要用途。用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的透明質(zhì)酸產(chǎn)量高、純度高、成本低，因而可用于以前沒有敘述過的地方，或是用哺乳類動物源或低產(chǎn)量的細菌源所生產(chǎn)的透明質(zhì)酸未曾打算用的地方。例如透明質(zhì)酸可以在食品加工中用作致濕劑，其他應(yīng)用方面，有作為潤滑劑，及在外科手術(shù)后用來減少由于纖維化反應(yīng)及/或粘連形成所引起的并發(fā)癥。該材料還可以用于回收第三紀原油時作為聚丙烯酰胺的代用品，類似的合成聚合物或從生物中生產(chǎn)出的聚合物。
本發(fā)明的方法的最佳形式包括在無氧條件下在二氧化碳富集的生長培養(yǎng)基(其中包括用細菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸所需的那些原料)中培養(yǎng)出可生產(chǎn)透明質(zhì)酸的鏈球菌菌種。雖然不是必需殺死細菌但最好殺死細菌，將細菌與生長培養(yǎng)基分離，在離析出透明質(zhì)酸。最好在肉湯培養(yǎng)基分離，再離析出透明質(zhì)酸。最好在肉湯培養(yǎng)基中發(fā)酵使細菌生長。其他生長技術(shù)及培養(yǎng)基都可以使用。例如可以用瓊脂培養(yǎng)基。所以“生長培養(yǎng)基”一詞在此可以廣義地指液體或固體培養(yǎng)基或兩者的組合，且發(fā)酵之外的其其他生長方式，在技術(shù)上是眾所周知的。
雖然本發(fā)明的最佳方式是設(shè)想在可產(chǎn)生透明質(zhì)酸的培養(yǎng)基中直接生長細菌，但也可以在其他生長培養(yǎng)基中生長細菌，將細菌與培養(yǎng)基分離，在緩沖懸浮液或蒸餾水中再懸浮細菌，并在懸浮液中加適當?shù)脑弦员阌靡呀?jīng)生長細菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸。這種被看作為與最佳方法相同的工藝僅包括使用靜止的細胞懸浮液。因而此處“使培養(yǎng)物生長”等詞都應(yīng)當作是包括在其范圍中的兩種手段。
與以前透明質(zhì)酸的生產(chǎn)方式不同，在接種前可以通過1萬(10K)額定分子量限制截止過濾器如微孔聚胺膜盒式切向流過濾系統(tǒng)來濾掉所有成份，從一開始就將內(nèi)毒素從系統(tǒng)中排出，其后維持無熱無氧的生長條件。
在本發(fā)明的最佳實施例中，使用了諸如含有以下成份的半限定生長培養(yǎng)基
1.酪蛋白水解液，酶催性 20.0克
2.氯化鉀 3.0克
3.磷酸鈉，二代性 2.8克
4.硫酸鎂(7H2O) 0.5克
5.氯化鈣(2H2O) 10.0毫克
6.葡萄糖 20.0毫克
7.維生素溶液
A)D-生物素 2.0毫克
B)D-泛酸鈣 1.0毫克
C)氯化膽堿 1.0毫克
D)葉酸 1.0毫克
E)I-肌醇 2.0毫克
F)煙酰胺 1.0毫克
G)鹽酸吡哆醛 1.0毫克
H)核黃素 0.1毫克
I)鹽酸硫胺素 1.0毫克
該培養(yǎng)基可配制成帶有反透析、無熱原的水1公升。當然適用于此目的的其他生長培養(yǎng)基也可以使用。
