專利名稱：：一種原位雜交綜合檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物檢測(cè)和疾病診斷領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與肝癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的檢測(cè)技術(shù)。
背景技術(shù)：
：肝癌在我國和亞洲的發(fā)病率比較高，死亡率在全球排第四，在我國高居第二。5年的生存率，不論在東方，還是西方，一般不超過5%，主要原因之一就是與肝癌的轉(zhuǎn)移問題有關(guān)，如何攻克肝癌的治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)問題，仍是當(dāng)前面臨的一個(gè)十分艱巨的任務(wù)。肝癌與其它癌癥轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制一樣，是多基因參與的動(dòng)態(tài)變化過程，如果做到早期診斷，和治療后的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的檢測(cè)，這是延長(zhǎng)生存期和治愈的希望所在。由于肝臟隱匿在上腹深部，有肋骨為其屏障，故腫瘤早期不易發(fā)現(xiàn)，另外，肝臟有強(qiáng)大的代償能力，早期無癥狀，這也給早診帶來困難，此外，一旦肝癌癥狀出現(xiàn)就到了晚期。做到在無癥狀人群中就能早期發(fā)現(xiàn)病例和治療后及早檢測(cè)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的情況，也就是說在基因水平做到早診和治療后的及早檢測(cè)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，這對(duì)控制降低肝癌的死亡率有非常重要的臨床意義。在肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的研究中，已發(fā)現(xiàn)諸多觀察肝癌轉(zhuǎn)移的分子標(biāo)記物及相關(guān)因子，建立了一些診斷參數(shù)和技術(shù)指標(biāo)，但這些指標(biāo)大多的依據(jù)來自于后期病理變化的反應(yīng)及術(shù)后或其它治療后，如影像醫(yī)學(xué)已見到占位性病灶的復(fù)發(fā)或肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)后相關(guān)蛋白的變化，這離轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期診斷還有一個(gè)時(shí)間和空間過程。如何從單細(xì)胞水平和基因水平做到早期診斷和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的早期檢測(cè)是我們要實(shí)現(xiàn)治愈肝癌的關(guān)鍵?，F(xiàn)在臨床上有一個(gè)錯(cuò)誤概念，依照傳統(tǒng)的影像醫(yī)學(xué)和結(jié)合其它生化檢測(cè)指標(biāo)，判定占位性的癌癥在二公分以下是屬于早期癌癥，這一概念值得認(rèn)真討論。醫(yī)學(xué)影像學(xué)的2CM以下的腫塊屬于早期癌癥這一界限科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，從?xì)胞學(xué)的角度，1CM腫塊約有1億個(gè)腫瘤細(xì)胞，2CM的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)目，遠(yuǎn)不止2億個(gè)腫瘤細(xì)胞。由于目前臨床上的診斷手段比較缺乏，通過X線、B超、CT、核磁共振等的手段能分辨在l-2CM以下的腫瘤己經(jīng)不錯(cuò)。而事實(shí)上是，從單克隆癌細(xì)胞到2CM以下的腫塊可能是相當(dāng)長(zhǎng)的病理演變過程，可能是一年或兩年及三年以上，從癌變前期到癌細(xì)胞形成及生成2CM腫塊要經(jīng)過相當(dāng)長(zhǎng)的病理演變過程，在這個(gè)病理演變過程中，難以證實(shí)早先形成癌細(xì)胞克隆腫塊是唯一的癌塊，可能在最早形成克隆腫塊的同時(shí)，癌細(xì)胞通過不同的途徑遷移到其它部位克隆生長(zhǎng)。這在臨床上己得到證實(shí)，一旦切除腫塊后，其他地方會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或其它多發(fā)的腫塊先后形成或轉(zhuǎn)移。因此，在臨床上以2CM以下大小的腫塊來界分早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)，事實(shí)上這時(shí)的癌變已屬于晚期，這是導(dǎo)致癌癥死亡率不降的真正理由。隨著分子生物學(xué)技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，疾病基因組學(xué)和癌癥基因組學(xué)研究的深入開展，至今，有可能在基因水平上做到更科學(xué)的早期診斷，特別是在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆時(shí))就能做到早期預(yù)測(cè)診斷。AFP是甲胎蛋白，它的功能及出現(xiàn)的病理生理機(jī)制已研究得相當(dāng)清楚，臨床一直用AFP生化指標(biāo)診斷肝癌的發(fā)生，在蛋白水平有非常重要的臨床意義。