專利名稱：：一種用于檢測(cè)i型副流感病毒的靶序列及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增I型副流感病毒HN基因，從而高靈度地特異檢測(cè)臨床樣品中I型副流感病毒的方法及利用該方法獲得的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：副流感病毒(parainfluenzavirus,PIV)，與流感病毒同屬粘病毒。1992年第四次國(guó)際病毒命名委員會(huì)將其劃歸副粘病毒科(paramyxiviridae)，副粘病毒亞科(paranyxivirinae)。其成員多數(shù)是引起人畜共患病的重要病原體。近年來又發(fā)現(xiàn)一些新現(xiàn)病毒如megamyxoviruses(HendraandNipahviruses)以及metapneumovirus。副流感病毒是幼兒、兒童和成人的顯著上呼吸道感染最常見的病原體，據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約30X40X的嬰幼兒急性呼吸道感染都是由人副流感病毒(humanparainfluenzavirus，HPIV)引起的。和呼吸道合孢病毒一樣，副流感病毒可以重復(fù)感染。副流感病毒分為一至四型，每種亞型都有不同的臨床和流行病學(xué)特點(diǎn)。一型和二型副流感病毒是兒童哮吼癥的主要原因，在2-4歲兒童中癥狀最嚴(yán)重。一型和二型副流感病毒也可導(dǎo)致其他上/下呼吸道病癥。二型副流感病毒較少發(fā)現(xiàn)。三型副流感病毒雖然也導(dǎo)致哮吼癥，但是它作為僅次于呼吸道合孢病毒的幼兒支氣管炎、肺炎的病原體更為人熟知。三型副流感病毒在1歲以下兒童中癥狀最嚴(yán)重。四型副流感病毒一般引起輕微上呼吸道疾病。要消滅I型副流感病毒需要多方努力，如發(fā)展快速診斷方法、研制新藥、進(jìn)行分子機(jī)制研究和疫苗研究等，其中發(fā)展快速診斷方法最為緊迫。目前I型副流感病毒常用直接或間接免疫熒光技術(shù)檢測(cè)病毒抗原方法進(jìn)行診斷，達(dá)不到早期診斷的目的。為了更快地檢查出標(biāo)本中的I型副流感病毒，需要開發(fā)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)I型副流感病毒的核酸進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。近年來發(fā)展起來的熒光定量PCR(FluorescenceQuantitativePCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)以其靈敏度高，特異性好，速度快等優(yōu)點(diǎn)在基因表達(dá)水平分析、病原體的定性檢測(cè)和定量檢測(cè)等方面得到廣泛應(yīng)用，并且已經(jīng)成為當(dāng)前病毒核酸定量的主要方法。國(guó)內(nèi)目前也已有關(guān)于乙肝、艾滋病、結(jié)核定量檢測(cè)的試劑盒上市。對(duì)于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)來說，選擇待擴(kuò)增的靶DNA的堿基序列最為重要。針對(duì)I型副流感病毒，這個(gè)堿基序列必須為I型副流感病毒特異擁有并且不能存在于為人類或其它生物DNA基因組及可能發(fā)生合并感染的其它物種中。副流感病毒根據(jù)遺傳性與抗原性，HPIV可分為4種血清型HPIV14。其中HPIV4又可分為A，B兩個(gè)亞型。病毒有包膜，包膜上有兩種剌突，一種是HN蛋白，具有HA和NA的作用；另一種是F蛋白，具有使細(xì)胞融合及溶解紅細(xì)胞的作用，它由Fl和F2亞基通過2個(gè)二硫鍵連接而成。病毒包膜內(nèi)為核衣殼，也稱RNP核心，由病毒RNA(vRNA)，N蛋白，P蛋白和L蛋白組成。副流感病毒基因組由不分節(jié)段的ssRNA組成，包括約15，500個(gè)核苷酸，編碼至少6種常見的結(jié)構(gòu)蛋白(3'-N-P-C-M-F-HN-L-5')。研究發(fā)現(xiàn)，HN糖蛋白很可能以四聚體形式存在于HPIV包膜和被感染細(xì)胞的胞膜上，通過唾液酸受體使病毒吸附于宿主細(xì)胞表面，發(fā)揮神經(jīng)氨酸酶活性。Moscona和Paluso的實(shí)驗(yàn)表明，HN與細(xì)胞受體的相互作用是特異而復(fù)雜的，它涉及HN和F這兩種表面糖蛋白，且因HPIV型別的不同而多有變化，因此，人副流感病毒血清型可根據(jù)HN基因進(jìn)行分型?；诖耍绢I(lǐng)域迫切需要開發(fā)新高特異性地檢測(cè)I型副流感病毒的方法和試劑盒，以便能夠有效檢測(cè)I型副流感病毒。
