專利名稱：除草劑的新靶標(biāo)和對(duì)所述的除草劑有抗性的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有arogenate脫氫酶活性的新酶，具體是植物arogenate脫氫 酶，還涉及編碼這些酶的基因。本發(fā)明的arogenate脫氫酶催化酪氨酸生物合成 代謝途徑的最后一步，由于這一點(diǎn)，構(gòu)成除草劑的潛在靶標(biāo)。因此，本發(fā)明還涉 及鑒定以這些酶為靶酶的除草劑化合物的方法，所述的除草劑化合物通過附著所 述的酶而防止酪氨酸的生物合成。本發(fā)明也涉及以參與酪氨酸生物合成途徑的酶 為靶酶，特別是以參與預(yù)苯酸轉(zhuǎn)變成L-酪氨酸的酶為靶酶，具體是以arogenate 脫氫酶為靶酶的除草劑化合物具有耐受性的轉(zhuǎn)基因植物。這些植物成為耐受性是 由于在植物組織中表達(dá)了預(yù)苯酸脫氫酶，此酶對(duì)所述的除草劑不敏感并使植物即 使在用所述除草劑化合物處理后仍能合成酪氨酸。
背景技術(shù)：
芳香族氨基酸的生物合成途徑桅了植物、細(xì)菌和真菌必需的代謝途徑。除了 生物合成酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸外，這個(gè)代謝途徑在產(chǎn)生許多次級(jí)芳香代謝 產(chǎn)物的過程中，包括諸如植物-微生物相互作用，結(jié)構(gòu)性生物高聚物如木質(zhì)素和軟 木脂生物合成、激素合成、或苯醌合成中都起著非常重要的作用。在具有此代謝 途徑的所有生物中，已鑒定到兩條預(yù)苯酸轉(zhuǎn)變成酪氨酸的途徑(圖1; Stenmark等， 1974).在大部分含有葉綠素的細(xì)菌， 一些微生物和大部分植物中，L-酪氨酸是通 過arogenate合成途徑合成的(Abou-Zeid等，1995; Byng等，1981; Co匿ly和 Conn 1986; Frazel和Jensen 1979; Gaines等，1982; Hall等，1982; Keller 等，1985; Mayer等，1985).在此途徑中，預(yù)苯酸通過一種特殊的轉(zhuǎn)氨酶預(yù)苯酸 轉(zhuǎn)氨酶(EC 2. 6. 1. 57)轉(zhuǎn)氨而形成arogermte，然后arogenate通過arogenate脫 氫酶(EC 1.3. 1.43;圖1 ADH)轉(zhuǎn)變成L-酪氨酸。以不同的方式，在生物體中如大 腸桿菌或酵母中，預(yù)苯酸起初是通過預(yù)苯酸脫氫酶(EC 1.3. 1.12， EC 1.3. 1.13)轉(zhuǎn)變成p-羥苯基-丙酮酸，然后p-羥苯基-丙酮酸再轉(zhuǎn)氨成為L(zhǎng)-酪氨酸(Lingens等， 1967)。由于其在植物的酪氨酸生物合成途徑中的作用，arogenate脫氫酶構(gòu)成了 新除草劑的一個(gè)潛在耙標(biāo)。
參此代謝途徑的其它酶也構(gòu)成除草劑的主要靶標(biāo)。例如，可提及的有參與預(yù) 苯酸合成途徑上游的5-炳烯醇-草莽酸3-磷酸合成酶(EPSPS)，它是所有除草劑草 甘膦的靶酶。還可提及的有參與P-羥苯基丙酮酸轉(zhuǎn)變成尿黑酸的P-羥苯基丙酮酸 雙加氧酶(HPPD)。 HPPD是除草劑新家族的靶酶，它的作用導(dǎo)致葉子漂白(Schulz 等，1993; Secorl994)。這些除草劑具體是異唑(EP 418 175， EP 470 856， EP 487 352， EP 527 036， EP 560 482， EP 682 659， US 5 424 276),特別是isoxaf lutole, 一種選擇玉米的除草劑;二酮腈(EP 496 630， EP 496 631)具體是2-氰-3-環(huán)丙基 -卜(2-S02CH3-4-CF3苯基)丙垸-1，3- 二酮 和 2-氰-3-環(huán)丙基 -1-(2-S02CH3-4， 2, 3-Cl2苯基)丙垸-1, 3-二酮;三酮類(EP 625 505， EP 625 508， EP 5，506，195)，特別是sulcotrione或中三酮，或其它的二氫化吡唑類。
以植物必需的代謝途徑中的酶為靶酶的除草劑的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，是它們對(duì)遠(yuǎn)親緣 性植物具有廣譜活性。然而，當(dāng)這些除草劑應(yīng)用于農(nóng)作物以除去不需要的植物或
"雜草"時(shí)，它們的主要缺點(diǎn)是也作用于種植物。。這個(gè)缺點(diǎn)可以通過種植對(duì)所述 除草劑有耐受性的植物而得到克服。這些植物通常通過遺傳工程獲得，即在它們 的基因組中引入編碼對(duì)所述除草劑有抗性的一種酶的基因，以此方式這些植物在 其組織中過量表達(dá)所述的酶。迄今為止，有三種主要運(yùn)用遺傳工程技術(shù)的策略得 到應(yīng)用以使植物對(duì)除草劑產(chǎn)生抗性。第一種包括通過用編碼一解毒酶的基因轉(zhuǎn)化 植物使之能解毒除草劑。此酶把除草劑或其活性代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成沒有毒性的降解 物，例如，對(duì)bromoxynil或是對(duì)basta有耐受性的酶(EP 242 236， EP 337 899)。 第二種策略包括用編碼經(jīng)某種方式突變而對(duì)除草劑或其活性代謝物不大敏感的靶 酶的基因轉(zhuǎn)化植物，例如，對(duì)草甘膦有耐受性的酶(EP 293 356, Padgette S. R. 等，J.Biol.Chem. ， 266， 33， 1991).第三種策略包括過量表達(dá)敏感的靶酶以至于 在植物體中產(chǎn)生大量的靶酶，如果可能的話產(chǎn)生遠(yuǎn)大于進(jìn)入植物中的除草劑的量。 采用此策略曾成功的得到了對(duì)HPPD抑制劑有耐受性的植物(WO 96/38567)，使得 即使其抑制物存在時(shí)也可能維持足量水平的功能性酶。
存在著分類學(xué)不同分級(jí)的兩種L-酪氨酸生物合成途徑，尤其是植物中還沒有 發(fā)現(xiàn)將預(yù)苯酸直接轉(zhuǎn)變成p-羥苯基丙酮酸的途徑，這些事實(shí)使得可能設(shè)想第四種 使植物耐受除草劑的策略。具體說，在使用以植物中的arogenate脫氫酶為靶酶
9的除草劑化合物時(shí)，有目的地用細(xì)菌或酵母預(yù)苯酸脫氫酶的編碼基因轉(zhuǎn)化植物， 將能使所述植物合成L-酪氨酸而產(chǎn)生耐受性，因此即使所述除草劑化合物能抑制 arogenate脫氫酶，所述植物仍對(duì)除草劑化合物有耐受性。因此這種新策略包括通 過走到用arogenate胱氫酶的酪氨酸生物合成天然代謝途徑的一個(gè)旁路，在植物 中有目的制造對(duì)除草劑的抗性，方法是人為地在這些植物中植入踟氨酸生物合成 中利用預(yù)苯酸脫氫酶一種新的代謝途徑。擁有此旁路的植物宜為農(nóng)業(yè)植物，特別 是雜草，將對(duì)所述除草劑化合物敏感。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明因此涉及編碼具有arogenat脫氫酶活性的酶的新分離的多聚核苷酸。 按照本發(fā)明，術(shù)語"多聚核苷酸"意指天然或人造的核苷酸序列，可以是DNA或 RNA類型，更好的是DNA類型，特別是雙鏈DNA。"有arogenate脫氫酶活性的酶" 這種表達(dá)方式意指此酶能將arogenate轉(zhuǎn)變成L-酪氨酸。Arogenate脫氫酶的活 性可以通過檢測(cè)arogenate底物量的減少，或是通過檢測(cè)酶反應(yīng)產(chǎn)物即L-酪氨酸 或輔因子NADPH的積累等方法進(jìn)行測(cè)量。具體講，可用實(shí)施例4所描述的方法檢 測(cè)arogenate脫氫酶活性。
按照本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案，編碼arogenate脫氫酶的多聚核苷酸包括 編碼選自序列身份號(hào)SEQ ID N0:3， SEQ ID N0:5， SEQ ID N0:7， SEQ ID N0:9， SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13的多肽序列的多聚核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知此
定義包括編碼相同的氨基酸序列的所有多聚核苷酸盡管有由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并 性可導(dǎo)致核苷酸序列不同，這些氨基酸序列由序列號(hào)SEQ ID N0:3， SEQ ID N0:5， SEQ ID N0:7， SEQ ID N0:9， SEQ ID NO: 11或SEQ ID NO: 13為代表。
本發(fā)明還包括編碼arogenate脫氫酶選擇性與上述多聚核苷酸之雜交的，或 組成探針的這些多聚核苷酸的分離的多聚核苷酸。按照本發(fā)明，"能選擇性雜交的 多聚核苷酸"含義是指該多聚核苷酸以本領(lǐng)域溶脹的方法(Sambrook等，1989，分
子克隆實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)，Nolan C.編，紐約冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社)，與上述多聚 核苷酸雜交或與其衍生的探針雜交，產(chǎn)生的信號(hào)水平比背景噪音要強(qiáng)得多。背景 噪音的產(chǎn)生可能與其它存在的多聚核苷酸，例如cDNA文庫中存在的其它c(diǎn)DNA雜 交有關(guān)。由于能選擇性雜交的多聚核苷酸與本發(fā)明上述序列號(hào)SEQ ID NO所定義
的多聚核苷酸或探針之間的相互作用而產(chǎn)生的信號(hào)水平通常要比與產(chǎn)生背景噪 音的其它DNA序列相互作用產(chǎn)生的強(qiáng)10倍，更好是100倍。此種相互作用的水平可以通過，例如，用諸如，等放射性元素標(biāo)記的上述多聚核苷酸或探針進(jìn)行測(cè)量。
選擇性雜交通?？捎梅浅?yán)格的培養(yǎng)條件(例如大約50°C-60°C 0.03MNaCl和 0.03M檸檬酸鈉)獲得。
本發(fā)明還包括編碼arogenate脫氫酶的分離的多聚核苷酸和上述多聚核苷酸 的同源物。按照本發(fā)明，術(shù)語"同源物"含義是與上述核苷酸序列相比有一處或 多處序列修飾的和編碼具有arogenate脫氫酶活性的酶的多聚核苷酸。這些修飾 可以是天然的或通過溶脹的突變技術(shù)導(dǎo)致加入，去除或置換本發(fā)明序列中的一個(gè) 或多個(gè)核苷酸人為獲得的。這些修飾決定了與上述序列的同源性程度。有利的是， 與上述序列相比同源性程度將至少為70%，優(yōu)選至少80。/。，更優(yōu)選至少90%。檢測(cè)
和鑒定核苷酸序列之間同源性的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。例如，可以采用 PILEUP或BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool; Altschul等，1993， J. Mol. Evol. 36:290-300; Altschul等,1990，丄Mol. Biol. 215:403-10;也可以見 http:〃www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)。
本發(fā)明還涉及上述多聚核苷酸的片段關(guān)。術(shù)語"片段"具體表示至少20個(gè)核 苷酸，至少50個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸片段。
按照本發(fā)明一項(xiàng)具體實(shí)施方案，本發(fā)明的多聚核苷酸由序列身份號(hào)SEQ ID NO:l， SEQ ID N0:2， SEQ ID N0:4， SEQ ID N0:6， SEQ ID N0:8， SEQ ID NO:IO 或SEQ ID NO: 12所代表。
本發(fā)明還涉及至少包括上述一條多聚核苷酸的諸多聚核苷酸。
所有的上述多聚核苷酸編碼arogenate脫氫酶。因此，本發(fā)明擴(kuò)充至所有編 碼arogenate脫氫酶的所有多聚核苷酸。
按照本發(fā)明的一具體實(shí)施方案，arogenate脫氫酶是一種酶，其多肽序列選 自序列身份號(hào)SEQ IDN0:3、 SEQIDN0:5、 SEQIDN0:7、 SEQIDN0:9、 SEQIDNO:ll 或SEQ ID NO: 13的序列，或這些序列的片段。術(shù)語"片段"含義指必需有生物活 性的片段，如arogenate脫氫酶中的具有與完整arogenate脫氫酶相同活性的片 段。
按照本發(fā)明的一具體實(shí)施方案，上述的多聚核苷酸和arogenate脫氫酶來源 于植物。更具體說，它們來源于擬南芥屬植物，優(yōu)選A^^i'朋s屬，或者來源于 尸icea，屬，優(yōu)選尸icea ^/s"ca屬植物。
按照本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案，上述的多聚核苷酸和arogenate脫氫酶來 源于細(xì)菌。更具體說，它們來源于^777ec力oc/s"s屬細(xì)菌。本發(fā)明還涉及含有功能上相互連接的在宿主中有功能的一個(gè)啟動(dòng)子， 一個(gè)編 碼本發(fā)明所定義的arogenate脫氫酶的多聚核苷酸以及一個(gè)在同一宿主中有功能 的終止子元件的嵌合基因。首先，此嵌合基因可以包含的各種不同的元件是調(diào)控 轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)成熟的元件，如啟動(dòng)子，編碼一信號(hào)肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，或 組成多聚腺苷酸信號(hào)的終止子元件；其次，可包含編碼一蛋白質(zhì)的多聚核苷酸。 "功能上相互連接"，含義是所述嵌合基因中的元件相互連接的方式使這些元素中 一個(gè)的作用是受到另一個(gè)的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子與一編碼序列功能上相連時(shí)它 就能影響所述編碼序列的表達(dá)，本發(fā)明嵌合基因的構(gòu)建以及其各種元件的裝配可 以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)，特別是Sambrook等，(1989，分子克隆實(shí) 驗(yàn)操作手冊(cè)，Nolan C.編，紐約冷泉港出版社)所描述的技術(shù)進(jìn)行。選擇組成該 嵌合基因的調(diào)控元件必須是能在宿主中發(fā)揮功能的，本領(lǐng)域技術(shù)人員有能力選擇 那些在某給定宿主生物中發(fā)揮功能的調(diào)控元件。術(shù)語"能發(fā)揮功能的"含義是能 在某給定的宿主中發(fā)揮作用。
本發(fā)明嵌合基因的啟動(dòng)子包括組成型或可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本發(fā)明的組成型啟 動(dòng)子是能誘導(dǎo)編碼序列在宿主的所有組織中表達(dá)的并在所述宿主生物的整個(gè)生命 周期中表達(dá)的啟動(dòng)子。這些啟動(dòng)子中的一些可以是組織特異性的，如持續(xù)地表達(dá) 該編碼序列，但僅是在宿主生物的特定組織中。組成型啟動(dòng)子可來源于任何類型 的生物。在可用于本發(fā)明的嵌合基因的組成型啟動(dòng)子中，例如，可提及的有細(xì)菌 啟動(dòng)子，如羧乙基精氨酸合成酶基因的啟動(dòng)子或胭脂堿合成酶基因的啟動(dòng)子，或 可提及的有病毒啟動(dòng)子，如花椰菜鑲嵌病毒的控制19S RNA或35S RNA轉(zhuǎn)錄的基 因的啟動(dòng)子(Odell等，1985， Nature, 313, 810-812)，或是木薯葉脈鑲嵌病毒的啟 動(dòng)子(專利申請(qǐng)TO 97/48819有所描述)。在來源于植物的啟動(dòng)子中，可提及的有 核酮糖二羧化酶/加氧酶(RuBisC0)的小亞基基因的啟動(dòng)子，專利申請(qǐng)EP 0 507 698 中所描述的組蛋白基因的啟動(dòng)子，或稻米肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子(US 5， 641， 876)。
按照本發(fā)明的另一特定實(shí)施方案，此嵌合基因包括一個(gè)可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子?？?誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是只有當(dāng)其自身被一種誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)時(shí)，才能起作用，即才能誘導(dǎo) 某編碼序列表達(dá)的啟動(dòng)子。這種誘導(dǎo)劑通常是一種在所述生物受到某種外部刺激 后可以在宿主生物體內(nèi)合成的物質(zhì)，這種外部刺激可能是，例如病原因子。這種 誘導(dǎo)劑也可以是一種對(duì)于宿主而言是外部的，但能穿透進(jìn)入宿主生物體內(nèi)的物質(zhì)。 有利地是，本發(fā)明所用的啟動(dòng)子在病原因子攻擊宿主生物后成為可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。 這些已知的啟動(dòng)子是專利申請(qǐng)F(tuán)R 99 03700所描述的植物0-甲基轉(zhuǎn)移酶II類(C0MT
12II)基因的啟動(dòng)子，擬南芥PR-1啟動(dòng)子(Lebel等，1998， Plant J. 16(2) :223-233)， 煙草倍半萜烯合成酶基因的EAS4啟動(dòng)子(Yin等，1997， Plant Physiol. 115(2): 437-451)，或是編碼3-羥基-3甲基-戊二酸輔酶A還原酶基因的啟動(dòng)子(Nelson 等，1994， Plant Mol. Biol. 25(3) :401-412)。
可用于本發(fā)明嵌合基因的終止子元件中，可提涉及的如編碼根瘤出桿菌胭脂 堿合成酶的基因的刀"終止子元件(Beven等，1983， Nucleic Acids Res. 11(2)， 369-385)，或者專利申請(qǐng)EP 0 633 317中所描述的組蛋白基因的終止子元件。