一百毫升的18型化膿性鏈球菌的培養(yǎng)物在無氧條件下在37±1℃生長6小時。上述的其他可產(chǎn)生透明質(zhì)酸的細菌也可以使用，但以18型為最佳。用此六小時培養(yǎng)物為五升同樣的培養(yǎng)基接種并生長到高可見密度，最好生長到至少每毫升含2億個細胞且典型的為生長到每毫升含5億個細胞。然后此五升接種物用來在200升發(fā)酵桶中為160升的培養(yǎng)基接種開始進行生產(chǎn)，一面連續(xù)攪拌，一面灌輸二氧化碳氣使培養(yǎng)物生長，灌輸?shù)牧魉賾?yīng)足以維持二氧化碳的溶解水平并用二氧化碳監(jiān)測探頭加以探測。而以二氧化碳溶解水平為5-10%時最佳。灌輸?shù)臍怏w以氮/二氧化碳的混合物為最佳且以85/15的比例為最佳，但并不嚴格，當將氣體引入到C級箱室中時對氣體進行過濾殺菌。溫度控制在約37±1℃的最佳值上。PH值最好控制在基本上為恒定值±0.1，恒定值的范圍則約為6.5～7.5，由PH值探頭/控制器監(jiān)控，并由控制器控制添加氫氧化鉀。當培養(yǎng)物的PH值停止下降(不再需要加氫氧化鉀來維持PH值在規(guī)定限度之內(nèi))時或者當細胞密度達到高可見密度為典型的每毫升細胞有10-50億個時可視為已完全發(fā)酵。此時通過加入100%飽和的三氯乙酸的水溶液使發(fā)酵混合物達到最終三氯乙酸濃度約為5%時將發(fā)酵過程終止。此情況可以變化。
往發(fā)酵肉湯內(nèi)添加三氯乙酸不僅由于殺死細菌而終止生長而且還由于出現(xiàn)細胞絮凝，使得從肉湯中分離細胞相當容易。不加三氯乙酸的混合物是很難分離的，且會對肉湯成份、微生物及多醣體(即透明質(zhì)酸)的完整性造成嚴重破壞。不加三氯乙酸用離心沉淀或過濾的方法就無法分離。雖然有可能用其他方式例如熱處理來結(jié)束培養(yǎng)物的生長但用三氯乙酸處理的優(yōu)點是其后分離透明質(zhì)酸方便。通過使用上述微孔的切向流過濾系統(tǒng)的0.22微米孔徑的耐用孔過濾盒來將發(fā)酵混合物從發(fā)酵桶中泵出。此步驟使160升的細胞濃縮為約5升。保留濾液并對于導(dǎo)電率大于10兆歐姆的反透析水使用額定分子量30000截止的多微孔聚酰胺膜盒式系統(tǒng)進行滲析過濾，直到連續(xù)排出的濾液的導(dǎo)電率達到大約0.5兆歐為止。滲析過濾是一種與常規(guī)的被動滲析技術(shù)不同的強制滲析技術(shù)，諸如在麻省01730，貝得福特的微孔公司的1981年樣本號OM029中名為多孔聚酰胺膜盒式系統(tǒng)中所公開的技術(shù)。然后用不進一步加水的連續(xù)過濾方法對透明質(zhì)酸進行濃縮。
然后用試劑級乙醇對濃縮物進行處理，最佳比值為3∶1。其他醇、丙酮、氯仿或其他有機溶劑及某些有機鹽諸如“CETAB”(一種混合的溴化三甲基銨)也可以用來使透明質(zhì)酸或透明質(zhì)酵鈉從水溶液中沉積。這樣做時不應(yīng)有任何混合動作，但將透明質(zhì)酸泵進溶劑的操作可以除外。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在處理用醇時攪拌會減少透明質(zhì)酸的產(chǎn)量。此步驟中產(chǎn)生的沉積物可在溫度為4℃時在黑暗中長時期存放。
如在上述程序中所見的那樣，發(fā)現(xiàn)了一種獨特的方法，即用從肉湯中離析透明質(zhì)酸要用兩步法，其中第一步為分子量分離是用滲析過濾法從肉湯的基本上全部低分子量成份中分離該酸，第二步是用沉淀法從任何剩下的肉湯組合物中分離該酸。