根據(jù)文獻(xiàn)及統(tǒng)計(jì)資料顯示，AFP陽性病人，大多影像檢査中有大的占位現(xiàn)象，AFP陰性的病人肝癌的發(fā)病率也不低，特別是癌腫小于2CM以下的病人，AFP的陽性率很低，其癌塊直徑2CM以上和直徑2CM以下的肝癌陽性率分別是50%和20%。所以，AFP的診斷指標(biāo)不能說是早期，更早期的診斷應(yīng)該是AFPmRNA,AFP基因的檢查。弗吉尼亞大學(xué)的泌尿?qū)W與分子生理學(xué)教授DanTheodorescu博士領(lǐng)導(dǎo)的科學(xué)小組研究表明，RhoGDI2基因與癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)系，當(dāng)RhoGDI2基因在癌細(xì)胞中有活性時(shí)，細(xì)胞就產(chǎn)生一種能夠阻止癌細(xì)胞浸入到其他器官的蛋白，該項(xiàng)研究發(fā)表在2006年11月15日期的《癌癥研究》(《cancerresearch》)雜志上。本發(fā)明人在對(duì)大量樣本——廣泛性腺癌(肝、肺、腎、胃、子宮、卵巢、乳房、直腸等組織細(xì)胞)檢測(cè)中觀察到，肝癌病人伴有轉(zhuǎn)移者，RhoGDI2基因表達(dá)量降低或零表達(dá)，該指標(biāo)有重要的臨床價(jià)值。RhoGDI2基因表達(dá)量降低或零表達(dá)，證明肝癌已轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。原位雜交技術(shù)(insituhybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測(cè)特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)標(biāo)記探針進(jìn)行探測(cè)，從而在細(xì)胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對(duì)何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo)記，以利于以后的檢測(cè)。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常用的同位素標(biāo)記物有3H、35S、1251和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但是由于放射性同位素對(duì)人和環(huán)境均會(huì)造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢(shì)。非同位素標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測(cè)這些標(biāo)記物的方法都是極其靈敏的。根據(jù)所用探針及所要檢測(cè)核酸的不同又可分為DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和顯示。綜上所述，本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交綜合檢測(cè)試劑盒，包含兩組原位雜交檢測(cè)探針和標(biāo)記物。其次，本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與肝癌早期發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)的AFPmRNA和RhoGDI2基因的原位雜交檢測(cè)方法。
發(fā)明內(nèi)容為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明首先提供一種原位雜交綜合檢測(cè)試劑盒，其包括兩組雜交探針和標(biāo)記物，其中，所述的雜交探針分別具有序列表SEQIDNO:1及SEQIDNO:2所示序列，其分別為AFPmRNA基因及RhoGDI2基因的序列。AFPmRNA是表明肝癌發(fā)生的基因，其核苷酸序列長(zhǎng)度是2032bp，位于染色體4qll"-ql3"位點(diǎn)上；RhoGDI2基因是一種癌癥轉(zhuǎn)移抑制基因，其核苷酸序列長(zhǎng)度是605bp，位于染色體12p.3位點(diǎn)上。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶、地高辛及納米材料，優(yōu)選地高辛。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括雜交液。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括增強(qiáng)劑。本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括顯色劑。本發(fā)明的試劑盒是采用核酸原位雜交技術(shù)，以甲胎蛋白基因AFPmRNA和RhoGDI2基因?yàn)闄z測(cè)對(duì)象，檢測(cè)的底物是人體血液標(biāo)本和組織細(xì)胞的RNA的表達(dá)量，原位雜交的顯色方法能半定量和定量提示AFPmRNA和RhoGDI2基因表達(dá)量，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法，建立肝癌早期診斷和治療后及早檢測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況的標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)值。AFPmRNA的陽性和表達(dá)增高，病人已患肝癌，RhoGDI2基因表達(dá)量降低或零表達(dá)，證明肝癌己轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。