對(duì)于此嵌合基因另外包含一信號(hào)肽或一轉(zhuǎn)運(yùn)肽看來也是重要的，這使得能控 制和導(dǎo)向arogenate脫氫酶的產(chǎn)物運(yùn)送到宿主生物的某一部分，如細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞 膜，細(xì)質(zhì)質(zhì)的某特定腔室和植物中的某特定類型的細(xì)胞腔室，如葉綠體，或細(xì)胞 外基質(zhì)中。
轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是單體或是雙體。雙聚體轉(zhuǎn)運(yùn)肽可任選地用一間隔序列分開，例 如，它們以轉(zhuǎn)錄方向包括編碼位于質(zhì)體中一種酶的植物基因的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，編碼位于 質(zhì)體中一種酶的植物基因的成熟N-端部分的序列，以及編碼位于質(zhì)體中一種酶的 植物基因的第二轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列。例如，這些雙體轉(zhuǎn)運(yùn)肽在專利申請(qǐng)EP 0 508 909 中有所描述。
本發(fā)明所用信號(hào)肽可提及的包括，當(dāng)需將本發(fā)明的嵌合基因?qū)胫参锛?xì)胞或 植物中時(shí)，具體是Cornelissen等所描述的煙草PR-1 a基因的信號(hào)肽(1987， Nucleic Acid Res. 15,6799-6811),或當(dāng)需將本發(fā)明的嵌合基因?qū)虢湍钢袝r(shí)，為 Mat a 1因子前體的信號(hào)肽(Brake等，1985， In: Gething M.-丄(編)；蛋白運(yùn)輸 和分泌，第103-108頁，冷泉港出版社，紐約)。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明嵌合基因的載體。本發(fā)明的載體可用于轉(zhuǎn)化宿主生 物以及在該宿主生物中表達(dá)arogenate脫氫酶。此載體可以是質(zhì)粒、粘粒、噬菌 體或病毒?？傮w上，此載體的主要特點(diǎn)應(yīng)是能在宿主生物細(xì)胞中持續(xù)存活并能自 身復(fù)制，特別是由于存在復(fù)制起點(diǎn)而能表達(dá)arogenate脫氫酶。這種載體的選擇 和將其插入本發(fā)明嵌合基因中的技術(shù)在Sambrook等所編寫的書中(1989，分子克 隆實(shí)驗(yàn)操作手冊(cè)，Nolan C.編，紐約，冷泉港出版社)有廣泛的描述，且是本 領(lǐng)域技術(shù)人員所具有的一般知識(shí)的一部分。有利的是，本發(fā)明所使用的載體除了 含有本發(fā)明嵌合基因之外，還包括編碼選擇性標(biāo)記物的基因。此選擇性標(biāo)記物使 得可能選出受到有效轉(zhuǎn)化的宿主生物，如那些摻入了所述載體的生物。按照本發(fā) 明的一具體實(shí)施方案，受轉(zhuǎn)化的宿主生物是微生物，具體是酵母、細(xì)菌、真菌或病毒。根據(jù)另一項(xiàng)具體實(shí)施方案，此宿主生物是植物或植物細(xì)胞。在編碼可以使 用的選擇性標(biāo)記物的基因中，可提及的有抗生素抗性基因，如潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶
(Gritz等，1983， Gene 25:179-188)，但有對(duì)除草劑抗性基因，如對(duì)bialaphos 耐受的6,基因(White等，NAR 18:1062,1990)，對(duì)草甘膦耐受的EPSPS基因 (US5， 188， 642)或還有對(duì)異口惡唑耐受的HPPD基因(W0 96/38567)。還可提及的有 編碼容易鑒定的酶如GUS酶的基因，或編碼色素的基因，或編碼在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中調(diào) 控色素產(chǎn)量的酶的基因。這些選擇性標(biāo)記物基因具體是在專利申請(qǐng)WO 91/02071， W0 95/06128， W0 96/38567和W0 97/04103中有所描述。
本發(fā)明還涉及上述含有載體的已轉(zhuǎn)化過的宿主生物。術(shù)語"宿主生物"含義 是可引入本發(fā)明嵌合基因產(chǎn)生arogenate脫氫酶的任何低等或高等單細(xì)胞或多細(xì) 胞生物。它們具體是細(xì)菌如大腸桿菌；酵母菌特別是酵母菌屬，克魯維酵母屬或 畢赤屬酵母菌；真菌特別是貢霉菌桿狀病毒、或優(yōu)選植物細(xì)胞和植物。
按照本發(fā)明，術(shù)語"植物細(xì)胞"含義是任何從植物中獲得的和能形成非分化 組織如愈傷組織，分化組織如胚胎組織的細(xì)胞，植物的一部分，植物或種子。
按照本發(fā)明，術(shù)語"植物"的特定含義是任何有能力進(jìn)行光合作用的已分化 的多細(xì)胞生物，特別是單子葉植物或雙子葉植物。
術(shù)語"已轉(zhuǎn)化的宿主生物"含義是其基因組中摻入了本發(fā)明嵌合基因并隨后 在其組織中或其培養(yǎng)基中產(chǎn)生arogenate脫氫酶的宿主生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能 按照本發(fā)明采用許多已知的轉(zhuǎn)化方法中的一種來獲得此種宿主生物。
這些方法中的一種包括使待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞與本發(fā)明的載體和聚乙二醇接觸 (Chang and Cohen, 1979， Mol.Gen. Genet. 168(1) ， 111-115); Mercenier和Chassy， 1988， Biochimie 70(4)， 503-517).電穿孔是另外一種方法，它包括將待轉(zhuǎn)化的 細(xì)胞或組織和本發(fā)明的載體置于電場(chǎng)中(Andreason and Evans ， 1988 ， Biotechniques6(7) ，650-660 ;ShigekawaandDower ，1989 ， Aust. J. Biotechnol. 3(1) ， 56-62).另一種方法包括通過顯微注射方法把該載體直 接注射入宿主細(xì)胞或組織中(Gordon and Ruddle, 1985， Gene 33(2)， 121-136). 有利的是，可以使用"生物彈擊(biolistic)"方法。包括用其上吸附有本發(fā)明 載體的粒子轟擊細(xì)胞或組織(Bruce等，1989， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9697; Klein等，1992， Biotechnology 10(3) ， 286-291;美國(guó)專利 號(hào)4,945,050)。優(yōu)選的是，植物轉(zhuǎn)化將釆用農(nóng)桿菌屬的細(xì)菌來進(jìn)行，更為適宜的 是，可以通過用^//ffe/a"朋s農(nóng)桿菌(Knopf ， 1979， Subcell. Biochera. 6， 143-173;Shaw等，1983， Gene 23 (3) :315-330)或r力hc^e77es農(nóng)桿菌(Bevan和Chilton， 1982， Annu. Rev. Genet. 16:357—384 ; T印fer and Casse—Delbart ， 1987， Microbiol. Sci.4(l)，24-28)感染所述植物的細(xì)胞或組織.優(yōu)選的是，用農(nóng)桿菌 ^/歷e/sciey^進(jìn)行植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化可以參照Ishida等描述的方案(1996， Nat. Biotechnol. 14(6) ， 745-750)。
本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將能選擇恰當(dāng)?shù)淖鳛榇D(zhuǎn)化宿主生物性能的方法。 本發(fā)明因此也涉及制備arogenate脫氫酶的方法，包括在合適的培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的含有編碼以上定義的arogenate脫氫酶基因的宿主生物，通過離心 或過濾回收培養(yǎng)基中產(chǎn)生的arogenate脫氫酶，然后使它至少通過一個(gè)層析柱以 純化回收獲得的酶的步驟。這些抽提和純化步驟可以得到所有的或部分的 arogenate脫氫酶。優(yōu)選轉(zhuǎn)化的生物是微生物，特別是細(xì)菌、酵母、真菌或病毒。 本發(fā)明還包括鑒定以arogenate脫氫酶為靶酶的除草劑化合物的方法，其特 征如下
(a) 至少準(zhǔn)備有兩個(gè)樣品，每一個(gè)在溶液中含有等量的arogenate脫氫酶；
(b) 其中的一個(gè)樣品用化合物進(jìn)行處理；
(c) 測(cè)定所述的每一個(gè)樣品中的arogenate脫氫酶活性；
(d) 當(dāng)步驟(c)處理過的樣品檢測(cè)的酶活性明顯地比未處理過的樣品低時(shí)， 可認(rèn)定(b)步驟中所用的化合物是一種除草劑化合物。
(e) 在(d)步驟中所鑒定化合物的除草活性可以用所述化合物處理植物加 以驗(yàn)證。
按照本方法，arogenate脫氫酶活性可以通過任何能夠檢測(cè)arogenate底物 量的減少或能夠檢測(cè)該酶反應(yīng)產(chǎn)物，即L-酪氨酸或輔因子NADTO積累的方法予以 測(cè)量。具體講，arogenate脫氫酶活性的測(cè)量可以用實(shí)施例4中所描述的方法。此 外，本方法步驟(e)中驗(yàn)證的除草劑活性可能是致死性活性，導(dǎo)致處理過的植物死 亡，或是嚴(yán)重減緩處理過的植物的生長(zhǎng)率。
按照本發(fā)明，術(shù)語"化合物"含義是任何的化合物或化合物的混合物，包括 多肽和蛋白質(zhì)。按照本發(fā)明，術(shù)語"化合物的混合物"應(yīng)理解為至少兩種不同的 化合物，例如， 一種分子的立體異構(gòu)體或二面異構(gòu)體，從生物物質(zhì)(植物、植物組 織、細(xì)菌培養(yǎng)物、酵母培養(yǎng)物或真菌培養(yǎng)物液、昆蟲、動(dòng)物組織等)的抽提物中得 到的天然來源的混合物，或未純化的或完全的或部分純化的反應(yīng)混合物，或組合 化學(xué)技術(shù)得到的產(chǎn)物的混合物。按照本發(fā)明方法的一特定實(shí)施方案，所用的arogenate脫氫酶來自植物，優(yōu) 選來自擬南芥。
按照本發(fā)明方法的另一特定實(shí)施方案，所用的arogenate脫氫酶來自細(xì)菌， 優(yōu)選分"ec力。c"屬細(xì)菌。
更為適宜的是，本發(fā)明方法中所用的arogenate脫氫酶是本發(fā)明的酶，具體 是SEQ ID N0:3， SEQ ID N0:5， SEQ ID N0:7， SEQ ID N0:9， SEQ ID NO:11或 SEQ ID N0:13所代表的那些酶。
本發(fā)明還擴(kuò)展至用上面所提到的方法鑒定的除草劑化合物，特別是以 arogenate脫氫酶為靶酶的除草劑化合物，如那些能抑制此酶活性的除草劑。優(yōu)選 除草劑化合物不是通用的酶抑制劑。還優(yōu)選本發(fā)明的除草劑化合物不是已知的有 除草活性的化合物。
本發(fā)明也涉及含有作為活性物質(zhì)的本發(fā)明除草劑化合物最低有效量的農(nóng)用化 學(xué)組合物。
按照本發(fā)明，術(shù)語"農(nóng)用除草化學(xué)組合物"含義是能夠預(yù)防性或治療性應(yīng)用 于正在生長(zhǎng)的或必定會(huì)生長(zhǎng)的種植物區(qū)域的組合物，以防止不需要的植物或"種 子"在所述種植物區(qū)域發(fā)育生長(zhǎng)，無論它們處于何種發(fā)育狀態(tài)。本發(fā)明除草劑化 合物的有效量，相應(yīng)于能夠破壞或抑制不需要植物的生長(zhǎng)的化合物量。
本發(fā)明的農(nóng)用除草化學(xué)組合物包括本發(fā)明的除草劑化合物或其農(nóng)業(yè)上可接受 的一種鹽或此化合物的一種金屬或非金屬復(fù)合物，與農(nóng)業(yè)上可接受的固體或液體 運(yùn)載體或在農(nóng)業(yè)上也可接受的表面活性劑組合而成。特別是，可使用通常的惰性 運(yùn)載體和通常的表面活性劑。這些組合物不僅覆蓋了那些用合適的裝置，如噴灑 或撒粉裝置易于施用于待處理的植物或種子的組合物，而且覆蓋了可通過商業(yè)途 徑獲得的濃縮的組合物，這些組合物在用于農(nóng)作物之前必須先進(jìn)行稀釋。
本發(fā)明的除草劑組合物也包括許多其它成分，如保護(hù)性膠體、粘合劑、增稠 劑、觸變劑、穿透劑、穩(wěn)定劑或鰲合劑。更為普通的是，這些活性物質(zhì)可用常用 的配制技術(shù)與任何固體或液體添加劑相混合。
按照本發(fā)明，術(shù)語"運(yùn)載體"表示一種與活性物質(zhì)相混合后有利施用于植物 的天然或合成的、有機(jī)或無機(jī)物質(zhì)。此種運(yùn)載體因此通常是惰性的且必須是農(nóng)業(yè) 上可接受的。此種運(yùn)載體可以是固體(如粘土、天然或合成的硅酸鹽、硅土、樹脂、 蠟、固體肥料)或液體(如水、酒精、特別是丁醇)。
表面活性劑可以是一種乳化劑、分散劑或離子型或非離子型的潤(rùn)濕劑，或這些表面活性劑的混合物。例如，可提及的有聚丙烯酸鹽、木質(zhì)素磺酸鹽、苯酚磺 酸鹽或萘磺酸鹽、環(huán)氧乙烷與脂肪酒精或與脂肪酸或與脂肪胺的多聚冷凝物，苯 酚的替代物(特別是垸基酚或芳香酚)，琥珀磺酸鹽酯，?；撬嵫苌?特別是烷基 ?；撬?，己聚氧乙烯化的乙醇磷脂或苯酚磷脂，脂肪酸酯以及多羥基酯，和上述 含有硫酸鹽、磺酸鹽和磷酸鹽功能的化合物的衍生物。當(dāng)活性物質(zhì)和/或惰性運(yùn)載 體為非水溶性時(shí)和當(dāng)應(yīng)用的載體試劑是水時(shí)，通常必須有至少一種表面活性劑。
本發(fā)明還涉及把參與預(yù)苯酸轉(zhuǎn)變成L-酪氨酸的一個(gè)代謝步驟的酶作為靶酶 的，除草劑化合物有耐受性的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，它們包含了編碼預(yù)苯酸 脫氫酶的基因并在它們的組織中表達(dá)所述的酶。預(yù)苯酸脫氫酶是一種催化把預(yù)苯 酸變?yōu)镻-羥基苯丙酮酸反應(yīng)的酶。具有預(yù)苯酸脫氫酶活性的酶可以用任何能夠測(cè)
量預(yù)苯酸底物量減少，或測(cè)量該酶反應(yīng)產(chǎn)物即p-羥苯基丙酮酸或輔因子NADH或 NADra之一積累的方法加以鑒定。具體說，預(yù)苯酸脫氫酶活性的測(cè)量可以釆用實(shí)施 例4中所描述的方法。
按照本發(fā)明的一具體實(shí)施方案，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)以arogenate脫氫酶， 優(yōu)選本發(fā)明所述的arogenate脫氫酶為靶酶的除草劑化合物有耐受性。
按照本發(fā)明另一具體實(shí)施方案，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)以預(yù)苯酸氨基轉(zhuǎn)移酶 為靶酶的除草劑化合物有耐受性。
按照本發(fā)明的一特定實(shí)施方案，在本發(fā)明耐受性植物中所表達(dá)的編碼預(yù)苯酸 脫氫酶的基因是一種酵母基因。優(yōu)選它是編碼如Mannhaupt等(1989， Gene 85,303-311)所述的編碼釀酒酵母預(yù)苯酸脫氫酶的基因(accession No.NC001134) 為序列身份號(hào)SEQ ID N0:14所代表。
按照本發(fā)明的另一具體實(shí)施方案，在本發(fā)明耐受性植物中所表達(dá)的編碼預(yù)苯 酸脫氫酶基因是一種細(xì)菌基因。優(yōu)選從桿菌屬細(xì)菌得到的基因，特別是序列號(hào)SEQ ID NO: 16所代表的芽胞桿菌(accession No. M80245)的基因。優(yōu)選從大腸桿菌屬細(xì) 菌得到的基因，特別是Hudson等(1984， J. Mol. Biol. 180 (4) ， 1023-1051)所述的 由序列號(hào)SEQ ID NO: 18代表的大腸桿菌中得到的基因。優(yōu)選從^n^/n's屬細(xì)胞中， 特別是由序列號(hào)SEQ ID N0:20代表的A力erZu'co"菌種(accession No. 43343)中 得到的基因。
按照本發(fā)明的一項(xiàng)具體實(shí)施方案，在本發(fā)明耐受性植物中所表達(dá)的編碼預(yù)苯 酸脫氫酶的基因是一種真菌基因。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是通過用編碼預(yù)苯酸脫氫酶的基因作遺傳轉(zhuǎn)化而獲得的。優(yōu)選此基因是一個(gè)嵌合基因，包含功能上相互連接的至少一個(gè)在宿主體內(nèi)有 功能的啟動(dòng)子， 一個(gè)編碼預(yù)苯酸脫氫酶的多聚核苷酸和在同一宿主生物中有功能 的終止子元件。此基因通常被導(dǎo)入一個(gè)用上述轉(zhuǎn)化方法把所述基因?qū)胨鲋参?中的載體。
本發(fā)明也涉及產(chǎn)生對(duì)以參與預(yù)苯酸轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-酪氨酸的代謝途徑某一步驟的酶
為靶酶的除草劑有耐受性的植物的方法，其特征是用編碼預(yù)苯酸脫氫酶的基因以 可以在組織中表達(dá)的方式轉(zhuǎn)化所述的植物中。
按照本發(fā)明的一具體實(shí)施方案，現(xiàn)今的方法可用于能耐受以本發(fā)明所述的 arogenate脫氫酶為靶酶的除草化合物的植物產(chǎn)品中。
按照本發(fā)明的另一具體實(shí)施方案，現(xiàn)今的方法可用于能耐受以預(yù)苯酸氨基轉(zhuǎn) 移酶為耙酶的除草化合物的植物產(chǎn)品中。
因此現(xiàn)今的方法也包括能夠得到能耐受以arogenate脫氫酶為靶酶的除草劑
的植物的方法，其特征是將編碼預(yù)苯酸脫氫酶的基因用一種能讓此基因在植物組