沉淀出的透明質(zhì)酸能用許多常規(guī)的技術(shù)進行去水(去掉大量的水/醇溶液)，且然后在反滲透水中或0.15克分子的氯化鈉溶液中再懸浮。然后將懸浮物質(zhì)凍干，濺干，真空干燥或滲析過濾以去掉最后的醇跡。進一步進行提純是通過制成PH值為8.0的硼酸鹽緩沖溶液其中透明質(zhì)酸的濃度約為10毫克/毫升來進行的。然后將0.32%的CETAB(一種混合物的溴化三甲基銨)加入溶液及混合物中并在4℃終夜攪拌以提供透明質(zhì)酸鈉沉淀。也可以使用其他沉淀劑，諸如氯化十六烷苯基偶氮二氨基吡啶或有關(guān)的鹽。用粗濾及在由反滲透水制造的1克分子的氯化鈉溶液中再懸浮來回收沉淀物。然后對再懸浮透明質(zhì)酸進行摻析過濾及濃縮如上。然后可將得到的透明質(zhì)酸進行過濾殺菌后使用或轉(zhuǎn)換為透明質(zhì)酸鈉，然后過濾殺菌后使用。
常規(guī)的去水技術(shù)包括加壓，離心，添加化學劑等等。選用的特殊技術(shù)取決于沉淀物以后的使用情況。
如需要醫(yī)藥級的無熱原產(chǎn)品，應(yīng)使用無熱原過濾過的生長培養(yǎng)基，且包括對透明質(zhì)酸/透明質(zhì)酸鈉的離析及處理等的全部工藝操作都應(yīng)在100級的凈室內(nèi)使用無熱原容器進行。如果該物質(zhì)僅用于化學級的應(yīng)用，則操作室的清潔度，及收集容器相對于熱原要求不嚴格。
本發(fā)明的方法強調(diào)在不通風條件下生長細胞，因而可以防止鏈球菌產(chǎn)生正常的最終產(chǎn)品的補體，主要是熱原性外毒素。該細菌的外毒素是眾所周知的。上述生長條件還可使透明質(zhì)酸的產(chǎn)量比以前報導(dǎo)過的更高。使用上述最佳細胞生長及離析條件，每升培養(yǎng)肉湯中最少可得到5克透明質(zhì)酸。在不通風的情況下能得到高產(chǎn)量是意想不到的，因為人們都認為透明質(zhì)酸的功能之一是為細胞提供氧障，只有在暴露在氧氣之下才能期望得到最高的產(chǎn)量。
用上述制備的透明質(zhì)酸/透明質(zhì)酸鈉的平均分子量約為55000±20%，其分子量的總范圍約為1萬～2百萬，可用凝膠過濾法或用準彈性光散射法測得。這些技術(shù)都為人們所熟知，測量誤差及用上法得到的結(jié)果都是由于生物上的變化引起的。產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量在0.03%～0.3%之間，并與分析的方法有關(guān)。百分之一溶液的紫外線吸收在260毫微米時為0.314，在280毫微米時為0.169。百分之一溶液的粘度約為300厘拖。
用本發(fā)明方法生產(chǎn)的0.5-1.5%的無熱原透明質(zhì)酸鈉溶液可用作眼藥水的成份，以代替從高分子量的公雞雞冠中得到透明質(zhì)酸的很稀的溶液，現(xiàn)可用來治療干性角膜炎。
其他在A組及C組菌株中能生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的鏈球菌也可以用于本發(fā)明中。此外，不離開在下述權(quán)利要求
中提出的發(fā)明，也可以對生長培養(yǎng)基及生長條件與離析工藝作些改變。
權(quán)利要求
1、一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法，包括
在二氧化碳富集，無氧的情況下在生長培養(yǎng)基中使可產(chǎn)生透明質(zhì)酸的鏈球菌的肉湯培養(yǎng)物發(fā)酵；
使細菌細胞與發(fā)酵后肉湯分離；及從肉湯剩下的組成物中離析透明質(zhì)酸。
2、為權(quán)利要求
1所述的方法，其中在接種前通過一萬分子量截止過濾器對生長培養(yǎng)基進行過濾，使生長培養(yǎng)基做到無熱原。
3、為權(quán)利要求
1所述的方法，其中細菌細胞分離步驟包括首先將三氯乙酸加進肉湯。