一個(gè)試劑盒可以多人份使用或一人份使用。本發(fā)明的試劑盒的組分是由雜交探針、雜交液、顯色劑、增強(qiáng)劑等組成。本試劑盒的雜交原理是將基因AFPmRNA和RhoGDI2的cDNA片段插入含有相當(dāng)?shù)腞NA聚合酶啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄性載體，通過選用不同的RNA聚合酶，控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向，從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針(senseprobe)和與mRNA互補(bǔ)的反義RNA探針(antisenseprobe),用反義RNA探針與被檢人體白細(xì)胞或組織細(xì)胞(待測(cè)mRNA)進(jìn)行原位雜交，用同義RNA探針與被檢人體白細(xì)胞或組織細(xì)胞(待測(cè)mRNA)進(jìn)行原位雜交，作于反義RNA探針的陰性(內(nèi))對(duì)照，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明還提供一種AFPmRNA和RhoGDI2基因原位雜交的檢測(cè)方法，包括以下步驟(1)在上述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時(shí)間為16—24小時(shí)。本發(fā)明所述的檢測(cè)方法，其中優(yōu)選地是，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本或肝組織細(xì)胞標(biāo)本。更優(yōu)選地是，所述的血液標(biāo)本或肝臟組織細(xì)胞來自肝癌和/或伴有轉(zhuǎn)移灶的患者、健康人。本發(fā)明的檢測(cè)方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測(cè)底物細(xì)胞中的AFPmRNA和RhoGDI2基因表達(dá)量，用來確定肝癌是否發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移，臨床研究表明，AFPmRNA與肝癌發(fā)生有關(guān)，而RhoGDI2基因與癌癥轉(zhuǎn)移有關(guān)。由于AFPmRNA表達(dá)由癌細(xì)胞(單個(gè)克隆細(xì)胞)產(chǎn)生，AFPmRNA可作為早期肝癌診斷指標(biāo)，做AFPmRNA的檢測(cè)有助于AFP蛋白陰性時(shí)，影像學(xué)檢查難以確診占位病變以前，及早確診肝癌的發(fā)生。RhoGDI2是癌癥轉(zhuǎn)移抑制基因，本發(fā)明人在對(duì)大量樣本——廣泛性腺癌(肝、肺、腎、胃、子宮、卵巢、乳房、直腸等組織細(xì)胞)檢測(cè)中觀察到，肝癌病人伴有轉(zhuǎn)移者，RhoGDI2基因表達(dá)量降低或零表達(dá)，該指標(biāo)有重要的臨床價(jià)值。AFPmRNA的陽性和表達(dá)增高，病人已患肝癌，RhoGDI2基因表達(dá)量降低或零表達(dá)，證明肝癌已轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。本發(fā)明的具體實(shí)施步驟，是業(yè)內(nèi)人士熟知的核酸雜交技術(shù)，依次進(jìn)行標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析，其中雜交的具體步驟包括1).將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；2).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)加消化液；3).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)后固定；4).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)預(yù)雜交(42°C);5).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；6).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)雜交(42。C);7).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗；8).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)與抗體培養(yǎng)(室溫)；9).儀器自動(dòng)棄去液體，自動(dòng)清洗，顯色；10).取出封片鏡檢。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的方案是以AFPmRNA和RhoGDI2基因?yàn)槟康幕蚝铣傻暮怂崽结樣玫馗咝翗?biāo)記(地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn)，還克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn))，將該雜交探針與人體血液白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位,根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。如上所述，當(dāng)檢測(cè)到AFPmRNA的表達(dá)高于正常對(duì)照時(shí)，則可預(yù)測(cè)受試者為肝癌早期或肝癌易感性。