織中表達(dá)的方法轉(zhuǎn)化所述的植物。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物，除編碼預(yù)苯酸脫氫酶的基因之外，還可至少包含另一 個(gè)含有編碼感興趣蛋白的多聚核苷酸的基因.在這些編碼感興趣蛋白質(zhì)的多聚核
苷酸中，可提到的有編碼對(duì)除草劑有抗性的酶的多聚核苷酸，例如編碼對(duì) bialaphos有耐受性的&r酶的多聚核苷酸(White等，NAR 18:1062, 1990)，編碼 對(duì)草甘膦有耐受性的EPSPS酶的多聚核苷酸(US 5,188,642; WO 97/04103),或編 碼對(duì)異口惡唑有耐受性的HPPD酶的多聚核苷酸(WO 96/38567)。還可提到的有編 碼殺蟲毒素的多聚核苷酸，例如，編碼飽w7^^ "w^7^ey7w、細(xì)胞毒素的多聚 核苷酸(例如，見國(guó)際專利申請(qǐng)WO 98/40490)。其它對(duì)疾病有抗性的多聚核苷酸 也可包含在這些植物中，例如編碼專利申請(qǐng)EP 0 531 498或美國(guó)專利5， 66， 778 中所描述的oxaylate氧化酶，或編碼另一種抗細(xì)菌或抗真菌多肽的多聚核苷酸， 如專利申請(qǐng)WO 97/30082、 W0 99/24594、 W0 99/02717、 W0 99/53053和W0 99/91089 中所描述的那些多聚核苷酸。還提到的有編碼植物的農(nóng)藝學(xué)特征的多聚核苷酸， 特別是編碼美國(guó)專利5,552,306和5,614,313，和專利申i青W0 98/46763和W0 98/46764所描述的S -6去飽和酶的多聚核苷酸，或編碼專利申請(qǐng)W0 00/01833 和PCT/FR 99/03179中所描述的絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的多聚核苷酸。
以下的實(shí)施例可能舉例說明了本發(fā)明，然而，并沒有限制它的范圍。


圖1是兩條預(yù)苯酸轉(zhuǎn)變成酪氨酸的途徑。
圖2(a)顯示了用分光光度計(jì)鑒測(cè)所生成的NADH或NADPH的量來測(cè)定 腦germte脫氫酶活性o
圖2 (b)顯示了 TyrA-Atc、TyrA-ATl、TyrA-AT2對(duì)Arogenate和NADP形成NADPH 的催化比活。
圖3顯示了三種重組酶的KmNADP、 Km arogenate、 Ki酪氨酸和天然分子量。 圖4顯示了 TyA-Synechocystis arogenate脫氫酶的Vmax、關(guān)ADP禾口 Km arogenate。
實(shí)施例1:編碼擬南芥arogenate脫氫酶基因的鑒定
現(xiàn)今在公共數(shù)據(jù)庫(hUp:〃胃.ncbi. nlm. nih. gov )中可得到所有的預(yù)苯酸 脫氫酶和arogenate脫氫酶序列的比較，顯示了四個(gè)短的同源序列部分。所比較 的酶是酵母預(yù)苯酸脫氫酶(登錄號(hào)Z36065),枯草芽胞桿菌預(yù)苯酸脫氫酶(登錄號(hào) M80245)和5y"ec力ocj^"s預(yù)苯酸脫氫酶(登錄號(hào)D90910)。這些同源部分使得能 夠鑒定擬南芥基因(登錄號(hào)AF096371)起初表明是編碼"與特殊的D-異構(gòu)體2-羥基酸脫氫酶相似"的酶。此基因包括由一個(gè)94bp內(nèi)含子隔開的兩個(gè)外顯子。第 一個(gè)外顯子包括1. 08kb長(zhǎng)的含有位于第一個(gè)ATG密碼子下游的推定的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn) 肽序列的幵放閱讀框。第二個(gè)外顯子可能有一個(gè)長(zhǎng)892bp的開放閱讀框。從兩個(gè) 外顯子推斷的蛋白質(zhì)之間大約有60%的非常強(qiáng)的同源性。如果不考慮位于第一個(gè)外 顯子中的推定的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，則同源性可達(dá)到70°/。.此外，這兩個(gè)預(yù)計(jì)蛋白質(zhì)序 列中的每一個(gè)都有以預(yù)苯酸/arogenate脫氫酶為特征的四個(gè)同源部分。此基因命 名為一(SEQ ID N0:1)。
實(shí)施例2: 7yw的轉(zhuǎn)錄特性
TyrA基因的轉(zhuǎn)錄物大小可用Northern雜交和PCR技術(shù)測(cè)定。將擬南芥新葉 中抽提出來的純化mRNA與32P放射標(biāo)記的探針(相應(yīng)于T)^4兩個(gè)外顯子DNA片段) 雜交。此項(xiàng)分析可能鑒定到一 L8-1.9kb的轉(zhuǎn)錄物，與預(yù)計(jì)的含有該兩個(gè)外顯子 的mRNA的大小非常接近。此外，盡管沒有用PCR擴(kuò)增完整的cDNA，但獲得一 1. 5kb 的PCR片段。此片段包含始于513bp位的5'寡聚核苷酸 (P8=5， -GCTAAAACTCTTCTCCTTCAATACTTACCTG-3，)和始于2053bp位的與3' UTR互補(bǔ)的3，寡聚核苷酸(p7二5， -CAGTATMTTAGTAGTCAAGGATCCTGACTGAGAG-3，)。此 片段包括一部分第一編碼序列(7>2^」77)和完整的第二編碼序列(7>^4^")。此 cDNA的序列分析證實(shí)了內(nèi)含子的剪接。Northern雜交和PCR的分析結(jié)果強(qiáng)烈提示 存在一個(gè)含有兩個(gè)編碼區(qū)域7>2^-^77(SEQ ID N0:4)和7>d-J7^(SEQ ID N0:6)的 mRNA轉(zhuǎn)錄物。
實(shí)施例3:含有擬南芥arogenate脫氫酶不同編碼序列的構(gòu)建物的制備
用在第一個(gè)ATG密碼子處引入NdeI限制性切割位點(diǎn)(下劃線所示)的寡聚核苷 酸P1(5' -TCTCCATATGATCTTTCMTCTCATTCTCATC-3')和與第一個(gè)外顯子3，端互 補(bǔ)并與內(nèi)含子5'端互補(bǔ)且引入一終止子(下劃線所示)的寡聚核苷酸 P2 (5， -CTAACTAACTAACTACATACCTCATCATATCC-3，)，對(duì)擬南芥基因組DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，得到第一外顯子7>^4-力77。三個(gè)缺少編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的構(gòu)建物也可用127 位第二個(gè)ATG密碼子處(M43)引入了 Nde I限制性切割位點(diǎn)的寡聚核苷酸 P3(5， -CCTCTCTTTCCATATGCTCCCTTCTC-3，)，在距第一個(gè)ATG密碼子(V58M)起的 第174位引入起始密碼子ATG /限制性切割位點(diǎn)(下劃線所示)的寡聚核苷酸 P4 (5 ， -CCGCCAGCCACCTCCATATGACCGACACCATCC-3 ，)，和在距第 一 個(gè)ATG密碼子 (L75M)起的第222位引入起始密碼子ATG和/限制性切割位點(diǎn)(下劃線所示) 的寡聚核苷酸P5(5， -CGCCACCCCTCATATGCGTATCGCC-3，)產(chǎn)生。將所有對(duì)應(yīng)于第一 外顯子的OCR片段，它們可能或不能編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽，都克隆入質(zhì)粒 pPCR-Script (Strategene)中。然后無論有沒有轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，將含有此編碼序列的 Nde I-BaraH I DNA片段克隆入質(zhì)粒pET21 a(+) (Novagen)中，導(dǎo)致產(chǎn)生有或沒有 轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的質(zhì)粒pET21- 7>rJ-^77(pET21-7y州-力77-Ml ， pET21-7)^4-^77-M43， pET21-:Tj^-力77-M5&和pET21-7yr"77-M75)。
用另兩個(gè)寡聚核苷酸擴(kuò)增第二編碼序列(7yrHi)。寡聚核苷酸 P6(5' -GATGCATCTTTGCATATGATGAGGTCAGAAGATG-3，)在第二個(gè)開放閱讀框的ATG 密碼子處(距第一個(gè)ATG密碼子起的第1081位)引入一個(gè)y^/e 了限制酶切位點(diǎn)(下 劃線所示)，和寡聚核苷酸P7(5， -CAGTATAATTAGTAGTCAAGGATCCTGACTGAGAG-3，) 與3' -UTR的起始處互補(bǔ)，引入^fe歷^I的限制酶切位點(diǎn)(下劃線所示)。與第二編 碼序列相對(duì)應(yīng)的PCR片段用Nde I-BamH I酶消化，然后克隆入質(zhì)粒pET21 a (+)， 產(chǎn)生質(zhì)粒pET21-7)^4-力Z 。
完整的編碼序列通過拼接第一個(gè)外顯子失去的5'端與用起始于距第一個(gè)ATG密碼子513bp處的寡聚核苷酸P8(5' -GCTMAACTCTTCTCCTTCAATACTTACC TG-3，)和3，寡聚核苷酸P7PCR擴(kuò)增擬南芥cDNA獲得的部分TyrA-ATcDNA(1.5kb) 而得到重組。位于離第一個(gè)ATG密碼子起的812bp處和部分7yW-^7 cDNA的5' 末端處的^6Wiy限制酶切位點(diǎn)用于重組的。將部分7>W-JrCDNA克隆進(jìn)入粒 pPCR-Script中。EcoRV-EcoRV片段從質(zhì)粒pPCR-Script-7yW-^7中獲得然后其隆 入用EcoRV酶消化后的質(zhì)粒pPCR-Script-7>2^」77中。此項(xiàng)操作導(dǎo)致獲得質(zhì)粒 pPCR-Script-7yW-^c。將含有完整編碼序列的Ndel-BamHl片段從質(zhì)粒 pPCR-Script-7>i^-J7b中剪切下來，然后克隆入用Ndel和BamHl酶消化后的質(zhì)粒 pET21a(+) (Novagen)中，得到質(zhì)粒pET21a(+)-7>州-X7b。然后對(duì)于第一外顯子用 同樣的方法得到4個(gè)質(zhì)粒pET21a(+)-7>T^-J7b; —個(gè)質(zhì)粒含有完整編碼序列具有 編碼推定的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，缺少此轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的三個(gè)質(zhì)粒已在三個(gè)不同的位點(diǎn)經(jīng) 過切割(M43， V58和L75,見上)。
對(duì)于上述的所有構(gòu)建物，對(duì)cDNA插入片段測(cè)序以保證在PCR擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)沒有 導(dǎo)入不需要的突變。
實(shí)施例4:酶活性的測(cè)量
在25°C、以340nm的波長(zhǎng)，在總體積為200u 1的含有50mM Tris-HC1， pH 8. 6, 300 u M arogenate和ImM NAD或NADPH的溶液中用分光光度計(jì)鑒測(cè)所生成的 NADH或NADra的量來測(cè)定arogenate脫氫酶活性。
在25°C，以340nra的波長(zhǎng)，在總體積為200 u 1的含有50mM Tris-HC1， pH 8.6，300uM預(yù)苯酸和ImM的NAD或NADPH的溶液中用分光光度計(jì)鑒測(cè)所生成的 NADH或NADra的量來測(cè)定預(yù)苯酸脫氫酶活性。
實(shí)施例5:重組arogenate脫氫酶的產(chǎn)生
用實(shí)施例3中所得到的每一種pET21-77d J7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌AT2471細(xì) 胞，然后37。C在加有l(wèi)OOn g/ml的羧芐青霉素的2升Luria-Bertani培養(yǎng)基中培 養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)液600nm(A600)波長(zhǎng)的吸收值達(dá)到等于0.6時(shí)，在培養(yǎng)液中加入ImM 的異丙基-3-D-硫代半乳糖苷以誘導(dǎo)重組蛋白合成。然后將細(xì)胞28。C下培養(yǎng)16 小時(shí)，收集，然后40 OOOg離心20min。沉淀重懸于含有ImM EDTA， ImM 二硫蘇糖 醇，lfflM芐脒鹽酸和5mM氨基己酸的50mMTris-HC1緩沖液中，pH7.5，然后用震 動(dòng)細(xì)胞攪碎器(Sonics and Marterials， Danbury， CT, USA)進(jìn)行超聲破碎(每3秒100脈沖功率5)。 40 000g離心20分鐘獲得粗提取物，上清夜直接用于酶試驗(yàn)。
含有不同構(gòu)建物pET21-7>j^」tc、 pET21-7y^"v477和pET21-7yi^-^7^的大 腸桿菌菌株AT 2471的總蛋白抽提物的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明，存在 三種重組蛋白，分子量分別是66-68kDa、 35kDa和33-34kDa。這些分子量與推測(cè) 的各自編碼序列十分相符(68786 Da為7)^4-力7b， 34966 Da為7>rU77, A069 Da 對(duì)應(yīng)于7>^-^7^)。對(duì)于含有完整編碼序列(7>州-X7b)和第一編碼序列(7>^-力77) 的轉(zhuǎn)化株，重組蛋白僅在編碼蛋白M58-7>^-^Tb和M58-7yrJ-^n的構(gòu)建物中觀 察到。這三種重組蛋白主要見蛋白包涵體中。然而，大腸桿菌中可溶性蛋白抽提 物中存在的少量重組蛋白使特征鑒定其生化特征成為可能。
實(shí)施例6:擬南芥arogenate脫氫酶的鑒定和分析生化特征 重組arogenate脫氫酶的生化特征分析采用轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株的可溶性蛋 白抽提物來進(jìn)行。按照實(shí)施例4中所描述的方法測(cè)量了 Arogenate脫氫酶活性。 這三個(gè)重組酶中的每一個(gè)均顯示了嚴(yán)格依賴NADP的arogenate脫氫酶活性。當(dāng)存 在NAD時(shí)檢測(cè)不到arogenate脫氫酶活性，不論釆用何種輔因子(NADP或NAD)或 不論測(cè)試何種蛋白質(zhì)(TyrA-ATc，TyrA-ATl或TyrA-AT2)都不能檢測(cè)到預(yù)苯酸脫氫 酶的活性。此外，lmM濃度的預(yù)苯酸不能抑制這三種重組酶的arogenate脫氫酶活 性。這些酶中的每一種都具有Michaelis-Menten類型的行為，它們的arogenate 和NADP的Km值大致相同(圖2和3) 。 NADP的Michaelis常數(shù)分別是TyrA-ATc 40 u M， TyrA-ATI 60 u M禾口 TyrA-AT2 20 u M。 Arogenate的Michaelis常數(shù)分別是 TyrA-ATc 70 uM， TyrA-ATI 45 uM和TyrA-AT2 45 uM。此外，像其它植物的 arogenate脫氫酶一樣(Byng等，1981， Phytochemistry 6， 1289-1292; Connelly and Conn， 1986， Z. Naturforsch 41c, 69—78; Gaines等，1982 Planta 156， 233—240)， 擬南芥arogenate脫氫酶都對(duì)酪氨酸，(此酶的反應(yīng)產(chǎn)物)非常敏感，但對(duì)ImM的 苯基丙氨酸以及ImM的p-羥苯基丙酮酸不敏感。酪氨酸的抑制作用與arogenate 競(jìng)爭(zhēng)(TyrA-ATc的Ki值是14 u M， TyrA-ATc的Ki值是8 u M和TyrA-ATc的Ki值 是12ixM)，但不與NADP競(jìng)爭(zhēng)。
實(shí)施例7: 5>Z7ec/ oc7l^is的arogenate脫氫酶的鑒定和生化特征分析 實(shí)施例1中鑒定了編碼擬南芥arogenate脫氫酶的基因序列(7>_^)，這使得 鑒定菌株6y/jec力oc7s"s (登錄號(hào)1652956)中的arogenate脫氫酶成為可能。最初曾把此基因描述為編碼"預(yù)苯酸脫氫酶"的基因。它從5y/3M力^j^"s基因
組庫中分離出并按照實(shí)施例5所描述的步驟產(chǎn)生此酶，方式與擬南芥此酶的產(chǎn)生 方式相同。所產(chǎn)生的酶的生化特征分析可證明它是一種arogenate脫氫酶而不是 預(yù)苯酸脫氫酶。6y/7ec力oc義s"sarogenate脫氫酶的生化特征分析可用從轉(zhuǎn)化的大 腸桿菌菌株純化的可溶性蛋白抽提物進(jìn)行。Arogenate脫氫酶的活性測(cè)定按照實(shí)施 例4所描述的方法進(jìn)行。此酶顯示了嚴(yán)格依賴NADP的arogenate脫氫酶活性。當(dāng) 存在NAD時(shí)則不能檢測(cè)到arogenate酶活性，無論用何種輔因子(NADP或NAD)都 不能檢測(cè)到預(yù)苯酸脫氫酶活性。此外，lmM濃度的預(yù)苯酸不能抑制此酶的arogenate 脫氫酶活性。加ec/ o，"s arogenate脫氫酶具有Michaelis-Menten類型的行 為(圖4)。其米氏常數(shù)對(duì)NADP是6uM，對(duì)arogenate是107 uM。
實(shí)施例8:其它植物arogenate脫氫酶的鑒定
實(shí)施例1中鑒定了編碼擬南芥arogenate脫氫酶的基因序列(7>2力，這使得 鑒定擬南芥中的其它arogenate脫氫酶成為可能。此新基因(登錄號(hào)AC0342561; SEQ ID N0:8)起初的注釋是"含有與尸icea Wa〃cs的胚胎豐富蛋白(EMB20)相似 的基因"。它也有一個(gè)推定的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，但沒有重復(fù)區(qū)域。
TyrA基因序列也使得可能鑒定公眾EST(表達(dá)序列標(biāo)簽)數(shù)據(jù)庫中的另外兩個(gè) 編碼arogenate脫氫酶的cDNA序列。這些cDNA中的一個(gè)不完整，對(duì)應(yīng)于西紅柿 cDNA(TC41067; SEQ IDN0:22).此cDNA的不完整特性使得不能確定它是否是TyrA 的復(fù)制本，因?yàn)樗?'末端終止在對(duì)應(yīng)于Tyr-ATl的D356密碼子之后。第二個(gè) cDNA對(duì)應(yīng)于尸ices ^Zawca的完整cDNA(登錄號(hào)L47749; SEQ ID N0: 10)且沒有 重復(fù)區(qū)域。此尸&朋^朋cs的柱釋是一種"胚胎豐富蛋白"。序列表