4、如權(quán)利要求
3所述的方法，其中三氯乙酸應(yīng)加到使發(fā)酵混合物的最終濃度為5-6%為止。
5、為權(quán)利要求
3所述的方法，其中添加上述三氯乙酸后細菌的生長就終止。
6、為權(quán)利要求
1所述的方法，其中離析的完成是通過分離酸及那些具有類似的或較高分子量的肉湯組成物然后用沉淀法使酸與那些相似的肉湯組成物分離。
7、如權(quán)利要求
6所述的方法，其中沉淀是通過將透明質(zhì)酸及剩余肉湯組成物加到醇中去而不作實質(zhì)性混合來完成的。
8、如權(quán)利要求
1所述的方法其中離析是通過使肉湯和細胞分離滲析過濾肉湯，及將溶液加到有機溶劑中去而不作實質(zhì)性混合，使酸在溶液中沉淀來完成的。
9、如權(quán)利要求
1所述的方法，其中發(fā)酵步驟包括在發(fā)酵全過程中將PH值控制在6.5-7.5的范圍中基本上為恒定值±0.1、且將溫度控制在37±1℃。
10、如權(quán)利要求
9所述的方法，其中PH值的控制是通過用PH探頭/控制器來自動加堿。
11、如權(quán)利要求
1所述的方法，其中溶解的二氧化碳濃度維持在約為5-10%。
12、如權(quán)利要求
1所述的方法，其中在細菌停止生長前生長到密度為每毫升2億細胞。
13、如權(quán)利要求
1所述的方法，其中細菌為18型化膿性鏈球菌。
14、如權(quán)利要求
6所述的方法，其中過濾生長培養(yǎng)基是在用細菌培養(yǎng)物接種前通過一萬分子量截止過濾器進行的，且實行剩余步驟是在100級的凈室中并使用無熱原容器的條件下進行的。
15、如權(quán)利要求
14中所述的方法，進一步包括精制離析出的透明質(zhì)酸是在將其溶解在溫和的堿性緩沖溶液中，用混合的溴化烷基三甲基銨使透明質(zhì)酸沉淀，在稀氯化鈉溶液中使沉淀物再懸浮及通過將懸浮物加到乙醇，且不作攪拌，對其再沉淀得酸。
16、透明質(zhì)酸其分子量組份范圍約從一萬到二百萬道爾頓，其平均分子量約5.5萬道爾頓±約20%其生產(chǎn)是通過
在二氧化碳富集的生長培養(yǎng)基中在無氧條件下使可生產(chǎn)透明質(zhì)酸的鏈球菌細菌的肉湯培養(yǎng)基發(fā)酵;
使細菌細胞與發(fā)酵的肉湯分離;及從肉湯的剩余組成物中離析透明質(zhì)酸。
17、為權(quán)利要求
16所述的酸，其中細菌為18型化膿性鏈球菌。
18、為權(quán)利要求
16所述的酸，其中離析是通過分離酸與那些有相似的或較高分子量的肉湯組成物及然后用沉淀法將酸與那些相似的肉湯組成物分離來完成的。
19、如權(quán)利要求
17所述的酸，其中沉淀是通過將透明質(zhì)酸及剩余的肉湯組成物加到乙醇中去且不作任何實質(zhì)上的混合來完成的。
20、如權(quán)利要求
16所述的酸，其中離析是通過使肉湯和細胞分離，滲析過濾肉湯及將溶液加到有機溶劑而不作任何實質(zhì)性的混合使酸在溶液中沉淀
21、如權(quán)利要求
16所述的酸其中蛋白質(zhì)的含量范圍在約0.3%與約0.03%之間，1%的溶液的紫外線吸收在260毫微米時為0.314，在280毫微米時為0.169，且粘度約為300厘拖。
22、為權(quán)利要求
21所述的酸，其中離析是通過分離酸與那些有相似的或較高分子量的肉湯組成物及然后用沉淀法將酸與那些相似肉湯組成物分離來完成的。
23、為權(quán)利要求
22所述的酸，其中沉淀是通過將酸及剩余的肉湯組成物加進乙醇中去而不作實質(zhì)性的混合來完成的。
24、如權(quán)利要求
