專利名稱：：癌癥早診和轉移、復發(fā)(DLK-1和RhoGDI2)基因檢測試劑盒和相關檢測方法與應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬基因診斷
技術領域：
，具體涉及癌癥的早期診斷和侵襲轉移的早期檢測，以及治療后轉移復發(fā)的早期預測的一種綜合基因診斷技術和方法。
背景技術：
：根據(jù)我國權威機構提供的資料，我國每年癌癥新增人數(shù)160萬，患者人數(shù)600萬，到2020年這一數(shù)字將翻一番。男性癌癥發(fā)生部位以肺、肝、胃依次排列、女性是乳腺癌、子宮頸癌、卵巢癌依次排列，以上幾種癌癥己占總癌癥病例一半以上。癌癥從發(fā)病到治療后生存期間，以肝癌為例，突破五年生存期都有一定的難度，特別是轉移復發(fā)的病患，治療效果不理想，這主要與癌癥的發(fā)病機制有關。癌癥是一種多基因失衡的分子病理生理演變過程，由致癌基因與抑癌基因失得能，及癌癥轉移基因與癌癥轉移抑制基因的失得能失控而致。要做到早期預防，早期診斷及早期治療，就要從以上癌癥多基因失衡時做出預防、診斷、治療等干預方法。目前醫(yī)學影像學的2cm以下的腫塊屬于早期癌癥這一界限科學性不夠嚴謹，從細胞學的角度，lcm腫塊約有1億個腫瘤細胞，2cm的腫塊其三維空間的細胞疊加數(shù)遠不止2億個腫瘤細胞。事實上，從單克隆癌細胞到2cm以下的腫塊可能是相當長的病理過程，可能是一年或兩年，或更長的病理演變過程。在這個病理演變過程中，難以證實早先形成癌細胞克隆腫塊是唯一的癌塊，可能在最早形成克隆腫塊的同時，癌細胞通過不同的途徑遷移到其它部位克隆生長。這在臨床上已得到證實，一旦切除腫塊后，其他地方復發(fā)或其它多發(fā)的腫塊先后形成或轉移。因此，依照傳統(tǒng)的影像醫(yī)學和其它生化指數(shù)的診斷認定的"早期診斷"這一概念值得認真討論，在臨床上以2cm以下的腫塊大小來界分早期與否，不夠嚴謹，這是導致癌癥死亡率不降的真正理由。隨著分子生物學3技術的日益完善，從基因水平做到早期診斷和侵襲轉移早期檢測，以及治療后及早檢測轉移復發(fā)狀況已經(jīng)成為可能。只有做到這一點，才能扭轉人們認為"抗癌大戰(zhàn)失敗"的觀點，才能徹底根治癌癥惡疾?，F(xiàn)有的癌癥診斷試劑盒多采用蛋白標記物的抗原抗體檢測方法(癌胚抗原、糖類抗原等)，臨床上檢測一種特異基因的方法未見報道，用核酸原位雜交方法檢測目的基因工作，都應用在科學研究中。使用核酸原位雜交方法能在癌變前期和癌細胞形成之前，就能做出診斷，并預測癌癥的演變過程，能在真正的早期做出診斷，比醫(yī)學影像學方法、病理學診斷、蛋白標記物檢測都要早期。本發(fā)明技術優(yōu)勢在于多基因檢測方法,來檢測癌癥的發(fā)生和轉移復發(fā)狀況。已有許多文獻報道，人類印跡基因DLK1是致癌基因。T.Altenberger等用高通量基因芯片技術發(fā)現(xiàn)當患有腦垂體癌和神經(jīng)膠質瘤時，DLK1基因表達增高；也有學者報道用同樣技術發(fā)現(xiàn)DLK1在肺小細胞癌，乳頭狀甲狀腺癌，卵巢癌及其它腺癌中有過量表達現(xiàn)象。上海交通大學醫(yī)學院附屬瑞金醫(yī)院的韓澤廣博士領導的研究小組，用RT-PCR方法在82例原發(fā)性肝癌樣本的檢測中發(fā)現(xiàn)，73.2%肝癌樣本中有DLK1基因的過量表達，而在正常肝臟中卻不表達。動物實驗標明，若降低DLK1基因在肝癌細胞中的表達水平，肝癌細胞發(fā)展為腫瘤的可能性大大降低，甚至消失。有趣的是，DLK1基因在胎兒時期胚胎肝臟中頻頻出現(xiàn)，同時在肝臟特殊的干祖細胞中表達。因此，有人預測DLK1基因在癌癥發(fā)生中扮演重要角色，是致癌基因，而且有廣譜性，在大多數(shù)癌癥演變過程中都可以見到DLK1基因的身影。RhoGDI2基因己被公認為腫瘤轉移抑制基因，我們在研究中證實RhoGDI2基因與癌癥轉移密切相關，而且具有廣譜性。我們檢測了近800例各種類型癌癥患者(大部分已轉移)血液標本，近800例正常對照組人群，經(jīng)統(tǒng)計學分析，癌癥患者體內RhoGDI2基因表達量為8%左右，正常人群表達量平均為50%，病例組中有600多例該基因是零表達。同時檢測兩個家族性癌癥好發(fā)家屬的直系親屬，該基因的表達量比正常人表達量都低。本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測癌癥發(fā)生和病理演變過程，同時檢測兩組基因可以早期觀察到癌變出現(xiàn)以及癌細胞侵潤轉移動態(tài)過程，同時可檢測癌癥治療后的轉移復發(fā)狀況。