<110>阿方蒂農(nóng)科股份有限公司(Avetrtis Cr。pSci匿SA)
<120〉除草劑的新靶標(biāo)和對(duì)所述的除草劑有抗性的轉(zhuǎn)基因植物
〈130〉 033146F1
<150> FR 00/15723 <151> 2000-12-05
〈160〉 30
<170〉 Patentln Ver. 2. 1
<210〉 1 〈211> 2082 <212〉腿
<213〉擬南芥(Arabidopsis thaliana) <220〉
<221>轉(zhuǎn)運(yùn)肽 <222> (1). . (174)
<220〉
<221〉內(nèi)含子
<222〉 (1089).. (1181)
<400〉 1
atgatctttcaatctcattctcatcatcttcttctctatcaatcctcatcttcctcctcc60
ttcttcttcctcccaaagctCatC3CC犯acctcctctctccctctcatttacctctctt120
tcctcaatgctcccttctctctctctctccaccgcc犯ccgccacctctccgtcaccgac180
accatccctcttcccaactcc犯ctcc犯cgccacccctcctctccgtatcgccatcatc240
ggattcggaaactacggccaattccttgccgaaaccctaatttctcaaggccacattctc300
ttcgctcactcccgatccgatcactcctccgccgctcgccgtctcggtgtctcatacttc360
accgatcttcacgatctctgcgaacgtcatcctgacgtagtccttctctgtacttcaatc420
ctctccatagagaatattctcaaaacgttgccgtttcagagsctccgtcgcaacactctc480
ttcgttgatgttctctccgttaaagagtttgctaaaactc"ttctccttcaatacttacct540
g犯g3tttCgatsttctttgtacacatccastgtttggtcctc卿gtgtgagttcaaat600
catggctggagagga"朋gatttgtg"tatgat犯agttaggattggggaag卿gattg660
agagtctcaaggtgtg卿gttttcttgagatttttgttag聊3gg3tgtg卿tggtg720
gagatgagtgttactgatcatgataagtttgctgctg組cacagtttat780
cttggtaggcttUggggatgttgaagttgatatcgacgccgattaatacg犯agggtac840
gaggcgttgcttgatttagctgagaatatttgtgggg由gttttgatttgtattatggg900
ttgtttgtgtataataacaactctUggaggtgttagagaggattgatttggctttcgag960
gctttgcgtaaggsgctttttagtcggcttcacggtgUgtgagg犯gcagtcttttgaa1020
ggtgaagcaaagaaagttcatgtttttcca組tgtggtg犯aatgatgcttctttggat1080
atgatgaggtatgtagttagttagttagttacattgtgtggtttgatgcattttggattt1140
ggtttcttattgta犯tagttatcgatttgtgatcttgcaggtc卿agatgttgttgtg1200
aagtatgaatataactcccaggtgtctggtagtgttaatgacggUcgaggctcaagatt1260
ggtatcgtcgggtttggaaattttggacagUtctaggtaaaaccatggtcaagcagggt1320cacactgtgttagcttattccagaagtgactacactgatgaagcagcaaagctcggtgtt1380
tcgtatttttcagatcttgatgatctatttgaagagcatcctgaagttattattctctgt1440
acgtcaatcctttcgactgaaaaagttctcgagtcactaccgtttcagagactgaagaga1500
agcacactttttgtggatgtactctcagtaaaagagttcccgaggaatttatttcttcaa1560
actctcccactattttgtgcacgcatcctatgtttgggcc柳gagtggt1620
tgcctttgtgtttgataaggtt3gg3ttgg1680
agaag犯犯tcgaggtgtaacagttttcttgatatttttgcccgtgaaggatgtcgtatg1740
gtgg卿tgtcgtgtgctgsacatgattggcatgctgctggatcacagtttatcacacac1800
acagtgggaaggcttctggagaagctgagcttggaatctactcctatagataccaaaggt1860
tatgagacattgctaaaactggtgg柳atactgctggtgacagctttgatctgtactat1920
ggactatttttatacaatcctaatgcaatggaacagcttgagaggtttcatgtggctm1980
gaatcattgaagacacagctctttggacgactacattctcaacattctcatgagctagct2040
aaatcatcttCCCC3犯g3Caactaagctattaactagct￡l￡L2082
〈210> 2 QM〉蘭 <212〉顏
<213〉擬南芥(Arabidopsis thaliana)
〈220>
〈221〉 CDS
〈222〉 (1).. (1980)
<220〉
<221〉轉(zhuǎn)運(yùn)肽 <222> (1)., (174)
<400> 2
atg ate ttt caa Met lie Phe Gin 1
tct tec tec tec Ser Ser Ser Ser 20
etc tec etc tcs Leu Ser Leu Ser 35
etc tec acc gec Leu Ser Thr Ala 50
CCC犯C tCC
Pro Asn Ser Asn 65
gga Uc gga aac Gly Phe Gly Asn
ggc cac已tt etc Gly His lie Leu 100
cgc cgt etc ggt
tct cat tct cat Ser His Ser His 5
ttc ttc Uc etc Phe Phe Phe Leu
ttt acc tct ctt Phe Thr Ser Leu 40
CgC C3C CtC
Asn Arg His Leu 55
tec aac gec acc Ser Asn Ala Thr 70
tac ggc caa Uc Tyr Gly Gin Phe 85
ttc get cac tec Phe Ala His Ser
gtc tea tac ttc
cat ctt ctt etc tat His Leu Leu Leu Tyr 10
cca aag etc ate acc Pro Lys leu lie Thr 25
tec tea atg etc cct Ser Ser Met Leu Pro 45
tec gtc acc gac acc Ser Val Thr Asp Thr 60
cct cct etc cgt ate Pro Pro Leu Arg lie 75
ctt gec gaa acc eta Leu Ala Glu Thr Leu 90
cga tec gat cac tec Arg Ser Asp His Ser 105
acc gat ctt cac gat
caa tec tea 48 Gin Ser Ser 15
aaa cct cct 96 Lys Pro Pro 30
tct etc tct 144 Ser Leu Ser
ate cct ctt 192 lie Pro leu
gec ate ate 240 Ala lie lie 80
att tct caa 288 lie Ser Gin 95
tec gec get 336 Ser Ala Ala 110
etc tgc g貼 384
25Arg Arg Leu Gly Vai Ser Tyr Phe Thr Asp Leu His Asp Leu Cys Glu
115 120 125
cgt cat cct gac gta gtc ctt etc tgt act tea ate etc tec ata gag 432 Arg His Pro Asp Val Val Leu Leu Cys Thr Ser lie Leu Ser lie Glu
130 135 140
aat att etc aaa acg ttg ccg ttt cag aga etc cgt cgc aac act etc 480 八sn lie Leu Lys Thr Leu Pro Phe Gin Arg Leu Arg Arg Asn Thr Leu 145 150 155 160
ttc gtt gat gtt etc tec gtt aaa gag ttt get aaa act ctt etc ctt 528 Phe Val Asp Val Leu Ser Val Lys Glu Phe Ala Lys Thr Leu Leu Leu
165 170 175
caa tac tta cct gaa gat ttc gat att ctt tgt aca cat cca atg ttt 576 Gin Tyr Leu Pro Glu Asp Phe Asp lie Leu Cys Thr His Pro Met Phe
180 185 190
ggt cct cag agt gtg agt tea aat cat ggc tgg aga gga tta aga ttt 624 Gly Pro Gin Ser Val Ser Ser Asn His Gly Trp Arg Gly Leu Arg Phe
195 200 205
gtg tat gat aaa gtt agg att ggg gaa gag aga ttg aga gtc tea agg 672 Val Tyr Asp Lys Val Arg lie Gly Glu Glu Arg Leu Arg Val Ser Arg
210 215 220
tgt gag agt ttt ctt gag att ttt gtt aga gaa gga tgt gag atg gtg 720 Cys Glu Ser Phe Leu Glu lie Phe Val Arg Glu Gly Cys Glu Met Val 225 230 235 240
gag atg agt gtt act gat cat gat aag ttt get get gaa tea cag ttt 768 Glu Met Ser Val Thr Asp His Asp Lys Phe Ala Ala Glu Ser Gin Phe
245 250 255
ata act cat act cU ggt agg ctt ttg ggg atg ttg aag Ug ata tcg 816 lie Thr His Thr Leu Gly Arg Leu Leu Gly Met Leu Lys Leu lie Ser
260 265 270
acg ccg aU aat acg aaa ggg tac gag gcg Ug ctt gat tta get gag 864 Thr Pro lie Asn Thr Lys Gly Tyr Glu Ala Leu Leu Asp Leu Ala Glu
275 280 285
aat att tgt ggg gat agt ttt gat Ug tat tat ggg ttg ttt gtg tat 912 Asn lie Cys Gly Asp Ser Phe Asp Leu Tyr Tyr Gly Leu Phe Val Tyr
290 295 300
aat aac aac tct ttg gag gtg tta gag agg att gat ttg get ttc gag 960 Asn Asn Asn Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg lie Asp Leu Ala Phe Glu 305 310 315 320
get ttg cgt aag gag ctt ttt agt egg ctt cac ggt gtt gtg agg aag 1008 Ala Leu Arg Lys Glu Leu Phe Ser Arg Leu His Gly Val Val Arg Lys
325 330 335
cag tct ttt gaa ggt gaa gca aag aaa gtt cat gtt ttt cca aat tgt 1056 Gin Ser Phe Glu Gly Glu Ala Lys Lys Val His Val Phe Pro Asn Cys
340 345 350
ggt gaa aat gat get tct ttg gat atg atg agg tea gaa gat gtt gtt 1104 Gly Glu Asn Asp Ala Ser Leu Asp Met Met Arg Ser Glu Asp Val Val
355 360 365
gtg aag tat gaa tat aac tec cag gtg tct ggt agt gtt aat gac ggt 1152 Val Lys Tyr Glu Tyr Asn Ser Gin Val Ser Gly Ser Val Asn Asp Gly
370 375 380
tcg agg etc aag att ggt ate gtc ggg ttt gga aat ttt gga cag ttt 1200Ser Arg Leu Lys lie Gly lie Val Gly Phe Gly Asn Phe Gly Gin Phe
385 390 395 400
cta ggt aaa acc atg gtc aag cag ggt cac act gtg tta get tat tec 1248
Leu Gly Lys Thr Met Val Lys Gin Gly His Thr Val Leu Ala Tyr Ser
405 410 415
aga agt gac tac act gat gaa gca gca aag etc ggt gtt teg tat ttt 12% Arg Ser Asp Tyr Thr Asp Glu Ala Ala Lys Leu Gly Val Ser Tyr Phe
420 425 430
tea gat ctt gat gat cta ttt gaa gag cat cct gaa gtt att att etc 1344 Ser Asp Uu Asp Asp Leu Phe Glu Glu His Pro Glu Val lie lie Uu
435 440 445
tgt acg tea ate ctt teg act gaa aaa gtt etc gag tea cta ccg ttt 1392 Cys Thr Ser lie Leu Ser Thr Glu Lys Val Leu Glu Ser Leu Pro Phe
450 455 460
cag aga ctg aag aga age aca ctt ttt gtg gat gta etc tea gta aaa 1440 Gin Arg Leu Lys Arg Ser 丁hr Leu Phe Val Asp Val Leu Ser Val Lys 465 470 475 480
gag tt.c ccg agg aat tta ttt ctt caa act etc cca c朋gat ttt gat 1488 Glu Phe Pro Arg Asn Leu Phe Leu Gin Thr Leu Pro Gin Asp Phe Asp
485 柳 495
att Ug tgc acg cat cct atg ttt ggg cca gag agt ggt aaa aat gga 1536 lie Leu Cys Thr His Pro Met Phe Gly Pro Glu Ser Gly Lys Asn Gly
500 505 510
tgg aac犯t ctt gcc ttt gtg ttt gat肪g gU agg att gga atg gat 1584 Trp Asn Asn Leu Ala Phe Val Phe Asp Lys Val Arg lie Gly Met Asp
515 520 525
gat aga aga aaa teg agg tgt aac agt ttt ctt gat att ttt gcc cgt 1632 Asp Arg Arg Lys Ser Arg Cys Asn Ser Phe Leu Asp lie Phe Ala Arg
530 535 540
gaa gga tgt cgt atg gtg gag atg teg tgt get g犯cat gat tgg cat 1680 Glu Gly Cys Arg Met Val Glu Met Ser Cys Ala Glu His Asp Trp His 545 550 555 560
get get gga tea cag ttt ate aca cac aca gtg gga agg ctt ctg gag 1728 Ala Ala Gly Ser Gin Phe lie Thr His Thr Val Gly Arg Leu Leu Glu
565 570 575
aag ctg age ttg gaa tct act cct ata gat acc aaa ggt "tat gag aca 1776 Lys Leu Ser Leu Glu Ser Thr Pro lie Asp Thr Lys Gly Tyr Glu Thr
580 585 590
Ug cta aaa ctg gtg gag aat act get ggt gac age ttt gat ctg tac 1824 Leu Leu Lys Leu Val Glu Asn Thr Ala Gly Asp Ser Phe Asp Leu Tyr
595 600 605
tat gga cta ttt tta tac aat cct aat gca atg gaa cag ctt gag agg 1872 Tyr Gly Leu Phe Leu Tyr Asn Pro Asn Ala Met Glu Gin Leu Glu Arg