21所述的酸，其中離析是通過使肉湯與細胞分離滲析過濾肉湯及將溶液加到有機溶劑中去而不作實質(zhì)性的混合，使酸在溶液中沉淀來完成的。
25、在生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法中包括用細菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸，其改進包括通過將酸與那些含有相似的或更高的分子量的肉湯組成物與液體分離且然后用沉淀法使醇與那些相似的肉湯組成物分離來將酸從細菌在其中生長的肉湯中離析出來。
26、如權(quán)利要求
25所述的方法，其中細菌為18型化膿性鏈球菌。
27、如權(quán)利要求
25所述的方法，其中沉淀是通過將酸與剩余的肉湯成份加到乙醇中去而不作實質(zhì)性的混合來完成的。
28、如權(quán)利要求
25所述的方法，其中離析是通過將肉湯與細菌分離，滲析過濾肉湯，及通過在將溶液加到有機溶劑中去而不作任何實質(zhì)性混合，使酸在溶液中沉淀來完成的。
29、在生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法中包括用細菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸，其改進包括在細菌生長培養(yǎng)基的環(huán)境中維持二氧化碳富集無氧的條件。
30、一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法其中
在二氧化碳富集無氧的條件下在生長培養(yǎng)基中使可產(chǎn)生透明質(zhì)酸的鏈球菌的培養(yǎng)物生長。
形成細菌及其副產(chǎn)物的液態(tài)懸浮液，形成這種懸浮液不是所用的生長方法的固有性質(zhì)。
將細菌細胞與懸浮液分離及從剩余液體的組成物中離析透明質(zhì)酸。
31、如權(quán)利要求
30中所述的方法，其中離析是通過將酸與那些有相似或較高分子量的液體組成物與液體分離及然后將酸與那些相似組成物分離來完成。
32、如權(quán)利要求
30所述的方法，其中生長步驟包括在發(fā)酵全過程中控制PH值在6.5-7.5的范圍內(nèi)大體上為恒定值±0.1且控制溫度為37±1℃。
33、如權(quán)利要求
30所述的方法，其中PH值用PH探頭/控制器自動加堿進行控制。
34、透明質(zhì)酸其分子量組份的范圍從約十萬到約二百萬，平均分子量約為55，000±約20%，其生產(chǎn)是通過
在二氧化碳富集無氧的條件下使可產(chǎn)生透明質(zhì)酸的鏈球菌的培養(yǎng)物生長。
形成細菌及其副產(chǎn)物的液態(tài)懸浮液，形成這種懸浮液不是所用生長方法的固有性質(zhì)。
將細菌細胞與懸浮液分離及從剩余液體的組成物中離析透明的質(zhì)酸。
從剩余液體的組成物中離析透明質(zhì)酸。
35、如權(quán)利要求
34所述的酸其中離析是通過將酸，及那些有相似或較高分子量的組成物與液體分離且然后將酸與那些相似組成物分離來完成。
36、如權(quán)利要求
35所述的酸，其中用沉淀法進行最后分離，沉淀的完成是通過將酸及剩余組成物加到乙醇中去而不作實質(zhì)性的混合來完成的。
37、如權(quán)利要求
34所述的酸，其中蛋白質(zhì)含量范圍在約0.3%及0.03%之間，1%溶液的紫外線吸收在260毫微米時為0.314，在280毫微米時為0.169，且粘度約為300厘拖。
38、如權(quán)利要求