本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標志物，以及影像醫(yī)學檢査有顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上(癌變前期或癌細胞增殖)檢測基因異常表達(DLK1和RhoGDI2基因)，在影像醫(yī)學檢查未發(fā)現(xiàn)占位性癌病灶之前，癌癥生化指標未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上兩組基因表達異常的信息采集，給臨床癌癥病患一個真正的早期診斷和轉移侵入以及治療后轉移復發(fā)及早預測。這樣才有可能實施癌癥的早期診斷，早期預防，早期治療，有可能從源頭上徹底根治癌癥惡疾。針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明根據(jù)DLK-l基因和RhoGDI2基因的特點，提供一種癌癥早診和轉移復發(fā)預測的檢測試劑盒以及相關基因的檢測方法，同時用二種基因探針來檢測癌癥的發(fā)生和轉移復發(fā)狀況，從基因水平上在癌變前期或癌細胞增殖前檢測有關基因的異常表達，在未形成腫瘤之前，更早做到有關基因表達異常的信息采集。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的通過以下技術方案來實現(xiàn)本發(fā)明提供一種癌癥早診和轉移復發(fā)基因預測試劑盒，包括雜交探針，標記物，所述的雜交探針由DLK-1基因和RhoGDI2基因組成。上述DLK-1基因具有序列表中SEQIDNO:1所示的序列，RhoGDI2基因具有序列表中SEQIDNO:2所示的序列。其中DLK-1基因長度為1547bp，RhoGDI2基因長度為605bp，位于染色體12p:3位點上。所述試劑盒中的標記物選自放射性物質、化學發(fā)光或顯色物質、生物素、金屬鱟、酶及納米材料。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的標記核酸探針為地高辛標記的核酸探針。所述的試劑盒還包括雜交液和顯色劑。本發(fā)明還一種癌癥早診和轉移復發(fā)相關基因的核酸原位雜交檢測方法，包括以下步驟(1)在探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復合體的條件下，將待測試樣中的RNA與雜交探針接觸，形成雜交復合體；和(2)檢測所述雜交復合體。所述形成穩(wěn)定雜交復合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16—24小時。所述檢測底物是人體血液標本的白細胞和癌變組織細胞。所述血液標本和組織細胞來自癌癥病人和可疑患者。所述的癌癥為宮頸癌、白血病、淋巴瘤、胃腸道癌、肝癌及腺癌。其中優(yōu)選各類腺癌，更優(yōu)選肝癌，最優(yōu)選宮頸癌、白血病、淋巴瘤和胃腸道癌。核酸原位雜交的具體操作步驟是標本的處理，預雜交，雜交，免疫組化染色，鏡下進行定量分析，結果報告(具體見試劑盒說明書)。雜交的具體步驟包括1).將待測標本放入反應槽中2).儀器自動棄去液體，自動加消化液3).儀器自動棄去液體，自動后固定4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C)5).儀器自動棄去液體，自動清洗6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C)7).儀器自動棄去液體，自動清洗8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色10).取出封片鏡檢DLK-1基因是致癌基因，如果形成的雜交復合體高于正常對照，就表示為癌癥早期或癌癥易感性；RhoGDI2基因是癌癥轉移抑制基因，正常對照為健康人的RhoGDI2基因表達量的40-50%，該指標低于20%是表達降低，零與不表達，降低或不表達表明癌癥己轉移。正常的預防醫(yī)學檢測表明，受檢人一旦患上癌癥就有轉移的風險。本發(fā)明采用原位雜交技術，它的原理和具體操作如下本發(fā)明試劑原理是6將特異性的cDNA片段插入含有相當?shù)腞NA聚合酶啟動子的載體，通過選用不同的RNA聚合酶，控制RNA的轉錄方向，從而得到與mRNA同序列的同義RNA探針和與mRNA互補的反義RNA探針，用反義RNA探針和被檢測人體白細胞的待測mRNA進行原位雜交，作為反義RNA探針的陰性對照，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，半定量判斷目的基因的表達量。本發(fā)明所使用的RNA原位核酸雜交(RNAnucleicacidhybridizationinsitu)是指運用cRNA或寡核苷酸等探針檢測細胞和組織內RNA表達的一種原位雜交技術。其基本原理是:在細胞或組織結構保持不變的條件下,用標記的已知的RNA核苷酸片段，按核酸雜交中堿基配對原則,與待測細胞或組織中相應的基因片段相結合(雜交),所形成的雜交體(Hybrids)經(jīng)顯色反應后在光學顯微鏡或電子顯微鏡下觀察其細胞內相應的mRNA，rRNA和tRNA分子。本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明提供的試劑盒和基因檢測方法，可觀察早期癌變及癌細胞侵襲和轉移過程，同時可檢測癌癥治療后的轉移復發(fā)情況，與臨床其它檢測癌癥相關蛋白和影像醫(yī)學檢查相比，可在基因水平上檢測基因異常表達。在影像醫(yī)學中未發(fā)現(xiàn)腫塊或占位之前，也即未形成腫瘤之前，能及早做到以上有關基因表達異常的信息采集，給臨床腫瘤病人一個真正的早診，做到轉移侵襲和治療后轉移復發(fā)的早期預測，這樣有可能從源頭上徹底根治癌癥這一惡性疾病。與其他癌癥檢測試劑盒相比，二組基因同時檢測可動態(tài)觀察癌癥變化全過程，可更有效地檢測癌變動態(tài)。本發(fā)明的癌癥早期和轉移、復發(fā)診斷試劑盒的臨床價值和創(chuàng)新點在于能在基因水平，癌變前期或癌變細胞中檢測與腦癌、宮頸癌、白血病、淋巴瘤、胃腸道癌、肝癌及各類腺癌密切相關的DLK-1基因和RhoGDI2基因的表達量。早于蛋白標記物產(chǎn)生以前，當然更早于腫瘤形成以前，就能檢測DLK-1基因和RhoGDI2基因變化信息，做到真正意義上的早期診斷。同時，可檢測癌癥的轉移、復發(fā)情況。圖1是本發(fā)明實施例中肝癌癥病人DLK-1過量表達圖片。。圖2是本發(fā)明實施例中肝癌癥病人RhoGDI2表達降低圖片。圖3是本發(fā)明實施例中正常人RhoGDI2表達圖片。圖4是本發(fā)明實施例中正常人DLK-1表達圖。具體實施例方式本發(fā)明的方法可從以下具體實施方式了解得更清楚。然而應理解以下具體實施例雖然表明了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但只是闡述性的，因為本領域技術人員明白，依據(jù)這些實施例的詳細描述所作出的各種變化和修改都在本發(fā)明的構思和范圍內。實施例1癌癥早診和轉移復發(fā)基因預測試劑盒的組成包含以DLK-1基因和RhoGDI2基因為檢測的目的基因設計的雜交探針、標記物、使用說明書及以下試劑<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>使用濃度試劑的配制說明1).將10x緩沖液I用三蒸水按1:10稀釋成lx緩沖液I;2).將20x緩沖液II用三蒸水按1:10稀釋成2x緩沖液n;按l:100稀釋成0.2x緩沖液II;按1:200稀釋成0.1x緩沖液II;3).將iox緩沖液ni用三蒸水按i:io稀釋成ix緩沖液m;4).10x緩沖液IV用三蒸水按1:10稀釋成lx緩沖液IV(取1#,2#，3#各lOmL,加水至100mL既可)。實施例2應用核酸原位雜交檢測方法對癌癥早期DLK-l基因和RhoGDI2基因表達的實施過程1).取待測標本兩張；2).在玻璃缸里加入消化液(消化液IOOmL加lx緩沖液I99.9ml，即為使用濃度)50mL。37。C水浴預熱10min。放進16張玻片，37。C處理12min,再用lx緩沖液I洗5min;3).用0.2%的保護液(保護液lmL加lx緩沖液I，99ml即為使用濃度)洗10min,三蒸水洗5min(以上過程都在玻璃缸進行)，取出玻片，讓其自然干燥；4).將玻片放入保濕盒內，加預雜交液25pL/片(加在有細胞的地方)，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42i:恒溫水浴箱中3hr以上；5).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內，用70%，90%，95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；6).將玻片放入保濕盒內，一張加正義雜交液25pL/片，另一張加反義雜交液25pL/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42。C恒溫水浴箱中16-24hr;7).取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內在42'C恒溫水浴箱中用2x緩沖液n洗兩次,每次15min在42'C恒溫水浴箱中用0.2x緩沖液II洗一次，每次15min在42。C恒溫水浴箱中用O.lx緩沖液II洗兩次,每次15mim8).用lx緩沖液III洗30s，取出玻片,自然干燥；9).將玻片放入保濕盒內，加0.5%封閉液(lml封閉液加5mLlx緩沖液m)100nL/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min。(此步驟不需加蓋玻片)；10).取出玻片，用lx緩沖液III洗30s，自然干燥；11).將玻片放入保濕盒內，加X-AP抗體(取一管堿性磷酸酶抗體，向其中加入1.8mLlx緩沖液III)10(HiL/片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min。時間不能過長，否則會產(chǎn)生假陽性；(此步驟不需加蓋玻片)12).取出玻片，用lx緩沖液III洗3次，每次15min;13).用lx緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73.3^iL，顯色劑B157.5pL加到30mLlx緩沖液IV中,混勻)，室溫避光16hr到18hr以上；14).用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的lx緩沖液I混勻)封片鏡檢。本發(fā)明的核酸原位雜交檢測方法將目的基因用地高辛標記，成為RNA核酸探針，將探針與人體白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細胞數(shù)，判斷目的基因的表實施例3肝癌病人10名，宮頸癌病人6名、白血病10名、淋巴瘤6名和胃腸道癌10名及各類腺癌8名；正常對照組10名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細胞)做原位雜交。結果表示，所有癌癥患者DLK-1基因有過度表達，細胞染色；期中臨床診斷轉移的病人30例RhoGDI2基因表達降低，10例病人RhoGDI2基因不表達，細胞無染色。具體結果見圖1中肝癌癥病人DLK-1過量表達圖片，圖2中肝癌癥病人RhoGDI2表達降低圖片，圖3中正常人RhoGDI2表達圖片，圖4中正常人DLK-1表達圖。序列表SEQUENCELISTING<110〉芮屈生物技術(上海)有限公司<120>癌癥早診和轉移、復發(fā)(DLK-1和RhoGDI2)基因檢測試劑盒和相關檢測方法與應用<130>/<150>200710171736.5<151>2007-11-30<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>1152<212>腿<213>Homosapiens<400>1atgaccgcgaccgaagccctcctgcgcgtcctcttgctcctgctggctttcggccacagc60acctatggggctgaatgcttcccggcctgcaacccccaaa■atggattctgcgaggatgac120aatgtttgcaggtgccagcctggctggcagggtcccctttgtgaccagtgcgtgacctct180cccggctgccttcacggactctgtggagsiacccgggcagtgc"ttgcaccgacggctgg240gacggggagctctgtgatagagatgUcgggcctgctcctcggccccctgtgccaacaac300gggacctgcgtgagcctggacgatggcctctatgaatgctcctgtgcccccgggtactcg360ggaei￡igg￡ictgccagaaaaaggacgggccctgtgtgatcasicggctccccctgccagcac420ggaggcacctgcgtggatgatgagggccgggcctcccatgcctcctgcctgtgcccccct480ggcttctcaggcaatttctgcgagatcgtggccaacagctgcacccccaacccatgcgag540aacgacggcgtctgcactgacatcgggggcgacttccgctgccggtgcccagccggcttc600atcgacaagacctgcagccgcccggtgaccaactgcgccagcagcccgtgccagaacggg660ggcacctgcctgcagcacacccaggtgagctacgagtgtctgtgcaagcccgagttcaca720ggtctcacctgtgtcaagaagcgcgcgctgagcccccagcaggtcacccgtctgcccaac780ggctatgggc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