610 615 620
ttt' cat gtg get ttt gaa tea ttg aag aca cag etc ttt gga cga cta 1920 Phe His Val Ala Phe Glu Ser Leu Lys Thr Gin Leu Phe Gly Arg Leu 625 630 635 640
cat tct c.aa cat tct cat gag cta get aaa tea tct tec cca aag aca 1968 His Ser Gin His Ser His Glu Leu Ala. Lys Ser Ser Ser Pro Lys Thr
645 650 655
act aag cta tta a 1981
27<210> 3 〈211> 660 <212〉 PRT
<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400〉 3
Met lie Phe Gin Ser His Ser His His Leu Leu Leu Tyr Gin Ser Ser
15 10 15
Ser Ser Ser Ser Phe Phe Phe Leu Pro Lys Leu lie Thr Lys Pro Pro
20 25 30
Leu Ser Leu Ser Phe Thr Ser Leu Ser Ser Met Leu Pro Ser Leu Ser
35 40 45
Leu Ser Thr Ala Asn Arg His Leu Ser Val Thr Asp Thr lie Pro Leu
50 55 60
Pro Asri Ser Asn Ser Asn Ala Thr Pro Pro Leu Arg lie Ala lie lie 65 70 75 80
Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Gin Phe Leu Ala Glu Thr Leu lie Ser Gin
85 90 95
Gly His lie Leu Phe Ala His Ser Arg Ser Asp His Ser Ser Ala Ala
100 105 110
Arg Arg Leu Gly Val Ser Tyr Phe Thr Asp Leu His Asp Leu Cys Glu
115 120 125
Arg His Pro Asp Val Val Leu Leu Cys Thr Ser lie Leu Ser lie Glu
130 135 140
Asn lie Leu Lys Thr Leu Pro Phe Gin Arg Leu Arg Arg Asn Thr Leu 145 150 155 160
Phe Val Asp Val Leu Ser Val Lys Glu Phe Ala Lys Thr Leu Leu Leu
165 170 175
Gin Tyr Leu Pro Glu Asp Phe Asp lie Leu Cys Thr His Pro Met Phe
180 185 190
Gly Pro Gin Ser Val Ser Ser Asn His Gly Trp Arg Gly Leu Arg Phe
195 200 205
Val Tyr Asp Lys Val Arg lie Gly Glu Glu Arg Leu Arg Val Ser Arg
210 215 220
Cys Glu Ser Phe Leu Glu lie Phe Val Arg Glu Gly Cys Glu Met Val 225 230 235 240
Glu Met Ser Val Thr Asp His A印Lys Phe Ala Ala Glu Ser Gin Phe
245 250 255
lie Thr His Thr Leu Gly Arg Leu Leu Gly Met Leu Lys Leu lie Ser
260 265 270
Thr Pro lie Asn Thr Lys Gly Tyr Glu Ala Leu Leu Asp Leu Ala Glu
275 280 285
Asn lie Cys Gly Asp Ser Phe Asp Leu Tyr Tyr Gly Leu Phe Val Tyr
290 295 300
Asn Asn Asn Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg lie Asp Leu Ala Phe Glu 305 310 315 320
Ala Leu Arg Lys Glu Leu Phe Ser Arg Leu His Gly Val Val Arg Lys 325 330 335Gin
Gly
Val
Ser 385 Leu
Arg
Ser
Cys
Gin 艦 Glu
Ser
Glu
Lys 370 Arg
Gly
Ser
Asp
Thr 450 Arg
Asn
Glu 545 Ala
Lys
Leu
Tyr
Phe 625 His
Thr
Arg 530 Gly
Ala
Leu
l>eu
Gly 610 His
Ser
Lys
Phe
Asn 355 Tyr
Leu
Lys
Asp
Leu 435 Ser
Glu 340 Asp
Glu
Lys
Thr
Tyr 420 Asp
Gly
Ala
Tyr
lie
Met 405 Thr
Glu
Ser
Asn
Gly 390 Val
II
Phe Pro Arg
Asp Leu
e Leu Ser
Asp
Leu Lys Arg
lie Leu Cys Trp Asp
Asn 515 Arg
Cys
Gly
Ser
Lys 595 Leu
Val
Gin
Leu
Thr 500 !>eu
匕ys
Arg
Ser
Leu 580 Leu
Phe
Ala
His
Leu 660
Asn 485 His
Ala
Ser
Met
Gin 565 Glu
Val
Leu
Phe
Ser 645
Ser 470 Leu
Pro
Phe
Arg
Val 550 Phe
Ser
Glu
Tyr
Glu 630 His
Ala
Leu
Ser 375 lie
Lys
Glu
Phe
Thr 455 Thr
Phe
Met
Val
Cys 535 Glu
lie
Thr
Asn
Asn 615 Ser
Glu
Lys
Asp 360 Gin
Val
Gin
Ala
Glu 440
Glu
Leu
Leu
Phe
Phe 520 Asn
Met
Thr
Pro
Thr 600 Pro
Leu
Leu
345 Met
Val
Gly
Gly
Ala 425 Glu
Lys
Phe
Gin
Gly 505 Asp
Ser
Ser
His
lie 585 Ala
Asn
Lys
Ala
Val
Met
Ser
Phe
His 410 Lys
His
Val
Val
Thr 490 Pro
Lys
Phe
Cys
Thr 570 Asp
Gly
Ala
Thr
Lys 650
His
Arg
Gly
Gly 395 Thr
Leu
Pro
Leu
Asp 475 Leu
Glu
Val
Leu
Ala 555 Val
Thr
Asp
Met
Gin 635 Ser
Val
Ser
Ser 380 Asn
Val
Gly
Glu
Glu 460 Val
Pro
Ser
Arg
Asp 540 Glu
Gly
Lys
Ser
Glu 620 l>eu
Ser
Phe
Glu 365 Val
Phe
Leu
Val
Val 445 Ser
Leu
Gin
Gly
lie 525 lie
His
Arg
Gly
Phe 605 Gin
Phe
Ser
Pro 350 Asp
Asn
Gly
Ala
Ser 430 lie
Leu
Ser
Asp
Lys 510 Gly
Phe
Asp
Leu
Tyr 590 Asp
Leu
Gly
Pro
Asn
Val
Asp
Gin
丁yr 415 Tyr
lie
Pro
Val
Phe 495 Asn
Met
Ala
Trp
Leu 575 Glu
Leu
Glu
Arg
lys 655
Cys
Val
Gly
Phe 400 Ser
Phe
Leu
Phe
卿 Asp
Gly
Asp
Arg
His 560 Glu
Thr
Tyr
Arg
Leu 640 Thr
<210〉 4
<211> 933 〈212〉腿
<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<220>
〈221> CDS
29<222〉 (1).. (933) <400〉 4
atg acc gac acc atc cct ctt ccc aac tcc aac tcc aac gcc acc cct 48 Met Thr Asp Thr lie Pro Leu Pro Asn Ser Asn Ser Asn Ala Thr Pro
15 10 15
cct etc cgt ate gcc ate ate gga ttc gga aac tac ggc caa ttc ctt 96 Pro Leu Arg lie Ala lie lie Gly Phe Gly Asn Tyr Gly Gin Phe Leu
20 25 30
gcc gaa acc eta att tct c犯ggc cac att etc ttc get cac tcc cga 144 Ala Glu Thr Leu工le Ser Gin Gly His lie Leu Phe Ala His Ser Arg
35 40 45
tcc gat cac tcc tcc gcc get cgc cgt etc ggt gtc tea tac ttc acc 192 Ser Asp His Ser Ser Ala /Ua Arg Arg乙eu Gly Val Ser Tyr Phe Thr
50 55 60
gat ctt cac gat etc tgc gaa cgt cat cct gac gta gtc ctt etc tgt 240 Asp Leu His Asp Leu Cys Glu Arg His Pro Asp Val Val Leu Leu Cys 65 70 75 80
act tea ate etc tcc ata gag aat att etc aaa acg "ttg ccg ttt cag 288 Thr Ser lie Leu Ser lie Giu Asn lie Leu Lys Thr Leu Pro Phe Gin
85 90 95
aga etc cgt cgc aac act etc ttc gtt gat gtt etc tcc gtt aaa gag 336 Arg Leu Arg Arg Asn Thr Leu Phe Val Asp Val Leu Ser Val Lys Glu
100 105 110
ttt get aaa act ctt etc ctt caa tac tta cct gaa gat ttc gat att 384 Phe Ala Lys Thr Leu Leu Leu Gin Tyr Leu Pro Glu Asp Phe Asp lie
115 120 125
ctt tgt aca cat cca atg ttt ggt cct cag agt gtg agt tea aat cat 432 Leu Cys Thr His Pro Met Phe Gly Pro Gin Ser Val Ser Ser Asn His
130 135 M0
ggc tgg aga gga tta aga ttt gtg tat gat a犯gU agg att ggg gaa 480 Gly Trp Arg Gly Leu Arg Phe Val Tyr Asp Lys Val Arg lie Gly Gtu 145 150 155 160
gag aga ttg aga gtc tea agg tgt gag agt ttt ctt gag att ttt gU 528 Glu Arg Leu Arg Val Ser Arg Cys Glu Ser Phe Leu Glu lie Phe Val
165 170 175
aga gaa gga tgt gag atg gtg gag atg agt gtt act gat cat gat aag 576 Arg Glu Gly Cys Glu Met Val Glu Met Ser Val Thr Asp His Asp Lys
180 185 190
Ut get get gaa tea cag ttt ata act cat act ctt ggt agg ctt ttg 624 Phe Ala Ala Glu Ser Gin Phe lie Thr His Thr Leu Gly Arg Leu Leu
195 200 205
ggg atg ttg aag ttg ata teg acg ccg att aat acg aaa ggg tac gag 672 Gly Met Leu Lys Leu lie Ser Thr Pro lie Asn Thr Lys Gly Tyr Glu
210 215 220
gcg Ug ctt gat tta get gag aat att "tgt ggg gat agt ttt gat ttg 720 Ala Leu Leu Asp Leu Ala Glu Asn lie Cys Gly Asp Ser Phe Asp Leu 225 230 235 240
tat tat ggg ttg ttt gtg tat aat aac aac tct ttg gag gtg tta gag 768 Tyr Tyr Gly Leu Phe Val Tyr Asn Asn Asn Ser Leu Glu Val Leu Glu 245 250 255agg Arg
ctt Leu
gtt Val
atg Met 305
lie
His
cat His 290 agg
gat ttg get Asp Leu Ala
260 ggt gtt gtg Gly Val Val 275
gtt ttt cca Val Phe Pro
tat gta gtt Tyr Val Val
ttc Phe
agg Arg
犯t Asn
agt Ser 310
gag Glu
卿
tgt Cys 295 tag
get ttg Ala Leu 265 cag tct Gin Ser 280
ggt gaa Gly Glu
cgt Arg
ttt Phe
aat Asn
aag gag Lys Glu
gaa ggt Glu Gly
gat Asp
get Ala 300
ctt Leu
gaa Glu 285 tct Ser
ttt Phe 270 gca Ala
ttg leu
agt Ser
aag Lys
gat Asp
egg 816 Arg
aaa 864
atg 912 Met
933
<210〉 5
<211> 310
<212〉 PRT
<213〉擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400〉 5 Met 1
Pro
Ala
Ser
Asp 65 Thr
Arg
Phe
Leu
Gly 145 Glu
Arg
Phe
Gly
Ala 225 Tyr
Thr
Leu
Glu
Asp 50 Leu
Ser
Leu
Ala
Cys 130 Trp
Arg
Glu
Ala
Met 210 Leu
Tyr
Asp
Arg
Thr 35 His
His
lie
Arg
Lys 115 Thr
Arg
Leu
Gly
Ala 195 Leu
Leu
Gly
Thr
lie 20 Leu
Ser
Asp
Leu
Arg 100 Thr
His
Gly
Arg
Cys 180 Glu
Lys
Asp
Leu
lie
5
Ala lie Ser Leu
Ser 85 Asn
Pro
lie
Ser
Ala
Cys 70 lie
Leu
lie
Gin
Ala 55 Glu
Glu Leu Leu Leu leu
Thr
Pro
Leu
Val 165 Glu
Ser
Leu
Leu
Phe 245
Met
Arg 150 Ser
Met
Gin
lie
Ala 230 Val
Phe 135 Phe
Arg
Val
Phe
Ser 215 Glu
Tyr
Pro
Gly
Gly 40 Arg
Arg
Asn
Phe
Gin 120 Gly
Val
Cys
Glu
lie 200 Thr
Asn
Asn
Asn
Phe 25 His
Arg
His
lie
Val 105 Tyr
Pro
Tyr
Glu
Met 185 Thr
Pro
lie
Asn
Ser 10 Gly
lie
Leu
Pro
Leu 90 Asp
Leu
Gin
Asp
Ser 170 Ser
His
lie
Cys
Asn 250
Asn
Asn
Leu
Gly
Asp 75 Lys
Val
Pro
Ser
Lys 155 Phe
Val
Thr
Asn
Gly 235 Ser
Ser
Tyr
Phe
Val 60 Val
Thr
Leu
Glu
Val 140 Val
Leu
Thr
Leu
Thr 220 Asp
Leu
Asn
Gly
Ala 45 Ser
Val
Leu
Ser
Asp 125 Ser
Arg
Glu
Asp
Gly 205 Lys
Ser
Glu
Ala Thr Pro
Gin 30 His
Tyr
Leu
Pro
Val 110 Phe
Ser
lie
lie
His 190 Arg
Gly
Phe
Val
Thr 15 Phe
Ser
Phe
Leu
Phe 95 Lys
Asp
Asn
Gly
Phe 175 Asp
Leu
Tyr
Asp
Leu 255
leu
Arg
Thr
Cys 80 Gin
Glu
lie
His
Glu 160 Val
Lys
Leu
Glu
Leu 240 GluArg lie Asp Leu Ala Phe Glu Ala Uu Arg Lys Glu Leu Phe Ser Arg
260 265 270
Leu His Gly Val Val Arg Lys Gin Ser Phe Glu Gly Glu Ala Lys Lys
275 280 285
Val His Val Phe Pro Asn Cys Gly Glu Asn Asp Ala Ser Leu Asp Met
290 295 300
Met. Arg Tyr Val Val Ser 305 310
<210〉 6 〈211〉 909 <212〉 DNA
<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)
〈221〉 CDS <222> (1), (909)
6
<400〉 stg自 Met Met 1
gtg tct Val Ser
ggg ttt Gly Phe
ggt cac Gly His 50
gca肌g Ala Lys
65 gag cat Glu His
agg Arg
ggt Gly
gga Gly 35 act Thr
etc Leu
cct Pro
aaa gtt etc Lys Val Leu
ttt gtg Phe Val
cm set Gin Thr 130 ggg cca Gly Pro 145
gat aag Asp Lys
tea Ser
agt Ser 20 aat Asn
gat Asp 115 etc Leu
gag Glu
gtt Val
Glu
gag Glu 100 gta Val
agt Ser
agg Arg
gaa Glu 5
gtt Val
Ut Phe
gtg tta Val Leu
ggt gtt Gly Val
Pro Gin
gat Asp
Asn
gtt Val
gac Asp
gtt gtg Val Val
gga cag Gly Gin
gtt Val 85 tea Ser
etc Leu
get Ala
teg Ser 70 att lie
tat Tyr 55 tat Tyr
att lie
ggt Gly
ttt Phe 40 tec Ser
eta ccg Leu Pro
tea gta Ser Vsl
ggt Gly
lie
gat Asp
肌3 Lys 150 gga Gly
ttt Phe 135 aat Asn
atg Met
ttt Phe
Lys 120 gat Asp
teg Ser 25 eta Leu
aga Arg
犯g Lys 10 agg Arg
tat Tyr
etc Leu
agt gac Ser Asp
ttt tea Phe Ser
etc tgt Leu Cys
cag Gin
卿 Glu
att lie
gat Asp
acg Thr 90
ttc ccg Phe Pro
,tgg Gly Trp
gat gat Asp Asp
ttg Leu
Arg
tgc Cys
aat Asn 155 卿 Arg
g肌 Glu
aag Lys
ggt肌a acc Gly Lys Thr
ctt Leu 75 tea Ser
ctg Leu
tac Tyr 60 gat Asp
acg Thr 140 ctt Leu
tat Tyr
att lie
atg Met 45 act Thr
gat Asp
gcc Ala
Asn
ggt Gly 30 gtc Val
3tC Ctt
lie Leu
犯g aga Lys Arg
3gg犯t Arg Asn 125 cat His
aaa teg Lys Ser
m Phe
agg Arg
tec Ser 15 ate lie
膽g lys
eta Leu
teg Ser
age Ser 110 tta Leu
cag Gin
gtc Val
Gin
gat gaa gCEt Asp Glu Ala
ttt Phe
3Ct
Thr 95 aca Thr
Ut Phe
Glu 80 g犯 Glu
ctt 乙eu
ctt Leu
cct atg ttt Pro Met Phe
Val
tgt Cys
tu
Phe 160 aac Asn
48
96
144
192
240
288
336
384
432
480
528agt Ser
tcg Ser
His
lie
225 get Ala
ttt Phe
tgt Cys
鯽
get Ala
丁hr
290
165
ctt gat att leu Asp lie
180 get gaa cat Ala Glu His 195
gtg gga agg Val Gly Arg
Thr 210
gat acc aaa Asp Thr Lys
ggt Gly
朋t gC3
Asn Ala
gac age Asp Ser
atg gaa Met Glu 260 cag etc Gin Leu 275
tea tct Ser Ser
Gly
ttt Phe 245
Gin
ttt Phe
tec Ser
Ut Phe
gat Asp
ctt Leu
城 Tyr 230 gat Asp
ctt Leu
gga Gly
gcc cgt Ala Arg
tgg Trp
ctg Leu 215 gag Glu
cat His 200 gag Glu
Thr
ctg tac Leu Tyr
g服鄉(xiāng) Glu Arg
Pro
cga Arg
犯g Lys 295
eta Leu 280
Thr
g肌 Glu 185 get Ala
卿 Lys
ttg Leu
城 Tyr
ttt Phe 265 cat His
170 gga Gly
get Ala
ctg Leu
eta Leu
gga Gly 250 cat. His
tct Ser
act aag Thr Lys
tgt cgt atg Cys Arg Met
gga Gly
age Ser
235 eta Leu
tea Ser
ttg Leu 220 ctg Leu
Ut Phe
cag Gin 205 gaa Glu
gtg
Val
tta Leu
gtg get ttt Val Ala Phe
Gin
eta leu
cat His
tta Leu 300
tct Ser 285 act Thr
gtg Val 190
tu
Phe
175 gag Glu
￡ltC
lie
atg Met
Thr
gag Glu
tac Tyr
g犯 Glu 270 cat His
Asn
犯t Asn 255 tea Ser
gag Glu
act Thr 240 cct Pro
ttg Leu
eta Leu
3gC t33
Ser
576
624
tct act cct 672 Ser Thr Pro
720
768
816
864
909
〈210〉 7
〈211〉 302
〈212〉 PRT
<213>擬南芥(Arabidopsis thaliana)
<400> 7 Met Met
1
Val
Gly
Gly
Ala 65 Glu
Lys
Phe
Gin
Gly
Ser
Phe
His 50 Lys
His
Val
Val
Thr 130 Pro
Arg
Gly
Gly 35 Thr
Leu
Pro
Leu
Asp 115 Leu
Glu
Ser
Ser 20 Asn
Val
Gly
Glu
Glu 100
Val
Pro Ser
Glu 5
Val
Phe
Leu
Val
Val 85 Ser
Leu
Gin
Gly
Asp
Asn
Gly
Ala
Ser 70 lie
Leu
Ser
Asp
Val
Asp
Gin
Tyr 55 Tyr
lie
Pro
Val
Phe 135 Asn
Val
Gly
Phe 40 Ser
Phe
Leu
Phe
Val
Ser 25 Leu
Arg
Ser
Cys
120 Asp
Gin 105 Glu
10
Arg
Gly
Ser
Asp
Thr 90 Arg
Tyr
Leu
Lys
Asp
Leu 75 Ser
Leu Pro Cys
Gly Trp Asn Asn
lie
Phe Leu
Glu
Lys
Thr
Tyr 60 Asp
lie
匕ys
Arg
Thr 140 Leu
丁yr
lie
Met 45 Thr
Asp
Leu
Arg
Asn 125 His
Ala
Asn
Gly 30 Val
Asp
Leu
Ser
Ser 110 Leu
Pro
Phe
Ser 15 lie
Lys
Phe
Thr 95 Thr
Phe
Met
Val
Gin
Val
Gin
Ala
Glu 80 Glu
Leu
leu
Phe
Phe145
Asp Lys Val Ser Phe Leu
Ser Cys
His Thr 210 lie Asp 225
Ala Gly
195 Val
Thr Asp Asn Ah Met
Lys Thr
Ala Lys 290
Gin 275 Ser
150
Arg lie Gly Met 165
Asp lie Phe Ala 180
Glu His Asp Trp
Gly Arg Leu Leu 215
Lys Gly Tyr Glu 230
Ser Phe Asp Leu 245
Glu Gin Leu Glu 260
Leu Phe Gly Arg
Ser Ser Pro Lys 295
Asp
Arg
His 200 Glu
Thr
Tyr
Arg
Leu 280 Thr
Asp
Glu 185 Ala
Lys
Leu
Tyr
Phe 265 His
Arg 170 Gly
Ala
Leu
Leu
Gly 250 His
Ser
155
Arg Lys
Cys
Gly
Ser
Lys 235 Leu
Val
Gin
Thr Lys Leu
Arg
Ser
leu 220 Leu
Phe
Ala
His
Leu 300
Met
Gin 205 Glu
Val
Leu
Phe
Ser 285 Thr
Arg
Val 190 Phe
Ser
Glu
丁yr
Glu 270 His
Ser
Cys 175 Glu
lie
Thr
Asn
Asn 255 Ser
Glu
160 Asn
Met
Thr
Pro
Thr 240 Pro
Leu
Leu
<210〉 8 〈211> 1077 <212〉隱
<213〉擬南芥(Arabid叩sis thaiiana)
<220〉
<221〉 CDS
<222> (1).. (1077)
〈400〉 8
atg cta etc cat Met Leu Leu His 1
etc cgc cgc aat Leu Arg Arg Asn 20
cga att cga gca Arg lie Arg Ala 35
etc aaa tec gag Leu Lys Ser Glu 50
ggt ttc ggc aat Gly Phe Gly Asn 65
ggc cac gat cta Gly His Asp Leu
aac tea ate gga
ttc tct ccg gcg Phe Ser Pro Ala 5
tea ccc aca ttc Ser Pro Thr Phe
ate gac gcc gcc lie Asp Ala Ala 40
tac cgc犯a tec Tyr Arg Lys Ser 55
ttc ggc caa ttc Phe Gly Gin Phe 70
ate act cac tec lie Thr His Ser 85
get cgt ttc ttc
aaa ccc etc att tct Lys Pro Leu lie Ser 10
etc att tec ccg ccg Leu lie Ser Pro Pro 25
c犯ate ttc gat tac Gin lie Phe Asp Tyr 45
tct get etc aaa ate Ser Ala Leu lys lie 60
etc tec aaa acc cta Leu Ser Lys Thr Leu 75
cgc tec gat tac tec Arg Ser Asp Tyr Ser 90
gat aac cct cac gat
cca ccc aat 48 Pro Pro Asn 15
cga tct ctt 96 Arg Ser Leu 30
gaa acc caa 144 Glu Thr Gin
gcc gtc ttg 192 Ala Val Leu
att cga cac 240 lie Arg His 80
gac gcc gca 288 Asp Ala Ala 95
etc tgt gaa 336Asn Ser lie Gly Ala Arg Phe Phe Asp Asn Pro His Asp Leu Cys Glu
100 105 110
caa cat ccc gac gtt gtc etc etc tgt acc tea ate etc tec aca gaa 384 Gin His Pro Asp Val Val Leu Uu Cys Thr Ser lie Leu Ser Thr Glu
115 120 125
tea gtc etc aga tea ttc cct ttc caa cgt etc cgt cgt age aca etc 432 Ser Val Uu Arg Ser Phe Pro Phe Gin Arg Leu Arg Arg Ser Thr Leu
130 135 140
ttc gtc gat gtt etc tec gtt aag gaa ttc cca aaa gcc etc ttc att 480 Phe Val Asp Val Leu Ser Val Lys Glu Phe Pro Lys Ala Leu Phe lie 145 150 155 160
aaa tac ctt cct aag gag ttt gac att etc tgt act cat cca atg ttt 528 Lys Tyr Leu Pro Lys Glu Phe Asp lie Leu Cys Thr His Pro Met Phe
165 170 175
gga cct gag agt ggt aag cat tct. tgg tct ggc ttg ccc ttt. gtc tac 576 Gly Pro Glu Ser Gly Lys His Ser Trp Ser Gly Leu Pro Phe Val Tyr
180 185 190
gat aag gtg aga ate gga gac gca get tea aga caa gag agg tgt gag 624 Asp Lys Val Arg lie Gly Asp Ala Ala Ser Arg Gin Glu Arg Cys Glu
195 200 205
aag ttt eta aga att ttt gag aat gaa ggt tgc aag atg gtt gaa atg 672 Lys Phe Leu Arg lie Phe Glu Asn Glu Gly Cys Lys Met Val Glu Met
210 215 220
age tgt gag aag cat gat tat tac gca get gga teg caa ttc gtg acg 720 Ser Cys Glu Lys His Asp Tyr Tyr Ala Ala Gly Ser Gin Phe Val Thr 225 230 235 240
cat act atg gga agg gtt ttg gag aaa tat gga gtt gag tct teg ccg 768 His Thr Met G〗y(tǒng) Arg VaLeu G〗u Lys 丁yr Gy Val Gu Ser Ser Pro
245 250 255
att aac acc aaa ggt tat gag acg "ttg ttg gat ttg gtg gag aac aca 816 lie Asn Thr Lys Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asp Leu Val Glu Asn Thr
260 265 270
tcg agt gat age ttt gag ctt ttc tac ggt ttg ttt atg tat aat ccg 864 Ser Ser Asp Ser Phe Glu Leu Phe Tyr Gly Leu Phe Met Tyr Asn Pro
275 280 285
aat get ctt gaa cag ttg gag aga ttg gat atg get ttt gag tct gtt 912 Asn Ala Leu Glu Gin Leu Glu Arg Leu Asp Met Ala Phe Glu Ser Val
290 295 300
aag aag gag ctg Ut ggg aga tta cat cag caa tac agg aag caa atg 960 Lys Lys Glu Leu Phe Gly Arg Leu His Gin Gin Tyr Arg Lys Gin Met 305 310 315 320
ttt ggt ggg gag gtt caa tcg ccc aag aaa act gag cag aaa ttg etc 1008 Phe Gly Gly Glu Val Gin Ser Pro Lys Lys 丁hr Glu Gin Lys Leu Leu
325 330 335
aat gat ggt ggt gtt gtt cct atg aat gat ata tea tea tea tea tea 1056 Asn Asp Gly Gly Val Val Pro Met Asn Asp lie Ser Ser Ser Ser Ser
340 345 350
tea tea tea tea tea tct taa 1077 Ser Ser Ser Ser Ser Ser 355
35<210> 9 <211〉 358 〈212〉 PR丁
<213>擬南芥(Arabid叩sis thaliana)
<400> 9 Met Leu
Leu His
1
Leu
Arg
Leu
Gly 65 Gly
Asn
Gin
Ser
Phe 145 Lys
Gly
Asp
Lys
Ser 225 His
lie
Ser
Asn
Lys 305 Phe
Asn
Ser
Arg
lie
l'ys 50 Phe
His
Ser
His
Val 130 Val
Tyr
Pro
Lys
Phe 210 Cys
Thr
Asn
Ser
Ala 290 Lys
Gly
Asp
Ser
Arg
Arg 35 Ser
Gly
Asp
lie
Pro 115 Leu
Asp
Leu
Glu
Val 195 Leu
Glu
Met
Thr
Asp 275 Leu
Glu
Gly
Gly
Ser
Asn 20 Ala
Glu
Asn
Leu
Gly 100 Asp
Arg
Val
Pro
Ser 180 Arg
Arg
Lys
Gly
Lys 260 Ser
Glu
Leu
Glu
Gly 340 Ser
Phe 5
Ser
lie
Tyr
Phe
lie 85 Ala
Val
Ser
Leu
Lys 165 Gly
lie
lie
His
Arg 245 Gly
Phe
Gin
Phe
Val 325 Val
Ser
Ser
Pro
Asp
Arg
Gly 70 Thr
Arg
Val
Phe
Ser 150 Glu
Lys
Gly
Phe
Asp 230 Val
Tyr
Glu
Leu
Gly 310 Gin
Val
Ser
Pro
Thr
Ala
Lys 55 Gin
His
Phe
Leu
Pro 135 Val
Phe
His
Asp
Glu 215 Tyr
teu
Glu
Leu
Glu 295 Arg
Ser
Pro
Ala
Phe
Ala 40 Ser
Phe
Ser
Phe
Leu 120 Phe
Lys
Asp
Ser
Ala 200 Asn
Tyr
Glu
Thr
Phe 280 Arg
Leu
Pro
Met
Lys
Leu 25 Gin
Ser
Leu
Arg
Asp 105 Cys
Gin
Glu
lie
Trp 185 Ala
Glu
Ala
Lys
Leu 265 Tyr
Leu
His
Lys
Asn 345
Pro 10 lie
lie
Ala
Ser
Ser 90 Asn
Thr
Arg
Phe
Leu 170 Ser
Ser
Gly
Ala
Tyr 250 Leu
Gly
Asp
Gin
Lys 330 Asp
Leu
Ser
Phe
Leu
Lys 75 Asp
Pro
Ser
Leu
Pro 155 Cys
Gly
Arg
Cys
Gly 235 Gly
Asp
Leu
Met
Gin 315 Thr
lie
lie
Pro
Asp
Lys 60 Thr
Tyr
His
lie
Arg 140 Lys
Thr
Leu
Gin
Lys 220 Ser
Val
Leu
Phe
Ala 300 Tyr
Glu
Ser
Ser
Pro
Tyr 45 lie
Leu
Ser
Asp
Leu 125 Arg
Ala
His
Pro
Glu 205 Met
Gin
Glu
Val
Met 285 Phe
Arg
Gin
Ser
Pro
Arg 30 Glu
Ala
lie
Asp
Leu 110 Ser
Ser
Leu
Pro
Phe 190 Arg
Val
Phe
Ser
Glu 270 Tyr
Glu
Lys
Lys
Ser 350
Pro 15 Ser
Thr
Val
Arg
Ala 95 Cys
Thr
Thr
Phe
Met 175 Val
Cys
Glu
Val
Ser 255 Asn
Asn
Ser
Gin
Leu 335 Ser
Asn
Leu
Gin
teu
His 80 Ala
Glu
Glu
Leu
lie 160 Phe
Tyr
Glu
Met
Thr 240 Pro
Thr
Pro
Val
Met 320 Leu
Ser355
<210〉 10 <211〉 1476 <212〉瞧
<213>灰綠云杉(Picea glauca)
<220〉
<221> CDS
<222〉 (96),. (980)
<400〉 10
accagtttta gatattcatc aaggtcttgc ctgctttgtt ttaggcaatt ccctccagta 60 ccaagccctc ttctcagaaa actccctccg cggca atg cct ctt cat ttc tea 113
Met Pro Leu His Phe Ser 1 5
tgg aat cca aca gaa gac cct cac aca gta cgc cct act gag get etc 161 Trp Asn Pro Thr Glu Asp Pro His Thr Val Arg Pro Thr Glu Ala Leu
10 15 20
agg aat cag age aat gga cgt cgc ggg gcc cct cga tta aga aga ata 209 Arg Asn Gin Ser Asn Gly Arg Arg Gly Ala Pro Arg Leu Arg Arg lie
25 30 35
aaa tec att aaa tat tgg cat cgt agg gtt tgg aaa eta cca ccei att 257 Lys Ser lie Lys Tyr 丁rp His Arg Arg Val 丁rp Lys Leu Pro Pro lie
40 45 50
tct ggt gaa aac cat ggt gaa gcc ggg cca ccc ggt get cgc cca ttc 305 Ser Gly Glu Asn His Gly Glu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Arg Pro Phe 55 60 65 70
cag gac gga eta tac gga ggc cac tgc gag ate ggg gtt caa ttc ttc 353 Gin Asp Gly Leu Tyr Gly Gly His Cys Glu lie Gly Val Gin Phe Phe
75 80 85
aga gac gcg gac gat ttc tgc gaa gag cat cca gag ate ata ctg atg 401 Arg Asp Ala Asp Asp Phe Cys Glu Glu His Pro Glu lie lie Leu Met
90 95 100
tgc gca tec ate act ttg gtg gga gga cgt get gaa gtc tct gcc aac 449 Cys Ala Ser lie Thr Leu Val Gly Gly Arg Ala Glu Val Ser Ala Asn
105 110 115
aca gcg cct gaa gag gag tac get ttt cgc aga cgt cct gtc tgt gaa 497 Thr Ala Pro Glu Glu Glu Tyr Ala Phe Arg Arg Arg Pro Val Cys Glu
120 125 130
aga gtt tec gca ccg gtt gtt cct gca ggt ttt gtc gcc cga gtc gat 545 Arg Val Ser Ala Pro Val Val Pro Ala Gly Phe Val Ala Arg Val Asp 135 140 145 150
gtg ctg tgc act cat ccc atg ttt ggt cca gag age age aag gac gat 593 Val Leu Cys Thr His Pro Met Phe Gly Pro Glu Ser Ser Lys Asp Asp
155 160 165
ttg ggc gac etc cct ttc gtt tac gat aag gtt agg gtt tct aac gaa 641 Leu Gly Asp Leu Pro Phe Val Tyr Asp Lys Val Arg Val Ser Asn Glu
170 175 180
ggt ttg aga gcc aag cac tgc gag cgt ttt etc eiac ata ttt teg tgc 689 Gly Leu Arg Ala lys His Cys Glu Arg Phe Leu Asn lie Phe Ser Cysgag Glu
gtc Val 215 鄉(xiāng) Arg
tta Leu
t^t Tyr
tta Leu
ggc Gly 200 gcg Ala
ctg Leu
ctg Leu
gga Gly
gat Asp 280
185 tgc Cys
Glu
ggc Gly
g犯 Glu
etc Leu 265 atg Met
egg Arg
Ser
ttg Leu
atg Met
Gin
Glu 235 gcc Ala
gtg Val 250
ttx atg Phe Met
gcg Uc Als Phe
gtc Val
Uc Phe 220 tec Ser
tgg Trp
tat Tyr
sat Asn
gag Glu 205 att lie
set Thr
朋t Asn
aat Asn
tea Ser 285
190 atg Met
teg Ser
ccg Pro
lie
gtc Val 270 etc Leu
tgt Cys
Thr His Thr
att lie
gcc Ala 255 aat Asn
卿
gca gaa Ala Glu 210
get Ala 240
ggg Gly
teg Ser
Asn
gU Vai 225
3CC
Thr
Asp
att lie
哪 Glu
ggg Gly
朋g tys
Ser
g朋 Glu
gtt Val 290
195 cat His
sgg Arg
ggt Gly
tu
Phe
Gin 275 teg Ser
gat Asp
atg Met
城 Tyr
gat Asp 260 ate lie
ggt Gly
cgc tat Arg Tyr
Ug ggg Leu Gly 230
Glu Lys 245
att t3t lie Tyr
gag agg Glu Arg
tea ast Ser Asn
taa gaattttaaa ggtttcgatt tgettgaage ggcttgtgta tgaagtacca
737
785
833
881
929
977
1030
295
tttgtagacaataatgaattcgag犯tgttgttcaagatgaaatggttaa gaaggatggg1090
tctcgtgtgagaagaaaaccaagataaatggttgegtsgtggtccagaaatetgeattea1150
ttactg犯tgattctacatggcattgattgsattccaagacgagtga犯g1210
agtttgatgaatggaatatgtctgtattccaaatttaata aatgaaaaatattgeaggtt1270
getatatgeaatggttcttctatatccccgaaggaca犯tgacagatataagttctctgg1330
C3CttgtC3g犯aacttctatgtttgtagctttccgaaagtggaactttt1390
ctagaacttatagggg犯ataatccctatgcaaacactgtatgagtcccattgacctttc1450
tttctcatttcatttcatttttgtct1476
<210〉 11
〈211〉 294
<212〉 PRT
〈213〉灰綠云杉(Picea
glauca)
<■〉 11 Met Pro Leu
1
Arg
Pro
Trp
Pro 65 工le
Pro
Pro Arg
50 Gly
Gly
Glu
Thr
Leu 35 Leu
Ala
Val
lie
His Phe Ser Trp Asn Pro Thr Glu Asp Pro His Thr Val
5 10 15
Glu Ala Leu Arg Asn Gin Ser Asn Gly Arg Arg Gly Ala
20 25 30
Arg Arg lie Lys Ser lie Lys Tyr Trp His Arg Arg Val
40 45 Pro Pro lie Ser Gly Glu Asn His Gly Glu Ala Gly Pro
55 60 Arg Pro Phe Gin Asp Gly Leu Tyr 。y Gly His Cys Glu 70 75 80
Gin Phe Phe Arg Asp Ala Asp Asp Phe Cys Glu Glu His
85 90 95
lie Leu Met Cys Ala Ser lie Thr Leu Val Gly Gly Arg 100 105 110
38Ala Glu Val Ser Ala Asn Thr Ala Pro Glu Glu Glu Tyr Ala Phe Arg
115 120 125
Arg Arg Pro Val Cys Glu Arg Val Ser Ala Pro Val Val Pro Ala Gly
130 135 140
Phe Val Ala Arg Val Asp Val Uu Cys 丁hr His Pro Met Phe Gly Pro 145 150 155 160
Glu Ser Ser Lys Asp Asp Leu Gly Asp Leu Pro Phe VaTyr Asp Lys
165 170 175
Val Arg Val Ser Asn Glu Gly Leu Arg Ala Lys His Cys Glu Arg Phe
180 185 190
Leu Asn lie Phe Ser Cys Glu Gly Cys Arg Met Val Glu Met Ser Cys
195 200 205
Ala Glu His Asp Arg Tyr Val Ala Glu Ser Gin Phe lie Thr His Thr
210 215 220
Val Gly Arg Met Leu Gly Arg Leu Gly Leu Glu Ser Thr Pro lie Ala 225 230 235 240
Thr Lys Gly Tyr Glu Lys Leu Leu Glu Val Ala Trp Asn lie Ala Gly
245 250 255
Asp Ser Phe Asp lie Tyr Tyr Gly Leu Phe Met Tyr Asn Val Asn Ser
260 265 270
lie Glu Gin lie Glu Arg Leu Asp Met Ala Phe Asn Ser Leu Lys Asn
275 280 285
Glu Val Ser Gly Ser Asn 290
〈210> 12 <211> 840 <212〉陽
<213〉集胞藻屬(Synechocystis sp.)
<220〉 <221> CDS <222〉 (1). ， (840)
<400〉 atg Eaa Met Lys 1
gga gac Gly Asp
C犯3gC
Gin Ser
ggt c犯 Gly Gin 50
act cct Thr Pro
65 eta tcg
12
lie
ttg Leu
Thr 35
Asp
ata lie
ggt Gly
cgt Arg 20 tgt Cys
Val 5
cgt Arg
g犯 Glu
tta tct Leu Ser
caa tta Gin Leu
gcc
gtt ggt
Val Gly
egg ggc Arg Gly
犯￡1 gC3
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att lie 70
ttg ggt Leu Gly
cat His
gtg Val 40
etc Leu 55 ttg Leu
tat Tyr 25 g犯 Glu
Gin Thr
cct Pro
Thr
gtc act gat
Ua aU Leu lie 10
ttg att Leu lie
Arg Gin
gca a犯 Ala Lys
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gtg gcc
ggg get Gly Ala
ggg gtt Gly Val
ttg gtg Leu Val 45
ata att lie lie 60 aag ctt lys leu
tec Ser
tct Ser 30 gat Asp
Ug Leu 15 egg Arg
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gcg Ala
Gin
gcg Ala
48
96
144
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att ccc cat 240 lie Pro His 80
tct gts a犯acg gcg 288Leu Ser Pro Thr
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ccc. atg Pro Met
Ua tU Leu Phe 130 cca gag Pro Glu 145
Lys lie
3tt tec lie Ser
gcc ggt Ala Gly
agt tcg Ser Ser 210 ttg ggc Leu Gly 225
ttg
Leu Gin
gag Glu
gcc Ala 115 gtx Val
ccg Pro 100 ggc Gly
Asn
c犯ttg Gin Leu
tac etc Tyr丄eu
cat His
g朋 Glu 195 ggt Gly
tta Leu 180 s犯 Lys
ttt Phe
acc atg Thr Met
g3C t3t
Asp Tyr
Asn Gin Gin
g3t egg Asp Arg
gac Asp 275
tgg Trp 260 犯g Lys
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lie Val Thr Asp Val Ala Ser Val 90
tct ggg ttc att Ser Gly Phe lie
agt Ser
get Ala
tgc Cys 165 cct Pro
atg Met
cgt Arg 245 cct Pro
Gin
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aca gcg Thr Ala
get ccc Ala Pro
tgt Cys 150 act Thr
gta Val
印t ggg Asp Gly
egg gat Arg Asp
Ala 230
C3g
Gin Glu
tat gtt Tyr Val
gcc Ala
tat Tyr 135 tta Leu
Pro
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Asp
Thr 215 acc Thr
His
etc Leu
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cag Gin 120 gtg Val
tgg Trp 105 ggc Gly
etc Leu
cgt tea Arg Ser
gca gac Ala Asp
gtg
Val
att lie 200 agt Ser
agt Ser 185 etc Leu
egg
3tC gac
lie Asp
set ccc Thr Pro
gtg ttg Val Leu 155 cat gac His Asp 170
get get Ala Ala
Lys Leu
gtg gga Val Gly
tat貼c Tyr Asn
ggg gcg Gly Ala 125
3CC g33
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gaa ccc Glu Pro
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tta ate Leu lie
gCC
Ala Gin 205 ggc ggc Gly Gly 220
get ttg Ala Leu
ctg Leu
His taa 280
g3t
Asp
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caa egg Gin Arg 235 cag eta Gin Leu 250
ctt tta caa caa Leu Leu Gin Gin
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ggt ggt cac Gly Gly His 110
gaa gaa犯t Glu Glu Asn
tat act gac Tyr Thr Asp
ctg ggg gta Leu Gly Val 160
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caa gcc tgt Gin Ala Cys 190
朋t ttg gcc Asn Leu Ala
aac ccg gag Asn Pro Glu
eta aaa郞t Leu Lys Ser 240
eta att agt leu lie Ser
255 acc aac ggc Thr Asn Gly 270
336
384
432
480
528
576
624
672
720
768
816
840
<210〉 13 〈211〉 279 <212〉 PRT
<213〉集胞藻屬(Synechocystis sp.)