37所述的酸，其中離析是通過將酸及那些有相似或較高分子量的組成物與液體分開且然后將酸與那些相似的組成物分離來完成。
39、為權(quán)利要求
38所述的酸，其中最后分離是用沉淀法，沉淀是通過將酸及剩余組成物加進乙醇中去且不作實質(zhì)性的混合來完成的。
40、一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法、包括
在二氧化碳富集無氧的條件下在固定生長基上使可產(chǎn)生酸的鏈球菌的培養(yǎng)物生長，形成細菌及其副產(chǎn)物的液態(tài)懸浮液再將其物與固體培養(yǎng)基分離，將細菌細胞與懸浮液分離，及從剩余液體的組成物中離析透明質(zhì)酸。
41、為權(quán)利要求
40所述的方法其中離析是通過將酸及那些有相似或較高分子量的液體組成物與液體分開且然后將酸與那些相似組成物分離來完成的。
42、為權(quán)利要求
41所述的方法，其中最后分離是用沉淀法，沉淀是通過將透明質(zhì)酸及剩余組成物加到乙醇中去而不作實質(zhì)性混合來完成的。
43、為權(quán)利要求
40所述的方法其中發(fā)酵步驟包括在發(fā)酵的全過程中控制PH值在6.5～7.5范圍內(nèi)并大體上為恒定值±0.1且控制溫度為37±1℃。
44、如權(quán)利要求
40所述的方法，其中溶解的二氧化碳維持在濃度約為5-10%。
45、如權(quán)利要求
40所述的方法，其中在細菌生長終止前使細菌生長到密度為每毫升大于二億個細胞。
46、如權(quán)利要求
40所述的方法進一步包括通過將其溶解在溫和的緩沖溶液中來精制離析出的透明質(zhì)酸。
用混合的溴化烷基三甲基銨使透明質(zhì)酸沉淀。
在烯氯化鈉溶液中使沉淀物再懸浮。
通過將其加到乙醇中去而不進行攪拌使其再沉淀成為酸。
47、一種生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法包括
提供可產(chǎn)生透明質(zhì)酸的細菌;
將細菌與生長培養(yǎng)基合在一起因而細菌產(chǎn)生包括透明質(zhì)酸的副產(chǎn)品;
在生長培養(yǎng)基的環(huán)境中維持二氧化碳富集無氧的條件;
形成細菌及其副產(chǎn)物的液態(tài)懸浮液，這種懸浮液的形成不是生產(chǎn)方法所用培養(yǎng)基的固有性質(zhì);
將細菌與懸浮液分離;
從剩余液體的組成物中離析出透明質(zhì)酸。
48、為權(quán)利要求
47所述的方法，其中起初在靜止懸浮液中提供細菌。
49、如權(quán)利要求
47所述的方法，其中細菌為18型化膿性鏈球菌。
專利摘要
透明質(zhì)酸是一種粘多糖體，可用鏈球菌以高產(chǎn)量制備，其方法為在無氧條件下在二氧化碳富集的生長培養(yǎng)基中使細菌發(fā)酵，使細菌與發(fā)酵的肉湯分離及從肉湯的剩余組成物中分離出透明質(zhì)酸。通過在接種前經(jīng)10K微孔過濾器濾掉所有成分且其后維持無熱條件則生長出的細菌可以不含內(nèi)毒素。用三氯乙酸殺死細菌使微生物與多糖分離。在去除細菌細胞及濃縮較高分子量發(fā)酵產(chǎn)物后可用沉淀、再懸浮及再沉淀來分離、提純透明質(zhì)酸。
文檔編號C12R1/46GK85103674SQ85103674
公開日1986年11月12日 申請日期1985年5月13日
發(fā)明者布雷克, 撒克爾 申請人:戴格諾斯蒂克公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan