專利名稱：：一種豬瘟病毒e2次單位疫苗及其制備的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明是關于一種豬瘟疫苗及其制備方法。
背景技術：
：豬瘟為臺灣及世界部分地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)所面臨的最嚴重疾病之一。豬瘟病毒的天然宿主只有馴養(yǎng)豬及野豬，病毒對任何年齡的豬皆具感受性及傷害性。目前除少數(shù)特殊目的養(yǎng)豬場未使用疫苗防治及歐美國家采撲殺政策外，幾乎所有豬只在成長過程中最少須使用兩次以上疫苗才能免于豬瘟的危害。而目前臺灣每年生產(chǎn)毛豬數(shù)量仍維持在600萬頭以上，東南亞、中國及南美洲產(chǎn)量更數(shù)十倍于此，因此具保護作用的次單位疫苗對于該市場具有非常高的經(jīng)濟價值。全世界使用最廣泛的豬瘟疫苗為兔化減毒疫苗或細胞減毒疫苗，例如臺灣使用的兔化疫苗(LPC)已連續(xù)通過兔體繼代減毒l，OOO代以上(劉永和1978，臺灣畜牧獸醫(yī)學會會報32:38-39);而日本使用的細胞培養(yǎng)疫苗(GP)是將病毒于天竺鼠腎細胞減毒(林再春等1969，臺灣省畜衛(wèi)所研報6:1-10;謝竹茂等1981，臺灣省畜衛(wèi)所研報7:13-16)。但減毒疫苗存在的缺點是容易受移行抗體干擾與免疫后的抗體反應無法與野外病毒感染區(qū)分。因此1990年代以后歐洲國家如德國及荷蘭已相繼開發(fā)E2次單位疫苗(Kretzdornetal.，2005.美國發(fā)明專利第6，919，085號；Boumaetal.，1999.Vet.Microbiol.66:101-114;Ahrensetal.，2000.Vet.Microbiol.77:83-97;葡Ge皿ipetal.，2002.Vaccine20:1544-1556)，其最大優(yōu)點可做為野外病毒感染的區(qū)別診斷(vanRijnetal.，1999.Vaccine17:433-440)，然歐洲的生產(chǎn)是統(tǒng)為昆蟲桿狀病毒(AcNPV)及昆蟲細胞(Sf21)，其制程長且生產(chǎn)的疫苗成本相當高不適合量產(chǎn)使用。1986年日本Dr.Yanai則首先使用家蠶桿狀病毒(BmNPV)當做載體(Maedaetal.，1985，Nature315:592-594;美國發(fā)明專利第5，480，956號)大量生產(chǎn)外源性重組蛋白貓科動物干擾素(Felineinterferon)。豬瘟病毒在臺灣已存在長久并持續(xù)威脅養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)，然1996年后發(fā)現(xiàn)外來病毒株(基因亞型2.1型，Subgroup2.1)已完全取代本土型病毒株(基因亞型3.4型，Subgroup3.4)現(xiàn)象(Dengetal.，2005，Vet.Microbiol.106:187-193;Linetal.，2007.VirusGenes35:737-744)且其抗原性與原來本土型病毒已有差異。此外，荷蘭及德國開發(fā)的E2次單位疫苗是利用細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)，進口販賣價格達30元臺幣以上，對于飼主在成本上形成不小的負擔。因此，如何根據(jù)新入侵型病毒株基因亞型2.1開發(fā)有效疫苗，以減少豬只感染并降低養(yǎng)豬業(yè)的損失，同時又能兼具低生產(chǎn)成本的優(yōu)點，將是一個極需解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的特征在于使用家蠶作為蛋白產(chǎn)制平臺，其方法為使用家蠶桿狀病毒(BmNPV)，攜帶一重組豬瘟病毒E2基因于家蠶蟲體中增生表現(xiàn)，并于家蠶體液中表現(xiàn)該重組豬瘟病毒E2蛋白。本發(fā)明的另一特征即為將其重組E2蛋白開發(fā)成豬瘟E2次單位疫苗，便于大量制造，且每劑量疫苗抗原成本大幅降低。因此，本發(fā)明是提供一種制備豬瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括(1)選殖一重組豬瘟病毒E2基因于一適當載體中；(2)以該帶有豬瘟病毒E2基因的載體與一家蠶桿狀病毒(Baculovirus;BmNPV)的基因體共同轉染家蠶細胞(BmN)，使其自然發(fā)生基因重組反應而得到帶有E2基因的重組家蠶桿狀病毒；(3)篩選力價最高的重組桿狀病毒株為種病毒株；(4)使用該種病毒株感染家蠶；(5)養(yǎng)殖被感染的家蠶一段適當?shù)臅r間讓病毒進行復制，以產(chǎn)生出重組桿狀病毒并表現(xiàn)E2蛋白于體液中；(6)搜集被種病毒株感染的家蠶體液而得到重組E2蛋白，可作為豬瘟疫苗的抗原。本發(fā)明另外提供一種用于預防或是控制豬瘟病毒感染的豬瘟疫苗，其中該豬瘟疫苗包括如上述方法所制備的重組豬瘟病毒E2蛋白與一可接受的佐劑。附圖簡述前文的所述以及實施方式可通過附圖達到更好的說明效果。為了加強本發(fā)明的說明，將適當?shù)膶嵤├母綀D列舉于此。要注意的是，本發(fā)明并不受限于列舉于此的說明。圖1是E2次單位重組基因的質(zhì)粒(pBpE2-his)的建構圖。圖2是表示重組E2蛋白的濃度，其為以抗組氨酸抗體進行西方墨點法的結果。道1至道8分別表示8只不同蠶體的體液，道9、道10與道11則為標準蛋白質(zhì)含量的標示，其分別表示50ng，200ng，400ng。Y軸為蛋白的分子量標示，單位為kDa。圖3是表示重組E2蛋白的濃度，其為以抗組氨酸抗體與WH303抗體進行西方墨點法的結果。道1至道5為E2蛋白兩倍連續(xù)稀釋后的結果(道1為1:1，道2為1:2，道3為l:4，道4為1:8，道5為1:16)?！?〃號表示E2蛋白純化后定量為136.832ng/P1的濃度的結果。圖4為表示每劑量60iig的家蠶表現(xiàn)蛋白與不同佐劑混合，進行免疫效力評估的結果。X軸表示的為每隔兩周采血的時間點，Y軸表示的為抗體稀釋倍率。圖5為表示不同劑量抗原0-120iig與TW-W/0佐劑制成疫苗，進行免疫效力評估的結果。X軸表示的為每隔兩周采血的時間點，Y軸表示的為抗體稀釋倍率。實施方式本發(fā)明的主要目的為提供一種制備豬瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括(1)選殖一重組豬瘟病毒E2基因于一適當載體中；(2)以該帶有豬瘟病毒E2基因的載體與一家蠶桿狀病毒(Baculovirus;BmNPV)的基因體共同轉染家蠶細胞(BmN)，使其自然發(fā)生基因重組反應而得到帶有E2基因的重組家蠶桿狀病毒；(3)篩選力價最高的重組桿狀病毒株為種病毒株；(4)使用該種病毒株感染家蠶；(5)養(yǎng)殖被感染的家蠶一段適當?shù)臅r間讓病毒進行復制，以產(chǎn)生出重組桿狀病毒并表現(xiàn)E2蛋白于體液中；4(6)搜集被種病毒株感染的家蠶體液而得到重組E2蛋白，可作為豬瘟疫苗的抗原。"家蠶桿狀病毒"為家蠶主要病害之一，該病毒特色為具有強力的啟動子，可在感染短短數(shù)天內(nèi)制出大量的蛋白產(chǎn)物，其啟動子所制造外源蛋白的量，可高達感染細胞的20%以上。因此，家蠶蠶體可作為一個有效率且經(jīng)濟的蛋白生產(chǎn)平臺，利用家蠶桿狀病毒將表達特定蛋白的轉殖基因帶入家蠶蠶體，利用家蠶蠶體進行轉殖基因的增生及表現(xiàn)。此領域的技術人員可根據(jù)所擬表達蛋白的需要，自行生產(chǎn)家蠶桿狀病毒并修改其啟動子。根據(jù)本發(fā)明的一實施例，所使用的家蠶桿狀病毒是由中央研究院分子生物所趙裕展博士以基因重組方法改造及構筑，其中控制轉錄的BmNPV的polyhedrin啟動子亦由趙博士于中央研究院石開發(fā)(WuandChao，2008，BiotechnologyProgress,accepted)。本文中所稱的"豬瘟病毒"(Classicswinefevervirus;CSFV)，在分類上是屬于Flaviviridae的Pestivirus，為正向單股、有外鞘的RNA病毒。根據(jù)本發(fā)明的一實施例，可使用基因亞型2.1的豬瘟病毒。根據(jù)M.-C.Dengetal.(M._C.Dengetal.，2005，VeterinaryMicrobiology106:187-193)的研究報告，自1993年至2003年間，臺灣共分離到24種屬于基因亞型2.1的豬瘟病毒，其中更可進一步區(qū)分為2.la與2.lb兩種。目前已知的基因亞型2.la的豬瘟病毒包括有118/FL/94、CH/96、c/TN/96、TD/96、32/IL/96、PD/98、PD/99、SC/00、CY/01、83/PD/01、03/TN/01、0401/CH/01、IL/01、TD/01、SC/01、81/TD/01與YL/01。目前已知的基因亞型2.lb的豬瘟病毒包括有0406/CH/01、85/TN/01、82/YL/01、02/TN/01、8/YL/01、266/YL/01與267/YL/01。根據(jù)本發(fā)明的一實施例，使用的豬瘟病毒為TD/96/TWN株。本文中所稱的"豬瘟病毒E2基因"或稱"豬瘟病毒E2次單位基因"，為豬瘟病毒外鞘上一種醣蛋白的核苷酸分子，目前已知是最具抗原性且最具有病毒中和效果。在此所稱的"豬瘟病毒E2次單位抗原蛋白"，是指由豬瘟病毒E2次單位基因所轉譯出的蛋白質(zhì)，本領域技術人員可自行依據(jù)需要，利用一般分子生物學的方法設計重組蛋白。根據(jù)本發(fā)明的一實施例，本發(fā)明的豬瘟病毒E2次單位抗原蛋白共有362個氨基酸，包含El的20個C端氨基酸序列及E2的342個N端至TM區(qū)域的氨基酸，具有如序列編號l(SEQIDNO:1)的氨基酸序列。根據(jù)本發(fā)明的一實施例，本發(fā)明的E2次單位抗原蛋白的核酸序列來自于臺灣的TD/96型的豬瘟病毒(TD/96/TWN)。以前述具有如序列編號1的氨基酸序列的E2蛋白的序列作比對，與基因亞型2.la的病毒種類有約96.9X的相似度，與基因亞型2.lb的病毒種類有約97.8%的相似度，而與基因亞型2.la與2.lb的病毒種類有約94.1_95.1%的相似度。因此由本發(fā)明方法所制得的疫苗，對于基因亞型2.la與2.lb的豬瘟病毒應具防御功效。根據(jù)本發(fā)明，為制備本發(fā)明豬瘟病毒疫苗的抗原蛋白，本發(fā)明所屬
技術領域：
中具有通常知識者可根據(jù)一般分子生物學方法，或目前已知基因比對方法與數(shù)據(jù)庫鑒定其所純化的病毒與豬瘟病毒基因亞型2.1的抗原蛋白氨基酸序列具一定相似度(例如90%或96%以上)以上的重組基因。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明選殖出帶有自行設計的E2次單位基因的載體，與家蠶桿狀病毒進行重組反應后，可得到帶有重組E2次單位基因的家蠶桿狀病毒，接著將帶有重組基因的病毒感染家蠶一段適當時間(例如3-5天)，使病毒進行復制以增生重組桿狀病毒并表現(xiàn)E2次單位抗原于家蠶的體液中，因此可由所得的家蠶的體液分取得E2次單位抗原蛋白。根據(jù)本發(fā)明，所使用的家蠶并無品種的限定，目前已知的家蠶品種皆可作為本發(fā)明的蛋白生產(chǎn)平臺。本發(fā)明所屬
技術領域：
中具有通常知識者可根據(jù)蛋白特性、病毒感染能力等因素，自行決定所使用的家蠶品種。依本發(fā)明的一實施例，所采用的家蠶品種為由原種0J03及原種0J04雜交的二品種(OJ03xOJ04)，由行政院農(nóng)業(yè)委員會苗栗區(qū)農(nóng)業(yè)改良場提供。本發(fā)明的另外一個目的為提供一種用于預防或是控制豬瘟病毒感染的豬瘟疫苗組合物，其中該豬瘟疫苗組合物包括如上述的方法所制備的重組豬瘟病毒抗原蛋白與一可接受佐劑。在此所稱的"佐劑"，是指一種能增強特定醫(yī)療效果的物質(zhì)，在免疫學上指能增強宿主對外來物質(zhì)反應的物質(zhì)。若從類型來分，一般在醫(yī)學上可用于人體或動物的佐劑包括有無機性的佐劑，如氫氧化鋁或明礬等；有機性的佐劑，如脂質(zhì)粒、油性佐劑或人工合成的聚核苷酸(polyl:C)等；生物性佐劑，如細胞激素、病毒顆粒等。若從劑型來分，可分為水性、油性、水包油(W/0)、油包水(0/W)或水包油包水(W/0/W)等。一般而言，油性佐劑對動物組織的剌激性較大，容易產(chǎn)生注射部位腫脹，引起慢性炎癥反應，但大多數(shù)的油性佐劑可以啟動非專一性的免疫反應，提高疫苗的保護效果。由于組織吸收油的速度較慢，因此抗原可被保存在油滴中緩慢釋放，延長疫苗保護效果。相反地，水性佐劑將抗原一次釋放，所以可以迅速剌激非常高免疫力，但免疫力的維持較短。熟知技藝的人士可根據(jù)一般免疫學知識，以及評估宿主年齡、性別、抗原強度或施打間隔等因素，自行調(diào)配佐劑或采用市售佐劑來加強疫苗的效果。根據(jù)本發(fā)明的實施例，較佳為油性佐劑。根據(jù)本發(fā)明的一實施例，比較各種油性佐劑加強疫苗的效果，同時與多種市售油性佐劑與自行調(diào)配佐劑共同調(diào)配，其中該市售油性佐劑是為采購自法國SEPPIC廠的進口佐劑，包括ISA206、ISA25、ISA1113等三種，而自行調(diào)配佐劑則是采用Marcol52(EPPIC，SydneyAustralia)及接口活性劑Monta麗80(EssoPetroleumCo.Ltd,UK)調(diào)配而成，且E2次單位抗原與各種油性佐劑混和的比例為35-65:65-35，較佳為40:60或36:64。本發(fā)明將由下列實施例做進一步的說明，但實際發(fā)明范圍并不受限于該用于所示的實施例。實施例1:建構包含E2次單位重組基因的質(zhì)粒Subgroup2.1病毒E1E2TM基因的放大首先使用逆轉錄聚合酶superscriptIIreversetranscriptase(Invitrogen，CA，USA)進行逆轉錄聚合酶連鎖反應，以兩個E1-E2基因專一性的引物(如表1)，從TD/96/TWN型豬瘟病毒基因體放大El-E2基因序列2354-3466bp(SEQIDNO:2)，其中該核苷酸序列包含部分El基因的N端60個核苷酸序列及E2基因的C端至TM區(qū)域(E1E2TM)1026核苷酸，共1086個核苷酸。接著第二次逆轉錄聚合酶連鎖反應則以第一次反應產(chǎn)物，與反向引物(5'-TTGAGCTCACCATGTTGAGAGGACAGGT-3')(SEQIDNO:5)逆轉錄成cDNA，最后再以聚合酶連鎖反應放大產(chǎn)物量，其條件為以聚合酶(Invitrogen，CA，USA)先進行在94°C變性(denaturation)30秒，55。C結合30秒，再于72。C下延長60秒，并進行30次循環(huán)。表1:逆轉錄聚合酶連鎖反應引物<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>E1E2TM基因的選殖于pBp質(zhì)粒中pBp質(zhì)粒是由中央研究院分子生物研究所趙裕展博士構筑與提供，含兩段BmNPV序列(737-2395bp及127001-128413bp)作為與病毒基因體重組的同質(zhì)區(qū)。E1E2TM基因(SEQIDNO:2)放大后使用Sacl與Xbal酵素(Invitrogen，USA)切割，于37。C作用2小時，且純化的pBp質(zhì)粒10iig亦用Sacl與Xbal酵素切割后，將E1E2TM基因與質(zhì)?；旌希⒂肈NA連接酶連結后以大腸桿菌(E.coli)選殖及增殖成為重組質(zhì)粒pBpE2-his(圖1)。如圖l所示，重組質(zhì)粒pBpE2-his已選殖有病毒的基因體序列737-2395bp及127001-128413bp做為同質(zhì)重組區(qū)，而127001-128413bp中含有完整的polyhedrin啟動子用于控制mRNA的轉錄。另于E1E2TM的3'端含有六個組氨酸(Histidine)作為表現(xiàn)蛋白抗體辨識標記。實施例2:同質(zhì)重組反應(Homologousrecombination)將選殖完成的質(zhì)粒pBpE2-his5iig，與桿狀病毒的半純化基因體50iig使用200ill商品化的Liposome(Invitrogen，USA)混合后，加入1ml的不含血清成份的TC-100培養(yǎng)液，并加入生長于30mm培養(yǎng)盤的單層家蠶細胞(BmN)使其共同轉染(Transfection)進入細胞中，并于細胞內(nèi)自然發(fā)生重組反應。約4-7天后可用抗-組氨酸單株抗體(Invitrogen，USA)或抗_E2單株抗體(WH303,VeterinaryLaboratoryAgency,UK)稀釋200倍后染色篩選出具表現(xiàn)能力的病毒斑，病毒再經(jīng)連續(xù)10倍稀釋并感染細胞三次，經(jīng)單株化選殖(subclone)后大量增殖決定力價，并將力價最高的病毒做為種病毒株。實施例3:以家蠶為蛋白產(chǎn)制平臺選殖完成的重組桿狀病毒可感染家蠶并表現(xiàn)E2蛋白，蠶種為由原種(0J03X0J04)雜交的二品種，其原種保留于行政院農(nóng)委會苗栗區(qū)農(nóng)業(yè)改良場，并以二品種蠶卵供應飼養(yǎng)使用。一般家蠶飼養(yǎng)至第五齡約第23天時，可于第三背孔處注射101的病毒液(107°TCID5。/ml)，感染后約3-5天家蠶呈現(xiàn)發(fā)病時可收集體液，并檢測E2蛋白的濃度。每只家蠶約可抽取0.3-0.5ml的體液，其體液以西方墨點法分析抗原濃度。取20iU的體液，使用4-12%SDS-PAGEgradientgel電泳分析，然后將蛋白轉印至硝化纖維膜(nitrocellulosemembrane)上，再以5%無脂乳粉填塞(blocking)后，將轉印的硝化纖維膜于PBST溶液中含5%無脂乳粉加入201的單株抗體作用一小時后，以山羊抗鼠IgG呈色。表現(xiàn)的E2蛋白不但可用抗組氨酸抗體辨識與定量(圖2)，也可用兩種抗E2抗體(WH303或FC09)辨識(圖3)，其中WH303抗體為荷蘭開發(fā)并已商品化的抗E2單株抗體(VeterinaryLaboratoryAgency,UK)，而FC09為發(fā)明人自行開發(fā)的抗E2單株抗體，其特征為可辨認基因亞型2.1病毒的E2蛋白而無法辨認基因亞型1.1病毒的E2蛋白。如圖2所示，道1至道8分別為8只蠶體體液以抗組氨酸抗體辨識的結果，道9、道10與道ll則為標準蛋白質(zhì)含量的標示，其分別代表50ng，200ng，400ng。在圖上約40-55kDa位置可看到道1至道8均有大小相同的明顯的帶狀，顯示每只家蠶的表現(xiàn)量相當穩(wěn)定，且根據(jù)標準蛋白質(zhì)含量的推算，每P1的家蠶體液中含有約1.2iig的E2蛋白。如圖3所示，抗E2專一性單株抗體WH303可檢測出蛋白在家蠶體液中自動形成雙體(95KD)的結構(使用非還原態(tài)的膠體)，而抗組氨酸抗體于可檢測出表現(xiàn)E2蛋白的單體(使用還原態(tài)的膠體)，其中道1至道5為E2蛋白兩倍連續(xù)稀釋后的結果(道l為l:1，道2為1:2，道3為1:4，道4為1:8，道5為l:16)。〃+〃號表示E2蛋白純化后定量為136.832ng/iU的濃度的結果。根據(jù)圖3的結果，發(fā)現(xiàn)家蠶E2蛋白濃度稀釋至介于4倍與8倍時，與標準E2蛋白濃度相當，推估家蠶E2蛋白濃度約等于6倍的標準E2蛋白濃度(0.136mg/ml)，即0.8mg/ml。此制程產(chǎn)生的抗原濃度與美國發(fā)明專利第6，919，085號(Kretzdornetal.，2005)培養(yǎng)方法相比，高達50倍以上，且可降低每劑量抗原成本至0.1元臺幣以內(nèi)。實施例4:豬瘟疫苗的制備與其功效評估由實施例3所取得的60iig重組E2蛋白，包含El的20個3'端氨基酸序列及E2的5'端至TM區(qū)域342個氨基酸(SEQIDNO:1)，與多種不同油性佐齊U，包括進口或自我調(diào)制者混合制成多種不同組合配方的豬瘟疫苗，并使用豬只做功效的直接評估。其中進口佐劑采用ISA206，ISA25，ISA1113三種，皆由法國SEPPIC廠購得；而TW-W/0/W及TW-W/0是自我調(diào)配而成含Marcol52(EPPIC，Sydney,Australia)及界面活性劑(Montanox80)(EssoPetroleumCo.Ltd)。自我調(diào)制的配方TW-W/O/W含抗原:油性佐劑=40:60，TW-W/0含抗原油性佐劑=36:64，皆經(jīng)用高壓均質(zhì)機以20000psi乳化調(diào)制。因此免疫后只產(chǎn)生抗E2抗體，可用于區(qū)別野外病毒感染或使用LPC疫苗免疫者產(chǎn)生抗全病毒抗體，例如抗E0及C蛋白抗體。使用以上的進口或自制佐劑及60iig的抗原，在豬只4-6周齡時由肌肉注射兩劑量(兩劑量相隔兩周)，并從注射第一劑疫苗開始采血進行抗體稀釋倍率測驗(圖4)。如圖4所示，自第二劑注射后兩周(p2-2w)即可引起不同程度的免疫反應，且使用自我研發(fā)的佐劑(TW-W/0)疫苗與使用ISA25的佐劑疫苗，產(chǎn)生的中和抗體可維持到免疫后三個月以上，且其稀釋倍率可維持在^IOO倍以上。為了進一步確認自我研發(fā)的佐劑(TW-W/0)疫苗的抗原所需濃度，使用不同劑量抗原0-120iig與TW-W/0佐劑制成疫苗，以同樣免疫方法檢測抗體功效(圖5)。如圖5所示，每劑含30-120iig可引起相似的抗體反應程度且無顯著差異，證明每劑量含30iigE2抗原量以上是足夠且合理的濃度。通常本領域技術人員將可在不背離本發(fā)明精神的下，根據(jù)實施例進行改變和修改。要注意的是，本發(fā)明并不受限于說明書中實施例所揭露的范圍，而涵蓋于其它根據(jù)申請范圍內(nèi)揭露的所有變化的形式。序列表〈110〉黃金城〈120〉一種豬瘟病毒E2次單位疫苗及其制備〈130〉NVR0001TW〈160>5〈170>PatentInversion3.3〈210>1〈211>362〈212>PRT〈213>swinefevervirus;subgroup2.1〈400>1LeuArgGlyGinValValGinGlylielieTrpLeuLeuLeuValThr51015GlyAlaGinGlyArgLeuSerCysLysGluAspHisArgTyrAlalie202530SerSerThrAsnGlulieGlyProLeuGlyAlaGluGlyLeuThrThr354045ThrTrpLysGluTyrAsnHisGlyLeuGinLeuAspAspGlyThrVal505560ArgAlalieCyslieAlaGlySerPheLysValThrAlaLeuAsnVal65707580ValSerArgArgTyrLeuAlaSerLeuHisLysArgAlaLeuProThr859095SerValThrPheGluLeuLeuPheAspGlyThrSerProAlalieGlu100105110GluMetGlyAspAspPheGlyPheGlyLeuCysProPheAspThrThr115120125ProValValLysGlyLysTyrAsnThrThrLeuLeuAsnGlySerAla130135140PheTyrLeuValCysProlieGlyTrpThrGlyVallieGluCysThr145150155160AlaValSerProThrThrLeuArgThrGluValValLysThrPheLys165170175ArgGluLysProPheProHisArgValAspCysValThrThrlieVal180185190GluLysGluAspLeuPheTyrCysLysLeuGlyGlyAsnTrpThrCys195200205ValLysGlyAsnProValThrTyrThrGlyGlyGinValArgGinCys210215220ArgTrpCysGlyPheAspPheLysGluProAspGlyLeuProHisTyr225230235240ProlieGlyLysCyslieLeuThrAsnGluThrGlyTyrArgValVal245250255AspSerProAspCysAsnArgAspGlyValVallieSerThrGluGly9260265270GluHisGluCysLeulieGlyAsnThrThrValLysValHisAlaLeu275280285AspGlyArgLeuAlaProMetProCysArgProLysGlulieValSer290295300SerAlaGlyProValArgLysThrSerCysThrPheAsnTyrThrLys305310315320ThrLeuArgAsnLysTyrTyrGluProArgAspSerTyrPheGinGin325330335TyrMetLeuLysGlyGluTyrGinTyrTrpPheAspLeuAspValThr340345350AspHisHis,ThrAspTyrPheAlaGluPhe355360〈210>2〈211>1086〈212>DNA〈213>swinefevervirussubgroup2.1〈400>1ttg卿gg3CaggttgtgcaaggcateatatggctgttgctggtgactggggC3C朋ggg60cggttgtcctgt朋gg朋g3ccacaggtatgcgatetcatC33CC朋tg3gatagggccg120cteggggctgaaggtctcaccaccacctggaccatggtttgcagctggat180gacgggactgtcagggctatttgcattgcagggtccttta33gtC3C3gCactcaatgtg240gtt￡lgt￡lgg￡lggtacctggcatcattecacEl卿gggCtttgcccacttcagtgacattt300gaactcctatttgatgggaccagcccagca3ttg3gg卿tggg卿tg3ctttggtttt360gggctgtgcccttttgacacgactcctgtggtC3朋ggg3cactttatte420aacggcagcgcattctetctagtctgcccaEltElgggtggElcgggtgtcatagagtgcacg480gcagteagccccacaaccttgtggtg3卿ccttcaagag3g3g朋gCCt540ttcccgcacagagtggattgcgtgaccact朋g朋g3CCtgttctactgc600朋gttggggggc朋ttggacatgtgtg朋3ggcaacccggtgacctacacgggaggg固660gteagacaatgC鄉(xiāng)tggtgtggttttgacttc朋ggagcctgatgggctccc3cactec720cccataggcaagtgcatctt3cgggttecagggtegtgg3ttccccagac780tgC33C3g3gatggcgtcgtcatcagcactg朋gg3g朋Catgagtgcttgattggc朋c840actactgtcaaggtgcacgc￡lttgg￡ltgg￡lagactggcccctatgccgtgC3g3CCC3朋■gaaatcgtctctagcgcgggacctgteaggaaaacttcctgcactttcaa960accctaagaaacaagtactatgagcccagggacagctatttccagcaatatatgcttaag1020ggcgagtaccaatactggtttgatctggacgtgactgaccaccacacagactacttcgcc1080gaattt1086〈210>3〈211>28〈212〉DNA〈213〉人工合成〈220〉〈223〉引物〈400>3ttgagctcaccatgttgagaggacaggt〈210>4〈211>49〈212>DNA〈213〉人工合成〈220〉〈223〉引物〈400>4attctagattagtgatggtgatggtgatgaaattcggcgaagtagtctg<210>5〈211>28〈212>DNA〈213〉人工合成<220>〈223〉引物〈400>5ttgagctcaccatgttgagaggacaggt權利要求一種制備造豬瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括a)選殖一重組豬瘟病毒E2基因于一適當載體中；b)以該帶有豬瘟病毒E2基因的載體與一家蠶桿狀病毒(Baculovirus；BmNPV)的基因體共同轉染家蠶細胞(BmN)，使其自然發(fā)生基因重組反應而得到帶有豬瘟病毒E2基因的重組家蠶桿狀病毒；c)篩選力價最高的重組桿狀病毒株為種病毒株；d)使用該種病毒株感染家蠶；e)養(yǎng)殖被感染的家蠶一段適當?shù)臅r間讓病毒進行復制，以產(chǎn)生出重組桿狀病毒并表現(xiàn)豬瘟病毒E2蛋白于體液中；f)搜集被種病毒株感染的家蠶體液而得到重組豬瘟病毒E2蛋白，可作為豬瘟疫苗的抗原。2.如權利要求l的方法，其中該豬瘟病毒為亞群組2.1(subgroup2.1)基因型病毒株。3.如權利要求1的方法，其中該豬瘟病毒為TD/96/TWN株。4.如權利要求l的方法，其中該重組豬瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列為包含包含豬瘟病毒外鞘蛋白中El的20個C端氨基酸序列，及E2的342個N端至TM區(qū)域的氨基酸序列。5.如權利要求1的方法，其中該重組豬瘟病毒E2蛋白具有如序列編號1的氨基酸序列。6.如權利要求l的方法，其中該重組豬瘟病毒E2蛋白為具有與豬瘟病毒基因型2.1的E2蛋白的氨基酸序列90%以上的相似度。7.如權利要求l的方法，其中該重組豬瘟病毒E2蛋白為具有與豬瘟病毒基因型2.1的E2蛋白的氨基酸序列96%以上的相似度。8.—種用于預防或是控制豬瘟病毒感染的豬瘟疫苗，其中該豬瘟疫苗包括如權利要求1至7中任一項的方法所制備的重組豬瘟病毒抗原蛋白，與一可接受的佐劑。9.如權利要求8的豬瘟疫苗，其中該佐劑為一種油性佐劑。10.如權利要求9的豬瘟疫苗，其中該重組豬瘟病毒E2次單位抗原與油性佐劑混和的比例為35-65:65-35。11.如權利要求10的豬瘟疫苗，其中該重組豬瘟病毒E2次單位抗原與油性佐劑混和的比例為40:60。12.如權利要求10的豬瘟疫苗，其中該重組豬瘟病毒E2次單位抗原與油性佐劑混和的比例為36:64。全文摘要本發(fā)明是使用家蠶(Silkworm)是統(tǒng)平臺量產(chǎn)豬瘟病毒(classicalswinefevervirus)基因亞型2.1(subgroup2.1)的重組E2蛋白。本發(fā)明亦提供一種包含上述重組蛋白的次單位疫苗，可用以提高豬只抵抗豬瘟病毒感染的能力。文檔編號C12N15/40GK101736017SQ20081017823公開日2010年6月16日申請日期2008年11月17日優(yōu)先權日2008年11月17日發(fā)明者吳登楨,廖久熏,林碧秀,林育如,趙裕展,鄧明中,黃金城申請人:黃金城