發(fā)明內(nèi)容所要解決的技術(shù)問題本發(fā)明的目的就是提供一種有效檢測(cè)I型副流感病毒的方法和試劑盒。在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測(cè)I型副流感病毒的遺傳標(biāo)記物，它具有SEQIDNO:1中連續(xù)的751894個(gè)核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的遺傳標(biāo)記物具有SEQIDNO:2中第1162個(gè)核苷酸。在本發(fā)明的第二方面，提供一種檢測(cè)I型副流感病毒的試劑盒，它含有特異性擴(kuò)增I型副流感病毒遺傳標(biāo)記物的引物對(duì)，所述的引物長(zhǎng)度為1530個(gè)核苷酸，且一個(gè)引物的序列與SEQIDNO:l所示的序列相同，且另一個(gè)引物的序列與SEQIDNO:l所示的序列互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為751894個(gè)核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有探針，所述探針的長(zhǎng)度為1830個(gè)核苷酸，且該探針的序列與SEQIDNO:l所示的序列相同或互補(bǔ)。在另一優(yōu)選例中，所述引物對(duì)中的一個(gè)引物選自下組SEQIDN0:3或6;另一個(gè)引物選自下組SEQIDNO:4或7;并且所述的探針是TaqMan探針，其序列選自SEQIDNO:5或8。在另一優(yōu)選例中，該試劑盒還包括a)核酸提取液，b)RT-PCR緩沖液，c)定量校準(zhǔn)品，d)陽性對(duì)照，e)陰性對(duì)照。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測(cè)樣品中751894的方法，它包括操作步驟①樣品RNA提取；②將提取的RAN作為模板，用特異性擴(kuò)增I型副流感病毒遺傳標(biāo)記物的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，其中所述的的引物長(zhǎng)度為1530個(gè)核苷酸，一個(gè)引物的序列與SEQIDNO:l所示的序列相同，且另一個(gè)引物的序列與SEQIDNO:l所示的序列互補(bǔ)。③檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在，存在擴(kuò)增產(chǎn)物表示樣品存在I型副流感病毒。在另一優(yōu)選例中，所述的步驟③是通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來定量檢測(cè)樣品中的I型副流感病毒。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種I型副流感病毒HN基因的用途，其特征在于，它被用作體外檢測(cè)I型副流感病毒是否存在的遺傳標(biāo)記物。在另一優(yōu)選例中，I型副流感病毒HN基因具有SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過深入而廣泛的研究，從I型副流感病毒中發(fā)現(xiàn)的一段約1900左右個(gè)石減基X寸的基因—HN基因(KateE.Templeton，SithaA.Scheltinga，Matthias4F.C.Beersma，AloysC.M.Kroes，andEricC.J.Claas.RapidandSensitiveMethodUsingMultiplexReal-TimePCRforDiagnosisofInfectionsbyInfluenzaAandInfluenzaBViruses,RespiratorySyncytialVirus，andParainfluenzaViruses1，2，3，and4.JournalofClinicalMicrobiology,April2004，p.1564—1569，Vol.42，No.4)中發(fā)現(xiàn)合適的擴(kuò)增序列。該基因序列為I型副流感病毒功能性基因，因此，選擇這一特定結(jié)構(gòu)性、功能性基因序列作為引物，具有很好的特征性。如本文所用，I型副流感病毒HN基因的核苷酸序列，其GenBank登錄號(hào)HPU70936，具體序列示于SEQIDNO:1。根據(jù)I型副流感病毒HN基因設(shè)計(jì)的引物可在I型副流感病毒中擴(kuò)出相應(yīng)的核酸片段，而且，該引物未在其他相關(guān)菌株上擴(kuò)增出相應(yīng)片段，說明以I型副流感病毒HN基因序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的PCR反應(yīng)系統(tǒng)具有良好的特異性。雖然通過同源性比較，I型副流感病毒HN基因的全長(zhǎng)基因中有多個(gè)區(qū)域作為合適的特異性標(biāo)志區(qū)域，然而，SEQIDN0:2所示的核苷酸序列是一種特別優(yōu)選的適合作為I型副流感病毒特異性遺傳標(biāo)志的序列。因此，基于SEQIDNO:1和2，本發(fā)明提供了一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增I型副流感病毒HN基因檢測(cè)I型副流感病毒的方法；還提供一種快速定量檢測(cè)I型副流感病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒。其中的關(guān)鍵是使用了特異性擴(kuò)增I型副流感病毒遺傳標(biāo)記物的引物對(duì)，所述的引物長(zhǎng)度為1530個(gè)核苷酸，且一個(gè)引物序列與SEQIDNO:l所示的序列相同，另一個(gè)引物的序列與SEQIDNO:1互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為751894個(gè)核苷酸。例如，SEQIDNO:3與SEQIDNO:1所示的序列相同，且另一個(gè)引物SEQIDNO:4與SEQIDNO:1所示的序列互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為162bp。SEQIDNO:3和4分別對(duì)應(yīng)于SEQIDNO:1的531和673位置。本發(fā)明所述的特異性擴(kuò)增I型副流感病毒的引物及檢測(cè)用的探針，可根據(jù)發(fā)明的遺傳標(biāo)記物的序列(SEQIDN0:l或2)進(jìn)行設(shè)計(jì)，并通過常規(guī)的DNA合成方法獲得(如可以用商業(yè)化的DNA自動(dòng)合成儀合成)。本發(fā)明的這些引物可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其它化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。本發(fā)明所述的I型副流感病毒專一性核酸分子引物具有極好的種特異性。用本發(fā)明引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，結(jié)果能從含有I型副流感病毒的材料的RNA提取物中擴(kuò)增出大小為162bp特異性PCR產(chǎn)物。因此，以本發(fā)明引物進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，并通過判斷相應(yīng)大小PCR產(chǎn)物的有無可準(zhǔn)確、快速檢測(cè)I型副流感病毒，而且所需的樣品量非常少。為了減少假陽性，還可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用I型副流感病毒特異性探針進(jìn)行雜交。一種優(yōu)選的探針是TaqMan探針，它可在PCR反應(yīng)中直接實(shí)時(shí)地通過熒光信號(hào)反映擴(kuò)增產(chǎn)物的存在與否以及數(shù)量的高低。本發(fā)明的探針可以用放射性同位素、生物素、酶、熒光素或其它化學(xué)發(fā)光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。將該序列的5'端用報(bào)告熒光基團(tuán)如羧基熒光素(Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM)等標(biāo)記，3'端用淬滅基團(tuán)如TAMRA或Dabcyl等標(biāo)記后即可用于I型副流感病毒進(jìn)行定性和定量分析的PCR反應(yīng)。雖然引物和探針與模板序列完全互補(bǔ)是優(yōu)選的，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，在引5物與模板存在一定的不互補(bǔ)(尤其是引物的5'端)的情況下，也能夠特異性地?cái)U(kuò)增(即僅擴(kuò)增出所需的片段)。含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發(fā)明范圍之內(nèi)，只要該引物擴(kuò)增出的產(chǎn)物含有本發(fā)明的片段。雖然擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度沒有特別限制，但是通常擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度為701000bp，較佳地為75500bp，更佳地為100300bp。將本發(fā)明的引物與T叫Man探針技術(shù)結(jié)合，便得到了本發(fā)明的同時(shí)對(duì)I型副流感病毒進(jìn)行定性檢測(cè)和定量計(jì)數(shù)分析方法，這種分析方法不僅克服了常規(guī)定量PCR方法中的誤差，而且分析所需的樣品量少，檢出極限低，靈敏度高。在一優(yōu)選例中，一種快速定量檢測(cè)I型副流感病毒的熒光RT-PCR試劑盒，該試劑盒包括a)RNA提取液，b)熒光定量反應(yīng)液，c)定量校準(zhǔn)品，d)陽性對(duì)照品，e)陰性對(duì)照品，其特征是1)熒光定量反應(yīng)液含有PCR緩沖液、dNTPs溶液、T叫DNA聚合酶、DEPC處理水、MgCl2溶液，特異性擴(kuò)增I型副流感病毒HN基因遺傳標(biāo)記物的引物和熒光探針(如引物序列為SEQIDNO:3和SEQIDNO:4，熒光探針序列為SEQIDNO:5)，熒光探針5，端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA。2)定量校準(zhǔn)品是含有SEQIDNO:2共162個(gè)核苷酸片段構(gòu)成的pGEM-T載體，且該載體可在大腸桿菌中增殖。陽性對(duì)照品是I型副流感病毒陽性培養(yǎng)物。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，熒光定量反應(yīng)液包含50mMKCl，10mMTris-HC固.3(25°C)，3mMMgCl2，3%甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmol，熒光探針2pmo1，0.2mMdNTPs，DEPC處理水和混合酶(反轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶各1.5個(gè)單位)。其中引物SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的核苷酸序列，熒光探針SEQIDNO:5所示的核苷酸序列，熒光探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為TAMRA。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，定量校準(zhǔn)品是含有SEQIDNO:2共有162個(gè)核苷酸片段構(gòu)成的pGEM-T載體，且該載體可在大腸桿菌中增殖。貯存濃度為2X109COpieS/ia，使用前10倍梯度稀釋。含有目的片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌增殖后，用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測(cè)A26。定量并稀釋到2X109COpieS/ia，-201:保存。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)先方案中，RNA提取液包含4M硫氰酸胍、0.75M檸檬酸鈉(pH7.0)和10%月桂酰基肌氨酸鈉(Sarcosyllg/10mL)、14.3MP-巰基乙醇、2M醋酸鈉(pH4.0)和水飽和酚。在本發(fā)明提供檢測(cè)I型副流感病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒中，有一條兩端標(biāo)記有熒光基團(tuán)的特異性探針，在探針完整時(shí)，兩個(gè)基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離靠近，5'端報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)而被3'端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中檢測(cè)不到熒光。在PCR退火和延伸過程中，探針和模板特異性結(jié)合，隨著引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其在5'—3'外切酶活性對(duì)熒光探針進(jìn)行切割釋放出報(bào)告基團(tuán)，這樣破壞了基團(tuán)之間的FRET，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量PCR儀內(nèi)的熒光檢測(cè)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈正比例關(guān)系，對(duì)I型副流感病毒定量可以通過與定量校準(zhǔn)品的循環(huán)閾值(Ct，ThresholdCycle)相比較得出，Ct值是PCR過程中，熒光量的積累超過基底熒光量循環(huán)數(shù)。Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用梯度定量校準(zhǔn)品的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)代測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。本發(fā)明提供的檢測(cè)I型副流感病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒，經(jīng)過對(duì)各組分，如引物濃度、熒光探針濃度、Mg"濃度、退火溫度等優(yōu)化，將PCR技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)(包括PE7000/7300/7500，LightCycler)相結(jié)合。通過優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，試劑盒完全可以滿足快速特異檢測(cè)I型副流感病毒的實(shí)際要求。本發(fā)明還提供了一種利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)I型副流感病毒的方法，該方法包括如下檢測(cè)步驟A)用RNA提取液從陽性對(duì)照品和待測(cè)樣本中提取RNA;B)分別取上步提取的RNA、梯度定量校準(zhǔn)品加入熒光反應(yīng)液中用實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)；C)通過比較待測(cè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)閾值而對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量。本發(fā)明與現(xiàn)常用的培養(yǎng)法相比具有以下主要優(yōu)點(diǎn)和效果a)檢測(cè)速度快，加上RNA的提取，23小時(shí)完成；b)熒光探針的存在，保證了檢測(cè)的特異性和靈敏度；c)操作簡(jiǎn)單；d)定量準(zhǔn)確；e)可同時(shí)進(jìn)行高通過的樣品檢測(cè)。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:CoIdSpringHardorLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1分離用于RT-PCR分析的I型副流感病毒RNA為了從待測(cè)樣本中分離用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)的I型副流感病毒RNA，必須使用不影響聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的簡(jiǎn)單方法。1.用滅菌5ml玻璃管取受檢者肺深部咳出痰液l3ml，密閉，或取咽拭子密封送檢。標(biāo)本可立即用于測(cè)試，也可保存于-2(TC待測(cè)，保存期為6個(gè)月。標(biāo)本運(yùn)送應(yīng)采用Ot:冰壺。痰液標(biāo)本處理痰液中加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫下放置30min左右液化，取0.5ml至l.5ml離心管中，再加入0.5ml4%NaOH室溫放置10min后，15，OOOrpm離心5min。沉淀加無菌生理鹽水lml打勻，15，OOOrpm離心5min;再重復(fù)洗滌一次，去盡上清。咽拭子處理加入lml無菌生理鹽水，充分震蕩搖勻，吸取液體轉(zhuǎn)至1.5ml離心管中，12，000rpm離心5min，去盡上清。2.在上述沉淀中加入500ii1RNA提取液，用移液器反復(fù)吹打混勻，室溫放置5分鐘。3.加200iiL三氯甲烷，用手來回振蕩混勻15秒，室溫放置5分鐘，4°C15，OOOrpm離心10分鐘，將上清移入新的離心管。4.加入等體積異丙醇，旋渦振蕩5秒，室溫沉淀10分鐘，4°C15，OOOrpm離心5分鐘，棄上清。5.加入500iiL預(yù)冷的75X乙醇洗滌，上下顛倒10次，4t:10，OOOrpm離心5分鐘，吸干上清，沉淀室溫干燥10-20分鐘，加入20iiL無RNA酶水稀釋混勻，立即使用或-7(TC保存。實(shí)施例2檢測(cè)試劑盒的制備用常規(guī)方法制備一種快速定量檢測(cè)I型副流感病毒的熒光RT-PCR試劑盒，該試劑盒包括a)RNA提取液，b)熒光定量反應(yīng)液，c)定量校準(zhǔn)品，d)陽性對(duì)照品，e)陰性對(duì)照品。其中1)熒光定量反應(yīng)液含有PCR緩沖液、dNTPs溶液、T叫DNA聚合酶、DEPC處理水、MgCl2溶液，特異性擴(kuò)增I型副流感病毒HN基因遺傳標(biāo)記物的引物和熒光探針(如引物序列為SEQIDNO:3和SEQIDNO:4，熒光探針序列為SEQIDNO:5)，熒光探針5，端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)是TAMRA。(擴(kuò)增產(chǎn)物大小為162bp)具體地，熒光定量反應(yīng)液包含50mMKCl，10mMTris-HClPH8.3(25°C)，3mMMgCl2，3%甲酰胺，正向引物和反向引物各3pmo1，熒光探針2pmo1，0.2mMdNTPs，DEPC處理水和混合酶(反轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶各1.5個(gè)單位)。2)定量校準(zhǔn)品是含有SEQIDNO:2共有162個(gè)核苷酸片段構(gòu)成的pGEM-T載體(該載體購自Promego公司，SEQIDNO:2插入P-內(nèi)酰胺酶編碼區(qū))，且該載體可在大腸桿菌中增殖。具體地，定量校準(zhǔn)品在貯存濃度為2X10、opies/iU，使用前10倍梯度稀釋。含有目的片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌增殖后，用堿裂解法提取，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，用分光光度計(jì)測(cè)A26。定量并稀釋到2X109COpies/iil，-2(TC保存。3)RNA提取液包含4M硫氰酸胍、0.75M檸檬酸鈉(pH7.0)和10%月桂?；“彼徕c(Sarcosyllg/10mL)、14.3MP_巰基乙醇、2M醋酸鈉(pH4.0)和水飽和酚。實(shí)施例3用I型副流感病毒進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別取實(shí)施例2中的熒光反應(yīng)液各26iU加入到不同的PCR反應(yīng)管中，將實(shí)施例1中所得的RNA和定量校準(zhǔn)品向熒光定量反應(yīng)液中加入4iU，總體積30iU，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7500)上開始擴(kuò)增檢測(cè)。擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為37°C30分鐘，94°C5分鐘，按94°C10秒一60°C45秒循環(huán)40次。把熒光檢測(cè)的程序設(shè)計(jì)在每個(gè)循環(huán)的退火步驟結(jié)果時(shí)，檢測(cè)波長(zhǎng)為530nm。循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)用儀器配套軟件，讀取待檢樣本拷貝數(shù)。結(jié)果為定量較準(zhǔn)品2X106copies/ii1、2X105copies/ii1、2X104copies/ii1的22.87、26.05、29.58;待測(cè)樣本的Ct值范圍為2136，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算定量范圍為9.74X106copies/ii19copies/iU。具體結(jié)果如下表待測(cè)樣本ct值病毒量(copies/ti1)132.111.72X103227.388.51X104329.963.51X104420.529.74X1068<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>這表明，本發(fā)明試劑盒可在9.74X106copies/iil9copies/iU的廣大范圍內(nèi)極其靈敏度地?cái)U(kuò)增出I型副流感病毒。實(shí)施例4用各種病原體進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用實(shí)施例13相同的方法進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，不同點(diǎn)在于本實(shí)施例的反應(yīng)模板選取其他相近各類的病原體的DNA，如II型副流感病毒、III型副流感病毒、IV型副流感病毒、豬瘟病毒(CSFV)、人白細(xì)胞RNA、丙型肝炎病毒(HCV)。檢測(cè)結(jié)果如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>如上所述，本實(shí)施例對(duì)其他相近的病原體基因無交叉反應(yīng)，可特異地?cái)U(kuò)增出I型副流感病毒。因此，本發(fā)明第一次揭示了擴(kuò)增I型副流感病毒HN基因檢測(cè)I型副流感病毒在敏感性、特異性方面的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)提供了一種在此基礎(chǔ)上快速特異檢測(cè)I型副流感病毒的熒光定量RT-PCR試劑盒。該試劑盒對(duì)I型副流感病毒的靈敏度、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好，僅需23小時(shí)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。整個(gè)操作過程只需一個(gè)，一次可檢測(cè)3296(實(shí)時(shí)熒光PCR儀型號(hào)決定)個(gè)樣本，減少了人力資源的浪費(fèi)。實(shí)施例5用各種病原體進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)重復(fù)實(shí)施例14的相同方法，不同點(diǎn)僅在于用SEQIDNO:6和7所示的引物替換SEQIDNO:3和4所示的引物，用SEQIDNO:8所示的探針替換SEQIDNO:5所示的探針。檢測(cè)結(jié)果表明，該引物對(duì)和探針同樣可以特異地?cái)U(kuò)增出I型副流感病毒。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外，應(yīng)理解，在音讀閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于申請(qǐng)所附權(quán)利要求書限定的范圍。核苷酸序列表SEQUENCELISTING〈110〉上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司〈120〉一種用于檢測(cè)I型副流感病毒的耙序列及試劑盒〈130>6〈160>8〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>1894〈212>DNA〈213>Humanparainfluenzavirus1〈220〉〈221>SEQIDNO:1〈222〉(1).(1894)〈400〉1郷gtt腿gacaatccagcggC皿C皿C3tctgacteteC皿3Cg3tgg60agttcatettggtctecaacCCg3皿tg3Caactccacgg120CC3gC3gg皿ctggctectg180caatgcatgcagtettgtccctcattetcatgatectetgcattgaccte240tetg^gacacagtetcctccatg皿cg皿300gac皿g皿gtgatetc皿gg360tecaaagttcgggatccc皿tettgtteaaC皿gC皿3gC420tcagatetgc■ttgctettcaccatgcagacgg皿teacccctctegacccacatgatttctgg卿tgtc540ccgteggagaacccctectg3gC皿C皿CCcteatetctcattettecctggacc皿gtc600tectttctggatttcaggatgtgttegattaccttcattetcaattggtg660atgc皿tetetgcgtettcatcactcaaggateggg皿gt720catetcaggttttecaatteggttecatetcttteaattcagatetgtetcctgatttea780acccggteatttctcatecctetgacatca3Cg3C皿C3gtctgteateg840ctgcagg皿c皿ggggtteccagttetgctccttgcccactgtg皿tgagactecagatt■aggteteg皿gacttegtetttgacatettgg皿3g3CC3960aatctcatcggaagatateacttttgaccatcctttttcagcaatgtetc1020c朋gtgtegg朋gtgggate朋gattga皿atecactcgttttccteggatecggtggct1080teacaactccgctccaaggcgtgtgate皿cagatgtccc皿tgtteatc1140卿gtgtttgcaatgatgctctteagateacttggcte皿g皿朋gacaagttgtc皿tg120010ateggcc皿3gattgttgtcgagactettc1260朋attettteggtgccg朋gggaggctectte皿cteggc3皿朋gatct1320tagatcctcaggttggcactcc皿cttgca皿teggatc3ctegatetca13803C朋CCCC3tgaccatteattgggcgcctc3C皿3gtCCtgtC3Cg3CC3gg3朋CCC3g1440actgcaactggttc朋ca朋tgtccgagag皿tgcatetcaggtgtetec3ctgatgrat1500atccactatcccctgatgcagtcaatgttgctecaaccacactgtecgcaaatecatcac1560gtgtteatccteccateatgtectc朋atecctc朋a皿tC3tc皿catgcteagactc316203朋Ctgg3C3attegaggcagcatecactectecatcatgtetcactcatttcggaaagg1680gctectgcttccacattgttgaaatcaaccaagccagcctteataccttecaacctetgt1740tgttcaagac朋gtetccct朋朋tetgte3皿tc3C3tcttgagcggatc皿gacctea1800cactetetcaattetgtg朋朋ccagatet皿tgtete皿皿ttte皿皿te皿gcat朋1860atagacattt3tetgac朋3teg朋t朋ga1894〈210>2〈211>162〈212>DNA〈213>Humanparainfluenzavirusi〈220〉〈221〉SEQIDNO:2〈222〉(1)(162)〈400>2tgg卿tgtcccgteggagaacccctectgagcaacaacccteatetctcattettecct60ggacc朋gtctactttctggatccaccacaatttcaggatgtgttegattaccttcatta120tcaattggtgatgcaatetetgcgtettcatcaaactteatc162〈210>3〈211>20〈212>DNA〈213>Humanparainfluenzavirus1〈220〉〈221>SEQIDNO:3〈222〉(1)(20)〈400>3tgg卿tgtcccgteggaga20〈210>4〈211>23〈212>DNA〈213>Humanparainfluenzavirus1〈220〉〈221>SEQIDNO:4〈222〉(1)(23)0161]〈400>40162]gatteagtttgatg3gitecgcat0163]〈210〉50164]〈211〉260165]〈212>DNA0166]〈213>Humanparainfluenzavirus0167]<220>0168]〈221〉SEQIDNO:50169]〈222〉(1)(26)0170]〈223〉〃n=FAM"，〃y=TAMRA"0171]〈220〉0172]〈221>misc_feature0173]〈222〉(1)(1):0174]〈400〉5:0175]nacctggaccaagtctactttctggy:0176]〈210>6:0177]〈211>23:0178]〈212〉DNA:0179]〈213〉Hum肌parainfluenzavirus1:0180]<220>:0181]〈221>SEQIDNO:6:0182]〈222〉(1)(23):0183]〈400〉6:0184]gatttaaacccggtaatttctea:0185]〈210>7:0186]<211>20:0187]〈212〉DNA〈213〉Humanparainfluenzavirus〈220〉〈221>SEQIDNO:7<222>(1).(20)〈400〉7gtgggcaaggagcataactg〈210>8〈211>26〈212>DNA〈213〉H咖anparainfluenzavirus1〈220〉<221>SEQIDNO:812〈222>(1)..(26)〈223〉"n=FAM"，〃y=TAMRA"〈220〉〈221>misc—feature〈222〉(1)..(1)〈400>8ncctatgacatcaacgacaacaggay2權(quán)利要求一種檢測(cè)I型副流感病毒的遺傳標(biāo)記物，其特征在于，它具有SEQIDNO1中連續(xù)的75～1894個(gè)核苷酸。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)記物，其特征在于，它具有SEQIDNO:2中第1162個(gè)核苷酸。3.—種檢測(cè)I型副流感病毒的試劑盒，其特征在于，它含有特異性擴(kuò)增I型副流感病毒遺傳標(biāo)記物的引物對(duì)，所述的引物長(zhǎng)度為1530個(gè)核苷酸，且一個(gè)引物的序列與SEQIDNO:l所示的序列相同，且另一個(gè)引物的序列與SEQIDNO:l所示的序列互補(bǔ)，且擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為751894個(gè)核苷酸。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，還含有探針，所述探針的長(zhǎng)度為1830個(gè)核苷酸，且該探針的序列與SEQIDNO:l所示的序列相同或互補(bǔ)。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述引物對(duì)中的一個(gè)引物選自下組SEQIDNO:3或6;另一個(gè)引物選自下組SEQIDNO:4或7;并且所述的探針是TaqMan探針，其序列選自SEQIDNO:5或8。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括a)核酸提取液，b)RT-PCR緩沖液，c)定量校準(zhǔn)品，d)陽性對(duì)照，e)陰性對(duì)照。7.—種檢測(cè)樣品中I型副流感病毒的方法，其特征在于，它包括操作步驟①樣品RNA提?。虎趯⑻崛〉腞NA作為模板，用特異性擴(kuò)增I型副流感病毒遺傳標(biāo)記物的引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，其中所述的的引物長(zhǎng)度為1530個(gè)核苷酸，一個(gè)引物的序列與SEQIDNO:l所示的序列相同，且另一個(gè)引物的序列與SEQIDNO:l所示的序列互補(bǔ)。③檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物是否存在，存在擴(kuò)增產(chǎn)物表示樣品存在I型副流感病毒。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步驟③是通過檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來定量檢測(cè)樣品中的I型副流感病毒。9.一種I型副流感病毒HN基因的用途，其特征在于，它被用作體外檢測(cè)I型副流感病毒是否存在的遺傳標(biāo)記物。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于，I型副流感病毒HN基因具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。全文摘要本發(fā)明提供了快速檢測(cè)I型副流感病毒的遺傳標(biāo)記和方法，具體地，本發(fā)明提供了I型副流感病毒HN基因的核苷酸序列，以及以該序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物和探針。本發(fā)明還提供了用這些引物快速特異性檢測(cè)I型副流感病毒的方法。本發(fā)明可方便、快速、準(zhǔn)確地定性、定量檢測(cè)I型副流感病毒。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101748218SQ20081020445公開日2010年6月23日申請(qǐng)日期2008年12月12日優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日發(fā)明者吳大治,夏懿,沈維祥申請(qǐng)人:上海復(fù)星醫(yī)藥(集團(tuán))股份有限公司;上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司