專利名稱：一種肝損傷相關(guān)的藥物靶點(diǎn)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種肝損傷相關(guān)的藥物 靶點(diǎn)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝炎是嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病。肝炎特別是病毒性肝炎在中國的發(fā)
病率持續(xù)在較高水平，就乙型肝炎來說，全世界20億人感染乙肝病毒，其中 6.9億在中國，全球有乙肝病毒表面抗原(HBsAg)攜帶者3.5億人，其中三分 之一在中國；全世界每年有75萬人死于乙肝病毒染引起的疾病，其中28萬人 來自中國。
肝炎從病因看主要有病毒性肝炎，酒精性肝炎，自身免疫性肝炎等。但是 研究發(fā)現(xiàn)，不論其初始病因如何，炎癥和免疫介導(dǎo)的肝細(xì)胞和肝組織損傷是這 些疾病的病理過程中共同的必經(jīng)過程和影響疾病嚴(yán)重程度與預(yù)后的主要原因。 然而本領(lǐng)域?qū)τ诰烤鼓男┮蛩鼗蚍肿优c炎癥以及免疫介導(dǎo)的肝細(xì)胞和肝組織 損傷密切相關(guān)的研究還不夠深入。
因此，本領(lǐng)域非常有必要找到肝損傷相關(guān)的新的藥物靶點(diǎn)，為肝損傷或相 關(guān)疾病的治療提供新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種硬脂酰輔酶A去飽和酶1 (Scdl)的拮抗劑的用 途，用于制備抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的組合物。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種篩選抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的潛在物質(zhì)的 方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種硬脂酰輔酶A去飽和酶1 (Scdl)的拮抗 劑的用途，用于制備抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的組合物。在另一優(yōu)選例中，所述的肝損傷是炎癥和免疫介導(dǎo)的肝細(xì)胞和肝組織損傷。
在另一優(yōu)選例中，所述的肝損傷包括肝炎，肝臟組織壞死。 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還用于 降低肝損傷哺乳動(dòng)物的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性；或 降低肝損傷哺乳動(dòng)物中炎性細(xì)胞因子的濃度。
在另一優(yōu)選例中，所述的炎性細(xì)胞因子選自TNF-a，或IFN-Y。 在另一優(yōu)選例中，所述的硬脂酰輔酶A去飽和酶1的拮抗劑選自 特異性干擾硬脂酰輔酶A去飽和酶1基因表達(dá)的小干擾RNA分子或反義 核苷酸；或
特異性與硬脂酰輔酶A去飽和酶1結(jié)合的抗體或配體。 在另一優(yōu)選例中，所述的硬脂酰輔酶A去飽和酶1的拮抗劑是
(a) SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或
(b) 核苷酸序列與SEQ ID NO: 1互補(bǔ)的小干擾RNA分子。 在另一優(yōu)選例中，所述的小干擾RNA分子是雙鏈分子，其正向鏈具有SEQ
ID NO: l所示核苷酸序列；反向鏈具有SEQIDNO:2所示核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供一種用于抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的小干擾RNA 分子，所述的小干擾RNA分子是
(a) SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或
(b) 核苷酸序列與SEQ ID NO: 1互補(bǔ)的小干擾RNA分子。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種用于抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的組合物，所述 的組合物含有
(1) 有效量的所述的小千擾RNA分子；和
(2) 藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種篩選抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的潛在物質(zhì)的方 法，所述方法包括
(1) 用候選物質(zhì)處理表達(dá)硬脂酰輔酶A去飽和酵1的體系；和
(2) 檢測所述體系中硬脂酰輔酶A去飽和酶1的表達(dá)或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可降低硬脂酰輔酶A去飽和酶1的表達(dá)或活性，則 表明該候選物質(zhì)是抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的潛在物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，步驟(l)包括在測試組中，將候選物質(zhì)加入到表達(dá)硬脂 酰輔酶A去飽和酶1的體系中；和/或
步驟(2)包括檢測測試組的體系中硬脂酰輔酶A去飽和酶1的表達(dá)或活性， 并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)硬脂酰輔酶 A去飽和酶1的體系；
如果測試組中硬脂酰輔酶A去飽和酶1的表達(dá)或活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于(優(yōu)
選顯著低于，如低20%以上，較佳的低50%以上；更佳的低80%以上)對照組，
就表明該候選物是抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的潛在物質(zhì)。
在另一優(yōu)選例中，所述的體系選自細(xì)胞體系(如表達(dá)Scdl的肝臟細(xì)胞)； (或細(xì)胞培養(yǎng)物體系)、亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動(dòng)物體 系。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的細(xì) 胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以從候選物質(zhì)中進(jìn)一步選擇和確定對于抑制哺乳動(dòng)物肝 損傷有用的物質(zhì)。
另一方面，本發(fā)明還提供一種抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的方法，所述方法包括 下調(diào)所述哺乳動(dòng)物體內(nèi)硬脂酰輔酶A去飽和酶1的表達(dá)或活性。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而 易見的。


圖1.正常小鼠和Scdl缺陷小鼠由尾靜脈注射劑量為15mg/kg的ConA。 17小時(shí)后取血清，檢測血清中腫瘤壞死因子-a和Y-干擾素的濃度。
A. ELISA法檢測血清中7-干擾素的濃度；
B. ELISA法檢測血清中腫瘤壞死因子-a的濃度。
圖2.正常小鼠和Scdl缺陷小鼠由尾靜脈注射劑量為15mg/kg的ConA，
17小時(shí)后取血清測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶活。數(shù)據(jù)以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。圖3.肝臟的H&E染色和TUNEL染色。正常小鼠和Scdl缺陷小鼠由尾靜 脈注射劑量為15mg/kg的ConA。 17小時(shí)后，取肝臟組織切片H&E染色或者 TUNEL染色。
A. 正常小鼠誘導(dǎo)CIH后H&E染色結(jié)果；
B. Scdl缺陷小鼠誘導(dǎo)CIH后H&E染色結(jié)果；
C. 正常小鼠誘導(dǎo)CIH后TUNEL染色結(jié)果；
D. Scdl缺陷小鼠TUNEL染色結(jié)果。
圖4.注射生理鹽水后尾靜脈注射劑量為15mg/kg的ConA的小鼠，注射 siRNA后尾靜脈注射劑量為15mg/kg的ConA的小鼠(siRNA)分別在ConA注
射17小時(shí)后取血清測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶活。Naive表示未注射ConA的正常小鼠的 丙轉(zhuǎn)氨酶活。數(shù)據(jù)以"平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差"的形式表示。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次揭示硬脂酰輔酶A去飽和酶1 (Scdl) 與肝損傷的發(fā)生或發(fā)展密切相關(guān)。事先在肝損傷動(dòng)物模型的染色體中敲除Scdl 基因后，Scdl缺陷動(dòng)物發(fā)生肝損傷的癥狀顯著減輕，因此可知Scdl蛋白是一 種在肝損傷發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用的因素，從而可以作為藥物靶點(diǎn)開發(fā)預(yù)防 或治療肝損傷的藥物。
Scdl及其用途
Scd基因編碼了定位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的硬脂酰輔酶A脫氫酶，它能夠催化 來源食物或者從頭合成飽和脂肪酸脫氫生成單不飽和脂肪酸，是脂肪代謝的關(guān) 鍵酶，因此是能量代謝過程中的重要的調(diào)節(jié)因子。在小鼠中，Scdl是在成年小 鼠的脂類代謝中起最主要作用的Scd基因，人類基因組中兩個(gè)Scd基因均與小 鼠的Scdl基因有85%以上的同源性，以往的研究顯示Scdl在調(diào)節(jié)體重和胰島 素敏感性方面有著重要的作用。
任何適合的Scdl蛋白均包括在本發(fā)明中。所述的Scdl蛋白包括全長的Scdl 蛋白或其生物活性片段。優(yōu)選的，所述的Scdl蛋白的氨基酸序列可以與GenBank 登錄號NP 033153.2所示的序列基本上相同。編碼所述的Scdl蛋白的核苷酸序列可以與GenBank登錄號NM—009127.3所示的序列或該序列的簡并的序列 基本上相同。
經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的Scdl蛋白的氨基 酸序列也包括在本發(fā)明中。Scdl蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸 的替代序列，所述經(jīng)氨基酸替換的序列并不影響其活性或保留了其部分的活 性。例如，所述的Scdl蛋白可以是來自于鼠(如小鼠)的，也可以是來自于人或 其它哺乳動(dòng)物的、氨基酸序列接近或基本相同的(如相同性大于70%，較佳的 相同性大于80%;更佳的相同性大于85%;最佳的相同性大于卯％)、且生物活 性與小鼠Scdl蛋白的生物活性相同(如對于肝損傷的發(fā)生或發(fā)展具有重要作用) 的蛋白。
本發(fā)明人利用一種Scdl基因發(fā)生缺失突變的小鼠，利用國際公認(rèn)的肝損 傷動(dòng)物模型，研究證實(shí)了 Scdl基因的下調(diào)(或缺失)對免疫介導(dǎo)的肝損傷有顯 著的保護(hù)作用，Scdl基因功能下調(diào)(或缺失)的小鼠誘導(dǎo)免疫性肝損傷后血清 谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的活性為500U/L以下(正常小鼠ALT值約為50U/L，正常 小鼠誘導(dǎo)免疫性肝損傷時(shí)ALT平均值在5000U/L以上)，同時(shí)肝臟的病理分析 也顯示，Scdl基因功能缺失的小鼠幾乎看不到明顯的肝臟正常結(jié)構(gòu)的破壞和 TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞。
本發(fā)明人深入的工作還表明，Scdl的功能的缺失使介導(dǎo)肝損傷的多種炎性 細(xì)胞因子，包括Y干擾素和腫瘤壞死因子a表達(dá)的顯著下降，從而保護(hù)肝臟免 受損傷。
通過上述的研究工作可知，Scdl是一個(gè)新的、對肝臟炎癥及相關(guān)疾病有保 護(hù)作用的藥物靶點(diǎn)。針對Scdl的各種治療手段可以作為治療肝臟炎癥及相關(guān) 疾病的新穎和有效的手段。
Scdl的拮抗劑及其用途
基于本發(fā)明人的上述新發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種Scdl的拮抗劑的用途， 用于制備抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的組合物。所述的肝損傷優(yōu)選地是炎癥和免疫介 導(dǎo)的肝細(xì)胞和肝組織損傷。所述的肝損傷包括但不限于肝炎，肝臟組織壞死。 所述的Scdl的拮抗劑還用于降低肝損傷哺乳動(dòng)物的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。所述的 Scdl的拮抗劑還用于降低肝損傷哺乳動(dòng)物中炎性細(xì)胞因子的濃度。所述的炎性細(xì)胞因子包括TNF-a或IFN-Y。
如本文所用，所述的Scdl基因或蛋白的拮抗劑包括了抑制劑、下調(diào)劑、 阻滯劑、阻斷劑等。
所述的Scdl基因或蛋白的拮抗劑是指任何可降低Scdl蛋白的活性、降低 Scdl基因或蛋白的穩(wěn)定性、下調(diào)Scdl蛋白的表達(dá)、減少Scdl蛋白有效作用時(shí) 間、或抑制Scdl基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為 對于下調(diào)Scdl有用的物質(zhì)，從而可用于預(yù)防或治療肝損傷。例如，所述的拮
抗劑是特異性干擾Scdl基因表達(dá)的小干擾RNA分子或反義核苷酸；或特異
性與Scdl結(jié)合的抗體或配體。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的Scdl的拮抗劑是一種特異性與Scdl結(jié)
合的抗體。所述的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。可用Scdl蛋白免疫動(dòng) 物，如家兔，小鼠，大鼠等來生產(chǎn)多克隆抗體；多種佐劑可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)， 包括但不限于弗氏佐劑等。與之相似的，表達(dá)Scdl或其具有抗原性的片段的細(xì) 胞可用來免疫動(dòng)物來生產(chǎn)抗體。所述的抗體也可以是單克隆抗體，此類單克隆 抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256; 495， 1975; Kohler 等人，Eur丄Immunol. 6: 511， 1976; Kohler等人，Eur丄Immunol. 6: 292， 1976; Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas， Elsevier, N.Y.， 1981)。
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的Scdl的拮抗劑是一種Scdl特異性的 小千擾RNA分子(siRNA)。如本文所用，所述的"小干擾RNA (small interfering RNA， siRNA)"是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補(bǔ)序列的mRNA 為靶目標(biāo)降解特定的mRNA，這個(gè)過程就是RNA干擾(RNA interference)過程。
小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個(gè)正義鏈和一個(gè)反義 鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。 一個(gè)雙鏈RNA復(fù)合物可以由相互 分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補(bǔ)的正義鏈和反義鏈?zhǔn)腔?學(xué)合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈RNA復(fù)合物。
作為本發(fā)明的特別優(yōu)選的方式，提供了一種效果良好的小千擾RNA分子， 所述的小干擾RNA分子可特異性的干擾Scdl基因的表達(dá)，與其它的人類核酸 序列沒有顯著的同源性；并且經(jīng)驗(yàn)證，其具有良好的干擾Scdl表達(dá)的效果。 所述的小干擾RNA分子是具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的小干擾RNA本發(fā)明對小干擾RNA的制備方法沒有特別的限制，包括但不限于化學(xué)
合成法，體外轉(zhuǎn)錄法等。應(yīng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員在得知了 Scdl與肝損傷的 相關(guān)性以后，可以以各種途徑方便地制備出所述的小干擾RNA，從而用于抑制 肝損傷。所述的小干擾RNA可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到體內(nèi)(如肝臟 部位)，或還可采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到體內(nèi)。
此外，小干擾RNA包含的正義鏈和反義鏈可通過一個(gè)或多個(gè)編碼正義鏈 和反義鏈的表達(dá)盒來制備。當(dāng)正義鏈和反義鏈由一個(gè)單獨(dú)的表達(dá)盒編碼時(shí)，它 們可以從生成的轉(zhuǎn)錄物中斷裂形成分離的正義鏈和反義鏈，其后雜交生成雙鏈 小干擾RNA。
所述的小干擾RNA可通過采用適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細(xì)胞內(nèi)，或還可 采用本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)被輸送到細(xì)胞內(nèi)。
本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量(如0.000001-50wty。；較佳的 0.00001-20wt%;更佳的，0.0001-10wt%)的所述的Scdl的拮抗劑，以及藥學(xué)上 可接受的載體。所述的組合物可用于抑制肝損傷。任何前述的Scdl的拮抗劑均 可用于組合物的制備。
如本文所用，所述"有效量"是指可對人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且 可被人和/或動(dòng)物所接受的量。所述"藥學(xué)上可接受的載體"指用于治療劑給
藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些藥劑載體它們本身 并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員所熟知的。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、 緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助 流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細(xì)胞轉(zhuǎn)染試 劑。
在得知了所述Scdl基因或蛋白的拮抗劑的用途后，可以采用本領(lǐng)域熟知的
多種方法來將所述的拮抗劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動(dòng)物。
包括但不限于皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予 等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。
優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進(jìn)行。比如，可直接將Scdl的拮抗劑通過 諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶Scdl的拮抗劑的表達(dá)單位(比如表達(dá)載體或病毒等，或siRNA)遞送到耙點(diǎn)上，并使之表達(dá) 活性的Scdl拮抗劑，具體情況需視所述的拮抗劑的類型而定，這些均是本領(lǐng)域 技術(shù)人員所熟知的。
本發(fā)明所述的Scdl的拮抗劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的 嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種
因素來確定(例如通過臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于所述的Scdl基因 或蛋白的拮抗劑的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所
要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通
常，當(dāng)本發(fā)明的Scdl的拮抗劑每天以約0.0000lmg-50mg/kg動(dòng)物體重(較佳的 0.0001mg-10mg/kg動(dòng)物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治 療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。
藥物篩選
在得知了Scdl與肝損傷的密切相關(guān)性后，可以基于該特征來篩選抑制Scdl 的表達(dá)或活性的物質(zhì)。可從所述的物質(zhì)中找到對于預(yù)防或治療肝損傷真正有用 的藥物。
因此，本發(fā)明提供一種篩選抑制肝損傷的潛在物質(zhì)的方法，所述的方法包 括用候選物質(zhì)處理表達(dá)Scdl的體系；和檢測所述體系中Scdl的表達(dá)或活性； 若所述候選物質(zhì)可抑制Scdl的表達(dá)或活性，則表明該候選物質(zhì)是抑制肝損傷 的潛在物質(zhì)。所述的表達(dá)Scdl的體系例如可以是細(xì)胞(或細(xì)胞培養(yǎng)物)體系，
所述的細(xì)胞可以是內(nèi)源性表達(dá)Scdl的細(xì)胞；或可以是重組表達(dá)Scdl的細(xì)胞。
所述的表達(dá)Scdl的體系還可以是亞細(xì)胞體系、溶液體系、組織體系、器官體
系或動(dòng)物體系(如動(dòng)物模型，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物的動(dòng)物模型，如鼠、兔、羊、
猴等)等。
在本發(fā)明的優(yōu)選方式中，在進(jìn)行篩選時(shí)，為了更易于觀察到Scdl的表達(dá)
或活性的改變，還可設(shè)置對照組，所述的對照組可以是不添加所述候選物質(zhì)的
表達(dá)Scdl的體系。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的方法還包括對獲得的潛在物質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一
步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和/或動(dòng)物試驗(yàn)，以進(jìn)一步選擇和確定對于抑制肝損傷真正有用的 物質(zhì)。
本發(fā)明對于Scdl蛋白的表達(dá)、活性、存在量或分泌情況的檢測方法沒有
11特別的限制?？梢圆捎贸Ｒ?guī)的蛋白定量或半定量檢測技術(shù)，例如(但不限于)
SDS-PAGE法，Western-Blot法等。
另一方面，本發(fā)明還提供了采用所述篩選方法獲得的抑制肝損傷的潛在物 質(zhì)。這些初步篩選出的物質(zhì)可構(gòu)成一個(gè)篩選庫，以便于人們最終可以從中篩選 出能夠?qū)τ谝种芐cdl的表達(dá)和活性，進(jìn)而抑制肝損傷有用的物質(zhì)。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
(1) 首次揭示Scdl與肝損傷的發(fā)生或發(fā)展密切相關(guān)，從而可以作為藥物靶 點(diǎn)開發(fā)預(yù)防或治療肝損傷的藥物。
(2) 基于本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)找到了可抑制Scdl是拮抗劑，其可非常有效地 抑制Scdl的表達(dá)，從而抑制肝損傷的發(fā)生。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
實(shí)驗(yàn)組(1)對照組(野生型)小鼠；
(2) SCDl缺陷小鼠。 用于評價(jià)其治療效果的標(biāo)本包括血清，肝臟組織切片，以及肝臟組織RNA等。
實(shí)施例1. Scdl缺陷對肝損傷小鼠血清細(xì)胞因子的影響
2004年Lu等的報(bào)道了一種基因突變的小鼠abxyk (參見Mol Gen Genomics (2004) 272:129 - 137)。將這種小鼠與Balb/c小鼠回交2代后，作為Scdl缺陷
小鼠，用于本發(fā)明的研究。
正常(野生型)小鼠Balb/c小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。
為了研究肝臟相關(guān)的疾病，近幾十年有多種肝臟相關(guān)的動(dòng)物模型被建立。 建立免疫性肝病的動(dòng)物模型主要是通過多種手段刺激活化免疫細(xì)胞，使多種炎癥細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)，從而造成肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞凋亡死亡。在刺激活性免疫細(xì)胞的 這些手段中，尾靜脈注射ConA是一種公認(rèn)有效的手段，可以模擬多種人類的 肝臟疾病的發(fā)病過程。在肝損傷模型誘導(dǎo)后8到24小時(shí)，動(dòng)物的血清谷丙轉(zhuǎn) 氨酶(ALT)活性急劇增加，HE染色可見肝臟正常結(jié)構(gòu)被破壞，大量的肝實(shí)質(zhì) 細(xì)胞凋亡死亡。在這種模型中，細(xì)胞因子包括TNFa， IFNY，白介素-12，白 介素-4對肝臟的損傷起了關(guān)鍵作用。
正常小鼠和Scdl缺陷小鼠由尾靜脈注射劑量為15mg/kg的ConA。 2小時(shí) 和8小時(shí)后取血清，采用ELISA法分別檢測血清中腫瘤壞死因子-a和Y-干擾
素的濃度。
ELISA檢測使用DuosetELISAkit(R&D， MN， USA)，按照生產(chǎn)商提供的 說明書操作。簡要步驟為；
lOOy L -'抗(R&D， MN， USA)包板過夜，洗板后300 n L封閉緩沖液封 閉2小時(shí)，洗板后加入100微升樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，孵育2小時(shí)，洗板后加入二抗 (R&D， MN， USA)孵育2小時(shí)，洗板后加入酶標(biāo)鏈親和素，加入底物顯色， 硫酸中止，酶標(biāo)儀450nm讀數(shù)(參考波長540nm)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中 各細(xì)胞因子的濃度。
結(jié)果見圖1。 A為ELISA檢測血清中腫瘤壞死因子-a (TNF-a )濃度的結(jié) 果；B為ELISA檢測血清中腫7-干擾素(IFN-Y)濃度的結(jié)果。
由上述結(jié)果可見，Scdl缺陷小鼠血清中多種炎性細(xì)胞因子的含量顯著低于 對照組。
實(shí)施例2. Scdl缺陷降低肝損傷小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性
正常小鼠和Scdl缺陷小鼠由尾靜脈注射劑量為15mg/kg的ConA，誘導(dǎo) 肝損傷，17小時(shí)后取血清，常規(guī)方法測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。
結(jié)果見圖2，可見Scdl缺陷小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于正常小鼠對 照小鼠。
因此，在小鼠中下調(diào)Scdl可顯著降低肝損傷小鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性。 實(shí)施例3. Scdl缺陷小鼠肝臟組織切片觀察
正常小鼠和Scdl缺陷小鼠由尾靜脈注射劑量為15mg/kg的ConA。 17小 時(shí)后，取肝臟組織切片進(jìn)行H&E染色，或者進(jìn)行TUNEL染色。結(jié)果見圖3。圖3A是正常小鼠誘導(dǎo)CIH后H&E染色結(jié)果，其中可觀察到肝臟組織出現(xiàn)大面積壞死現(xiàn)象，正常結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞。
圖3B是Scdl缺陷小鼠誘導(dǎo)CIH后H&E染色結(jié)果，肝臟組織中未見炎性病灶和壞死區(qū)域。
圖3C是正常小鼠誘導(dǎo)CIH后TUNEL染色結(jié)果，其中可觀察到出現(xiàn)大量的TUNEL陽性的凋亡細(xì)胞；與圖3A的結(jié)果相應(yīng)。
圖3D是Scdl缺陷小鼠TUNEL染色結(jié)果，其中也未發(fā)現(xiàn)TUNEL陽性的細(xì)胞；與圖3B的結(jié)果相應(yīng)。
實(shí)施例4.特異性抗Scdl蛋白的抗體的制備
免疫動(dòng)物為新西蘭白兔，雄性，體重為2-2.5kg。免疫流程用采用常規(guī)重組表達(dá)方法表達(dá)獲得的Scdl蛋白(其氨基酸序列參見Genbank登錄號NP_033153.2)與Freund's佐劑1: 1混合，乳化后，皮下和皮內(nèi)多點(diǎn)注射進(jìn)行免疫。Scdl蛋白的劑量為0.9mg/次/兔。首次免疫用完全Freund's佐劑，再次免疫用不完全Freund，s佐劑。免疫的間隔時(shí)間為3周。第三次免疫后l周，兔放血，收集抗血清，獲得抗Scdl蛋白免疫多抗。利用Scdl蛋白作為抗原，與前述獲得的抗Scdl蛋白免疫多抗進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所述抗Scdl蛋白免疫多抗可以特異性結(jié)合Scdl蛋白。
正常小鼠分成兩組， 一組為對照組(用生理鹽水處理)，一組為抗體處理組。在用ConA誘導(dǎo)肝損傷前，對照組給予生理鹽水，抗體處理組給予上述制備的特異性抗Scdl蛋白的抗體。在連續(xù)給藥l周，每天1次后，兩組小鼠均由尾靜脈注射劑量為15mg/kg的ConA。 17小時(shí)后，取肝臟組織切片進(jìn)行H&E染色，或者進(jìn)行TUNEL染色。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，抗體處理組小鼠的肝損傷癥狀顯著更輕微。
實(shí)施例5.利用siRNA抑制Scdl的效果驗(yàn)證
根據(jù)Scdl基因的序列設(shè)計(jì)合成了特異性針對Scdl的siRNA，設(shè)計(jì)雙鏈的siRNA序列為
組l(siRNAl):
正向鏈5， GCGCAUCUCUAUGGAUAUC 3， (SEQ ID NO: 3);反向鏈5， GAUAUCCAUAGAGAUGCGC 3， (SEQ ID NO: 4)。組2(siRNA2):
正向鏈5， GAGAUCUCCAGUUCUUACA 3， (SEQ ID NO: 1);反向鏈5， UGUAAGAACUGGAGAUCUC 3， (SEQ ID NO: 2)。
在合成上述各條鏈時(shí)，在正向鏈和反向鏈的3，端各加上兩個(gè)堿基"TT"作為保護(hù)堿基。
正常小鼠分成兩組， 一組為對照組(用生理鹽水處理)， 一組為siRNA處理組l(siRNAl);另一組為siRNA處理組2 (siRNA2)。 siRNA處理組給予尾靜脈注射合成的特異性0.75 nmole/g體重Scdl siRNA。Scdl siRNA溶于2ml生理鹽水中，4秒內(nèi)完成注射。對照組以同樣方式給予生理鹽水。
48小時(shí)后兩組小鼠均由尾靜脈注射劑量為15mg/kg的ConA。 17小時(shí)后測定血清中ALT水平。
結(jié)果如圖4所示，可見siRNA處理組2的siRNA有效地抑制了Scdl的表達(dá)，從而有效地降低了血清中ALT水平，因此該種siRNA對于肝損傷有非常顯著的抑制作用。
取各組動(dòng)物的肝臟組織切片進(jìn)行H&E染色和TUNEL染色也發(fā)現(xiàn)，使用siRNA處理組2的siRNA的動(dòng)物的肝臟損傷水平明顯低于使用siRNA處理組l的siRNA，更低于對照組。
實(shí)施例6藥物篩選1.細(xì)胞水平篩選
取正常小鼠的肝臟細(xì)胞，該細(xì)胞可內(nèi)源性表達(dá)Scdl蛋白。將所述細(xì)胞培養(yǎng)于CM培養(yǎng)基中。將該種細(xì)胞作為用于篩選抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的藥物的細(xì)胞模型。
測試組用候選物質(zhì)處理的上述細(xì)胞的培養(yǎng)物；對照組不用候選物質(zhì)處理的上述細(xì)胞的培養(yǎng)物。
在處理后適當(dāng)時(shí)間，采用常規(guī)方法測定所述細(xì)胞的Scdl蛋白的表達(dá)、活性、存在量或分泌情況。如果與對照組相比，測試組中的Scdl蛋白的表達(dá)、活性、存在量或分泌顯著下降30%以上，則說明該候選物質(zhì)是潛在的抑制哺乳
15動(dòng)物肝損傷的物質(zhì)。
采用實(shí)施例4制備的特異性抗Scdl蛋白的抗體作為候選物質(zhì)進(jìn)行了測試，結(jié)果顯示Scdl蛋白的活性被抑制，從而該抗體是潛在的抑制哺乳動(dòng)物肝損傷
的物質(zhì)。
2.動(dòng)物水平篩選
以正常小鼠作為動(dòng)物模型。
測試組用候選物質(zhì)腹腔注射給予(還可通過灌胃、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射的方式給予)小鼠；
對照組不用候選物質(zhì)給予小鼠。
在處理后適當(dāng)時(shí)間，采用常規(guī)方法測定小鼠肝臟中Scdl蛋白的表達(dá)、活性、存在量或分泌情況。如果與對照組相比，測試組中的Scdl蛋白的表達(dá)、
活性、存在量或分泌顯著下降30%以上，則說明該候選物質(zhì)是潛在的抑制哺乳
動(dòng)物肝損傷的物質(zhì)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
16序列表
<110〉中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
<120〉 一種肝損傷相關(guān)的藥物靶點(diǎn)及其應(yīng)用
<130〉 085292
<160〉 4
<170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
<211〉 19
<212〉 隨
<213> 人丁.序列
<220〉
<221〉 misc_feature
<223〉 小干擾RNA
<400〉 1
gagaucucca guucuuaca
<210〉 2
〈211〉 19
<212〉 廳
<213〉 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223〉 小干擾RNA
<400> 2
uguaagaacu ggagaucuc
<210〉 3
<211> 19
<212〉 腿
<213> 人工序列
<220〉
<221〉 misc—feature
<223〉 小干擾RNA
<400〉 3
17gcgcaucucu auggauauc
<210〉 4
<211〉 19
<212〉 RNA
<213〉 人工序列
<220〉
<221> misc一feature<223〉 小干擾RNA
<400〉 4
gauauccaua gagmigcgc
權(quán)利要求
1.一種硬脂酰輔酶A去飽和酶1的拮抗劑的用途，用于制備抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的組合物。
2. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的肝損傷包括肝炎或肝臟組織壞死。
3. 如權(quán)利要求l所述的用途，其特征在于，所述的組合物還用于 降低肝損傷哺乳動(dòng)物的谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性；或 降低肝損傷哺乳動(dòng)物中炎性細(xì)胞因子的濃度。
4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述的炎性細(xì)胞因子選自TNF-a ， 或IFN- Y 。
5. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的硬脂酰輔酶A去飽和 酶1的拮抗劑選自特異性干擾硬脂酰輔酶A去飽和酶1基因表達(dá)的小干擾RNA分子或反義 核苷酸；或特異性與硬脂酰輔酶A去飽和酶1結(jié)合的抗體或配體。
6. 如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的硬脂酰輔酶A去飽和 酶1的拮抗劑是(a) SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；禾口/或(b) 核苷酸序列與SEQIDNO: 1互補(bǔ)的小干擾RNA分子。
7. —種用于抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的小干擾RNA分子，其特征在于，所述 的小干擾RNA分子是(a) SEQIDNO: 1所示核苷酸序列的小干擾RNA分子；和/或(b) 核苷酸序列與SEQIDNO: 1互補(bǔ)的小干擾RNA分子。
8. —種用于抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的組合物，其特征在于，所述的組合物含有(1) 有效量的權(quán)利要求7所述的小干擾RNA分子；和(2) 藥學(xué)上可接受的載體。
9. 一種篩選抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括 (1)用候選物質(zhì)處理表達(dá)硬脂酰輔酶A去飽和酶1的體系；和(2)檢測所述體系中硬脂酰輔酶A去飽和酶1的表達(dá)或活性；其中，若所述候選物質(zhì)可降低硬脂酰輔酶A去飽和酶1的表達(dá)或活性，則 表明該候選物質(zhì)是抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的潛在物質(zhì)。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(l)包括在測試組中， 將候選物質(zhì)加入到表達(dá)硬脂酰輔酶A去飽和酶1的體系中；和/或步驟(2)包括檢測測試組的體系中硬脂酰輔酶A去飽和酶1的表達(dá)或活性， 并與對照組比較，其中所述的對照組是不添加所述候選物質(zhì)的表達(dá)硬脂酰輔酶 A去飽和酶1的體系；如果測試組中硬脂酰輔酶A去飽和酶1的表達(dá)或活性在統(tǒng)計(jì)學(xué)上低于對照 組，就表明該候選物是抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的潛在物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肝損傷相關(guān)的藥物靶點(diǎn)及其應(yīng)用，所述的藥物靶點(diǎn)是硬脂酰輔酶A去飽和酶1(Scd1)，下調(diào)Scd1的表達(dá)可以顯著緩解哺乳動(dòng)物的肝損傷。本發(fā)明還公開了Scd1的拮抗劑的用途，用于制備抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的組合物。本發(fā)明還公開了篩選抑制哺乳動(dòng)物肝損傷的潛在物質(zhì)的方法。
文檔編號C12Q1/25GK101683354SQ200810200480
公開日2010年3月31日 申請日期2008年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月25日
發(fā)明者馮德春, 徐凌云 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院