RhoGDI2已被公認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，我們?cè)谘芯恐凶C實(shí)，RhoGDI2基因與廣譜腺癌癥轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，病患者中該基因的表達(dá)量比正常人表達(dá)量都低。本發(fā)明具有如下有益效果由于AFP血液檢測(cè)肝癌，診斷準(zhǔn)確率較低，其癌塊直徑2CM以上和直徑2CM以下的肝癌陽性率分別是50%和20%,如何做到影像醫(yī)學(xué)手段無法檢査到癌腫，在AFP蛋白出現(xiàn)前，就能發(fā)現(xiàn)肝癌已發(fā)生及己轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，這就是本發(fā)B月基因診斷的意義所在本發(fā)明選用AFPmRNA和RhoGDI2這兩組基因，開發(fā)出肝癌早期診斷和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的檢測(cè)試劑盒，可在基因水平上檢測(cè)消化器官癌癥細(xì)胞中AFPmRNA和RhoGDI2基因表達(dá)量，有助于臨床及早發(fā)現(xiàn)肝癌，及早治療，以及治療后及早檢測(cè)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移變化，做到早診、早治、早預(yù)防，甚至根治的目的，同時(shí)應(yīng)用于肝癌的預(yù)測(cè)醫(yī)學(xué)亦有重要的臨床意義。與其他癌癥檢測(cè)試劑盒相比，二組基因同時(shí)檢測(cè)可動(dòng)態(tài)觀察癌癥變化全過程，可更有效地檢測(cè)癌變動(dòng)態(tài)。此外，本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法操作方便、簡(jiǎn)單，能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。圖1是本發(fā)明AFPmRNA和RhoGDI2基因原位雜交實(shí)施例圖。圖2是本發(fā)明實(shí)施例中肝癌病人AFP過量表達(dá)圖片。圖3是本發(fā)明實(shí)施例中肝癌病人RhoGDI2表達(dá)降低圖片。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)該理解，下面的實(shí)施例用于說明而非限定本
發(fā)明內(nèi)容，任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1按照常規(guī)方法制備本實(shí)施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以AFPmRNA和RhoGDI2基因?yàn)闄z測(cè)目的基因設(shè)計(jì)的雜交探針、標(biāo)記物、說明書，其中本實(shí)施例的探針標(biāo)記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>陽性對(duì)照標(biāo)本6片/盒配制試劑使用濃度1).將10x緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成lx緩沖液I;2).將20x緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2x緩沖液II;按1:100稀釋成0.2x緩沖液II;按1:200稀釋成0.1x緩沖液II;3).將lOx緩沖液m用三蒸水按1:10稀釋成lx緩沖液III;4).10x緩沖液IV用三蒸水按l:10稀釋成x緩沖液rV(取W，2#，3#各10mL，加水至100mL既可)。實(shí)施例2應(yīng)用核酸原位雜交檢測(cè)方法對(duì)癌癥早期AFPmRNA和RhoGDI2基因表達(dá)的實(shí)施過程1).取待測(cè)標(biāo)本兩張；2).在玻璃缸里加入消化液(消化液lOOpL加lx緩沖液I99.9ml，即為使用濃度)50ml，37°。水浴預(yù)熱10min，放進(jìn)16張玻片，37。C處理12min,再用lx緩沖液I洗5min;3).用0.2%的保護(hù)液(保護(hù)液lml加lx緩沖液I，99ml即為使用濃度)洗10min,三蒸水洗5min(以上過程都在玻璃缸進(jìn)行)，取出玻片，讓其自然干燥；4).將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液25pL/片(加在有細(xì)胞的地方)，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42。C恒溫水浴箱中3h以上；5).取出玻片,棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi),用70%、90%、95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；6).將玻片放入保濕盒內(nèi)，一張加正義雜交液25pL/片，另一張加反義雜交液25pL/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42。C恒溫水浴箱中16-24h;7).取出玻片,棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42'C恒溫水浴箱中用2x緩沖液II洗兩次,每次15min;在42"恒溫水浴箱中用0.2x緩沖液II洗一次,每次15min;在42-C恒溫水浴箱中用O.lx緩沖液II洗兩次,每次15min;8).用lx緩沖液ni洗30s,取出玻片，自然干燥；9).將玻片放入保濕盒內(nèi),加0.5%封閉液(lml封閉液加5mllx緩沖液m)10(HiL/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。(此步驟不需加蓋玻片)；10).取出玻片,用lx緩沖液III洗30s,自然干燥；11).將玻片放入保濕盒內(nèi)，力QX-AP抗體(取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入1.8mllx緩沖液in)100pL/片,蓋緊保濕盒在室溫下作用30min,時(shí)間不能過長(zhǎng)，否則會(huì)產(chǎn)生假陽性(此步驟不需加蓋玻片)；12).取出玻片，用lx緩沖液III洗3次，每次15min;13).用lx緩沖液IV洗2min,加顯色劑(顯色劑A73.3pL，顯色劑B157.5jaL加到30mL1x緩沖液IV中,混勻)，室溫避光16h到18h以上；14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的lx緩沖液I混勻)封片鏡檢。本發(fā)明的核酸原位雜交檢測(cè)方法將目的基因用地高辛標(biāo)記，成為RNA核酸探針，將探針與人體白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，因此在光鏡下觀察mRNA的存在和定位,根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。實(shí)施例3肝癌病人20名，正常對(duì)照組10名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細(xì)胞)做原位雜交。結(jié)果表示，所有癌癥患者AFP基因有過度表達(dá)，細(xì)胞染色；正常對(duì)照組AFP基因不表達(dá)，細(xì)胞無染色。期中臨床診斷轉(zhuǎn)移的病人30例RhoGDI2基因表達(dá)降低，10例病人RhoGDI2基因不表達(dá)，細(xì)胞無染色。具體結(jié)果見圖2、圖3。序列表:〈110〉〈120><130>SEQUENCELISTING芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司一種原位雜交綜合檢測(cè)試劑M檢測(cè)方法〈150〉200710171737.X〈151〉2007-11-30〈歸2〈170〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉1830〈212〉DNA<213〉Homosapiens〈400〉1atgaagtgggtggaatcaatttttttaattttcctactaaattttactgaatccagaaca60ctgcatagaaatgaatatggaatagcttccatattggattcttaccaatgtactgcagag120ataagtttagctgacctggctaccatattttttgcccagtttgttcaagaagccacttac180aaggaagtaagcaaaatggtgaaagatgcattgactgcaattgagaaacccactggagat240gaacagtcttcagggtgtttagaaaaccagctacctgcctttctggaagaactttgccat300gagaaagaaattttggagaagtacggacattcagactgctgcagccaaagtgaagaggga360agacataactgttttcttgcacacaaaaagcccactccagcatcgatcccacttttccaa420gttccagaacctgtcacaagctgtgaagcatatgaagaagacagggagacattcatgaac480aaattcatttatgagatagcaagaaggcatcccttcctgtatgcacctacaattcttctt540tgggctgctcgctatgacaaaataattccatcttgctgcaaagctgaaaatgcagttgaa600tgcttccaaacaaaggcagcaacagttacaaaagaattaagagaaagcagcttgttaaat660caacatgcatgtgcagtaatgaaaaattttgggacccgaactttccaagccataactgtt720actaaactgagtcagaagtttaccaaagttaattttactgaaatccagaaactagtcctg780gatgtggcccatgtacatgsgcactgttgcagaggagatgtgctggattgtctgcaggat840ggggaaaaaatcatgtcctacatatgttctcaacaagacactctgtcaaacaaaataaca900gaatgctgcaaactgaccacgctggaacgtggtcaatgtataattcatgcagaaaatgat960gaaaaacctgaaggtctatctccaaatctaaacaggtttttaggagatagagattttaac1020caattttcttcaggggaaaaaaatatcttcttggcaagttttgttcatgaatattcaaga1080agacatcctcagcttgctgtctcagtaattctaagagttgctaaaggataccaggagtta1140ttggagaagtgtttccagactgaaaaccctcttgaatgccaagataaaggagaagaagaa1200ttacagaaatacatccaggagagccaagcattggcaaagcgaagctgcggcctcttccag1260aaactaggagaatattacttacaaaatgcgtttctcgttgcttacacaaagaaagccccc1320cagctgacctcgtcggagctgatggccatcaccagaaaaatggcagccacagcagccact1380tgttgccaactcagtgaggacaaactattggcctgtggcgagggagcggctgacattatt1440atcggacacttatgtatcagacatgaaatgactccagtaaaccctggtgttggccagtgc1500tgcacttcttcatatgccaacaggaggccatgcttcagcagcttggtggtggatgaaaca1560tatgtccctcctgcattctctgatgacaagttcattttccataaggatctgtgccaagct1620cagggtgtagcgctgcaaacgatgaagcaagagtttctcattaaccttgtgaagcaaaag1680ccacaaataacagaggaacaacttgaggctgtcattgcagatttctcaggcctgttggag1740aaatgctgccaaggccaggaacaggaagtctgctttgctgaagagggacaaaaactgatt1800tcaaaaactcgtgctgctttgggagtttaa1830〈210〉2〈211〉606<212〉DNA〈213〉Homosapiens<2atgactgaaaaagccccagagccacatgtggaggaggatgatgatgatgagctggacagc60aagctcaattataagcctccaccacagaagtccctgaaagagctgcaggaaatggacaaa120gatgatgagagtctaattaagtacaagaaaacgctgctgggagatggtcctgtggtgaca180gatccgaaagcccccaatgtcgttgtcacccggctcaccctggtttgtgagagtgccccg240ggaccaatcaccatggaccttactggagatctggaagccctcaaaaaggaaaccattgtg300ttaaaggaaggttctgaatatagagtcaaaattcacttcaaagtgaacagggatattgtg360tcaggcctgaaatacgttcagcacacctacaggactggggtgaaagtggataaagcaaca420tttatggttggcagctatggacctcggcctgaggagtatgagttcctcactccagttgag480gaggctcccaagggcatgctggcgcgaggcacgtaccacaacaagtccttcttcaccgac540gatgacaagcaagaccacctcagctgggagtggaacctgtcgattaagaaggagtggaca600gaatga60權(quán)利要求1、一種原位雜交綜合檢測(cè)試劑盒，包括兩組雜交探針和標(biāo)記物，其特征在于，所述的雜交探針分別具有序列表SEQIDNO1及SEQIDNO2所示的序列。2、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶、地高辛及納米材料，優(yōu)選地高辛。3、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括雜交液。4、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括增強(qiáng)劑。5、如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括顯色劑。6、一種AFPmRNA和RhoGDI2基因原位雜交檢測(cè)方法，其特征在于，該方法包括以下步驟(1)在權(quán)利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)mRNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。7、如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時(shí)間為16—24小時(shí)。8、如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本和肝組織細(xì)胞標(biāo)本。9、如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，其中所述的血液標(biāo)本和肝組織細(xì)胞標(biāo)本來自肝癌和/或伴有轉(zhuǎn)移灶的患者、健康人。全文摘要本發(fā)明公開一種原位雜交綜合檢測(cè)試劑盒，其包括兩組雜交探針和標(biāo)記物。還公開利用本試劑盒原位雜交檢測(cè)與肝癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移相關(guān)的AFPmRNA和RhoGDI2基因的方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下，將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸，形成雜交復(fù)合體；和(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒可在基因水平上檢測(cè)AFPmRNA和RhoGDI2基因的表達(dá)量，比AFP檢測(cè)更早期，能達(dá)到真正的早期診斷的目的，可有效提高肝癌治愈率，同時(shí)，本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單方便，便于應(yīng)用。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101429550SQ20081017836公開日2009年5月13日申請(qǐng)日期2008年11月27日優(yōu)先權(quán)日2007年11月30日發(fā)明者張?jiān)聘?裘建英申請(qǐng)人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司