〈400〉 13
Met Lys lie Gly Val Val Gly Leu Gly Leu lie Gly Ala Ser Leu Ala
15 10 15
Gly Asp Leu Arg Arg Arg Gly His Tyr Leu lie Gly Val Ser Arg Gin
20 25 30
Gin Ser Thr Cys Glu Lys Ala Val Glu Arg Gin Leu Val Asp Glu Ala 35 40 45
40Gly Gin 50
Thr Pro 65 Leu Ser
lie Ala
Pro Met
Leu Phe 130 Pro Glu 145
Lys lie
Asp
lie
Pro
Glu
Ala 115 Val
Gin Tyr lie Ser His
Ala Gly
Ser Ser 210 Leu Gly 225
Leu Gin
Glu 195 Gly
Thr Asp Asn Gin Gin
Asp Arg
Asp 275
Leu
Gin
Thr
Pro 100 Gly
Asn
Leu
Leu
Leu 180 Lys
Phe
Met
Tyr
Trp
Lys
Ser
Leu
Ala 85 Ala
丁hr
Ala
Ala
Cys 165 Pro
Asp
Arg
Met
Arg 245 Pro
丁yr
Leu
lie 70 lie
Ser
Ala
Pro
Cys 150 丁hr
Val
Gly
Asp
Ala 230 Gin
Glu
Val
Leu 55 Leu
Val
Gin
Ala
Tyr 135 Leu
Pro
Met
Asp
Thr 215 Thr
His
leu
Glu
Gin
Pro
Thr
Leu
Gin 120 Val
/\rg
Ala
Val
lie 200 Ser
丁yr
Leu
His
Thr
Thr
Asp
Trp 105 Gly
Leu
Ser
Asp
Ser 185 Leu
Arg
Asn
Asp
Arg 265
Aia
Leu
Val 90 Ser
lie
Thr
Val
His 170
Ala
lys
Val
Gin
Gin 250 Leu
Lys
lie lie Phe 60
Lys Leu lie
Glu
75
Aid Ser Vsl l>ys
Gly
Asp
Pro
leu 155 Asp
Ala
Leu
Gly
Arg 235 Leu
Leu
Phe lie Gly 110
Gly Ala Glu 125
Thr Glu Tyr 140
Glu Pro Leu
Gin Ala Val
Leu lie Gin 190
Ala Gin Asn
205 Gly Gly Asn 220
Ala Leu Leu
lie Thr Leu
Gin Gin Thr 270
Leu
Pro
Thr 95 Gly
Glu
Thr
Gly
Ala 175
Ala
Leu
Pro
Lys
lie 255 Asn
Cys
His 80 Ala
His
Asn
Asp
Val 160 Trp
Cys
Ala
Glu
Ser 240 Ser
Gly
<210〉 14
<211> 1359 <212>薩
<213〉釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<220>
〈221> CDS
〈222〉 (1).. (1359)
〈400〉 14
atg gta tea gag gat aag att gag c犯 Met Val Ser Glu Asp Lys lie Glu Gin
1 5 ggt ata att ggt ctg ggt gat atg ggc Gly lie lie Giy Leu Gly Asp Met Gly 20 25 ac3 gat get gga tgg ggt gtt ata tgt Thr Asp Ala Gly Trp Gly Val lie Cys
35 40 gat gaa ctg犯a gaa aaa tat gcc tea
tgg aaa gcc aca aaa gtc att 48 Trp Lys Ala Thr Lys Val lie
10 15 eta tta tac get aat aaa ttt 96 Leu Leu Tyr Ala Asn Lys Phe 30
tgt gat agg gaa g犯tat tat 144 Cys Asp Arg Glu Glu Tyr Tyr 45
get aaa ttc gaa ctg gtg aaa 192Asp
￡131
Asn 65
Glu
卿 I'ys
a_tc lie
Glu 50 ggt Gly
gca Ala
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Leu Lys Glu Lys
gtg cat Val His 130 gtt att Val lie 145
83t tCt
Asn Ser
g犯gsg Glu Glu
get ttc Ala Phe
tgg act Trp Thr 210 gtt aat Vsl Asn 225
Gly Leu Ala Thr Gin Glu
犯g C3t
Lys His 290 tcg eta Ser Leu 305
ccg aat
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gga Gly
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tec Ser
ttg Leu
Asn
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tta !>eu 195 ctg Leu
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Thr
245
Thr
gat Asp
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tea aaa age age Ser I>ys Ser Ser 310
tC3 Cat tt3 tea
丁yr 55 agg Arg
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Gin
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Asn
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aga Arg
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Tyr
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tac 丁yr
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Asn
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get Ala
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Gin
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gtt Val
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ggc Gly
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eta Leu 220 tgg Trp
Gin
atg ata Met lie
犯g cas Lys Gin
gat gac Asp Asp
Thr
Asn
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gga cca Gly Pro
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ggc caa Gly Gin
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tat ttg Tyr Leu
gtg Val
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Glu
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Pro
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gtt Val 160 Ut Tyr
get Ala
cct Pro
Gin
255
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g￡ Glu
ttt gga Phe Gly
Lys 丁yr
Pro
Asn 315
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gtg Val 320
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336
384
432
■
528
576
624
672
720
768
816
864
912
960
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ctt ggt Leu Gly
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tta gaa Leu Glu 370 gat gst Asp Asp 385
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Leu Ser Leu Leu Ala lie 325 330 cca tat gat cat atg att Pro Tyr Asp His Met lie
ggt gtg tec Gly Val Ser
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ttt Phe 405 cca Pro
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gtt Val 390 gat Asp
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lie
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tgt tcg acg cca tta Cys Ser 丁hr Pro Leu
Pro
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cU Leu
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ttt cag Phe Gin
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Thr
Pro 350 cct Pro
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Gin
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Leu
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agt Ser
ggc Gly 430 gcc Ala
gtt Val
gtt Val 415 犯c Asn
get Ala
gtt Val 400 ca^ Gin
gag Glu
Glu
1056
1104
1152
1200
1248
1296
1344
1359
<210〉 15
<211> 452
<212〉 PRT
<213〉酉良酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
<400〉 15
Met Val Ser Glu Asp Lys lie Glu Gin Trp Lys Ala Thr Lys Vai lie
15 10 15
Gly lie lie Gly Leu Gly Asp Met Gly Leu Leu Tyr Ala Asn Lys Phe
20 25 30
Thr Asp Ala Gly Trp Gly Val lie Cys Cys Asp Arg Glu Glu Tyr Tyr
35 40 45
Asp Glu Uu Lys Glu Lys Tyr Ala Ser Ala L^s Phe Glu Leu Val Lys
50 55 60
Asn Gly His Leu Vai Ser Arg Gin Ser Asp Tyr lie lie Tyr Ser Val 65 70 75 80
Glu Ala Ser Asn lie Ser Lys lie Val Ala Thr Tyr Gly Pro Ser Ser
85 90 95
Lys Val Gly Thr lie Val Gly Gly Gin Thr Ser Cys Lys Leu Pro Glu
100 105 110
lie Glu Ala Phe Glu Lys Tyr Leu Pro Lys Asp Cys Asp lie lie Thr
115 120 125
Val His Ser Leu His Gly Pro Lys Val Asn Thr Glu Gly Gin Pro Leu 130 135 140Val 145 Asn
Glu
Ala
Trp
Val 225 Gly
Ala
Gin
Lys
Ser 305 Pro
Leu
Arg
Leu
Asp 385 Ser
Lys
Met
lie
Glu
Phe
Thr 210 Asn
Leu
Thr
Glu
His 290 Leu
Asn
Gly
lie
Glu 370 Asp
Phe
Phe
lie
Arg 450
lie Asn His His
Met
Leu 195 Leu
lie
Ala
Ser
Leu 275 Thr
Ser
Ser
lie
Phe 355 Gin
Leu
Ala
Phe
Lys 435 Asn
Asp 180 Ser
Gly
Ser
lie
Ala 260 丁hi'
Gly
Lys
His
Asp 340 Leu
Thr
Glu
Asn
Glu 420 Thr
Thr
A. la 165
Met
Val
Leu
Thr 245 Thr
Asp
Leu
Ser
Leu 325 Pro
Gly
lie
Phe
Phe 405 Pro
lie
Arg 150
Cys
lie
Gly
Asn
Arg 230 Asn
Glu
Arg
Leu
Ser 310 Ser
Tyr
Val
Asp
Val 390 Asp
Met
Leu
Ser
Leu
Thr
Ser
lys 215 lie
Pro
Leu
Leu
Leu 295 lie
Leu
Asp
Ser
Ala 375 lie
lie
Leu
Ser
Gin
Lys
Ala
Ala 200 Trp
Tyr
Ser
Phe
Leu 280 leu
Gly
Leu
His
Glu 360 Ala
Ser
Tyr
Pro
His 440
丁yr
Pro Glu Ser Phe 155
Lys Gin Val Tyr 170
Thr Gin Ala Val
Asp 185
Trp Ala Lys lie Lys 205 Glu
Tyr Ser Ala
Gly Gly Leu 220
Asn Lys Trp
235 His Gin Gin 250
Leu Met lie
Ser 265
Lys Ala Lys Gin
Asp Asn Ala
Met
345 Tyr
lie
Ala
Lys
Glu 425 Ser
Asp Thr lie 300
Ser Asn Asn
315 lie Val Asp 330
lie Cys Ser
Leu Phe Leu
His Asp Lys 380
Arg Glu Trp
395 Lys Gin Phe 410
Ala Asn Leu Ser Asp Arg
His
lie
Asp
Phe 285 Leu
Cys
Ser
Thr
Lys 365 Ser
Ser
Gin
lie
Ser 445
Glu
Leu
Thr 190 lie
Asn
Val
Leu
Asn 270 Val
Glu
Lys
Trp
Pro 350 Pro
Phe
Ser
Ser
Gly 430 Ala
Phe
Thr 175 His
Tyr
Val
Tyr
Gin 255 Lys
Phe
Lys
Pro
Phe 335 [>eu
Gly
lie
Val
Val 415 Asn
Ala
Val 160 Tyr
Ala
Pro
Lys
Ala 240 Tyr
Glu
Gly
Tyr
Val 320 Gin
Phe
Leu
Lys
Val 400 Gin
Glu
Glu
<210〉 16 〈211> 1116 〈212〉 DNA
<213〉枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)
<220〉
<221> CDS
<222〉 (1).. (1116)
<400> 16atg Met 1
ggc Gly
aat Asn
ggt Gly
C犯3tg
Gin Met
att ate lie lie
Leu
g站 Glu 65 atg Met
acg Thr
gtg Val
tea Ser
Ala 145 gaa Glu
ggc Gly 50
Ala
ctt Leu
gat Asp
ctg Leu
cat His 130 ttt Phe
cag Gin
Asn
lie 225 tta Leu
ctg Leu 210
Thr
cat His
tcg Ser
Gly 35 gtg
att lie 20 ate lie
sts lie
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Pro 115 犯s Lys
tat Tyr
tta Leu
gga Gly 100 age Ser
tea Ser
stt lie
atg tcg Met Ser
ccg cat Pro His
gaa att Glu lie
Pro
att lie 195
tat Tyr
agg Arg
aat Asn
gac Asp
gag Glu 180 gta Val
ccg Pro
lie
Lys 260
5
gcc Ala
gat Asp
eta Leu
get aca Ala Thr
g貼gag Glu Glu
gta Val
ctg [,eu 85 郎c Ser
ate lie 70 get Ala
Thr
cgc tat Arg Tyr
gga gtg Gly Val
Leu
Asn 165 gag Glu
Thr 150 ctg Leu
cat His
gca Ala
Asp 245 ate lie
tea Ser 230 犯a Lys
cgt
aca ats Thr lie
gcc ate Ala lie
gac ate Asp lie
gac gat Asp Asp
tct Ser
cgt Arg 55
lie
gat Asp 40 get Ala
gcg Ala
cat tea His Ser
caa Lys Gin
gca get Als Ala
ctt gtt Leu Val
Gin
gcc Ala 135
CC3
Pro
ctg Leu
gat Asp
age Ser
卿
215 age Ser
ate lie
Thr
ttt Phe 120 get Ala
ggc Gly
aag 匕ys
ggc Gly
ctt leu 200 cgt Arg
3gc Ser
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etc leu 10 3站 Lys
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tcg Ser
cct Pro
3tt
lie 90 gtg Val
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ggt Gly
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gcg gta Ala Val
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Gin Lys
3Cg
Thr 170
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ttt Phe
gtt Val 75 g犯 Glu
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Gin Thr
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Tyr
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ttg Leu 15 犯a Lys
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48
96
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192
240
288
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384
432
480
528
576
624
672
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tat gat Tyr Asp 300 ats ￡ica lie Thr 315
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864
912
960
1008
1056
1104
1116
<210> 17
〈211〉 371
<212> PRT
<213〉枯草芽孢桿菌(Bacillus subtiiis)
<400〉 17 Met Asn 1
Gly
lie
Leu
Glu 65 Met
Thr
Val
Ser
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Met
Gly
lie
Gly 50 Ala
leu
Asp
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Gin
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Leu
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lie 20 I]e
lie
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lie
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Asp
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Gly
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Asp
Leu
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Asp
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lie
lie
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Ala
Ser
Gin
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Gly
Lys
Gly
Leu
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Asp
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Ala
Gin
Gly
Val
Leu 10 Lys
Gin
Ser
Pro
lie 90 Val
Gly
匕ys
Lys
Ala Gly Leu
Asn His Pro
Ala Val Ala 45
Phe lie Ser 60
Val Glu Gin 75
Glu His Glu
Val Asp Tyr
Gly His Pro 125
Glu Phe Leu
140 Thr Asp Lys 155
Asn Ala His
Thr 170
Thr Ser Val lie
Gly
Gly 30 Ala
Gly
Thr
leu
Ala 110 Met
Phe
Gin
Phe
Ser
Leu 15 Lys
Leu
Val
Leu
Leu 95 Asp
Ala
Glu
Ala
Val 175 His
lie
Arg
Lys
Lys
Val 80 lie
Gin
Gly
Asn
Val 腦 Glu
Phe180 185 190
Pro His lie Val Ala Ala Ser Leu Val His Gin Thr His His Ser Glu
195 200 205
Asn Leu Tyr Pro Leu Val Lys Arg Phe Ala Ala Gly Gly Phe Arg Asp
210 215 220
lie Thr Arg lie Ala Ser Ser Ser Pro Ala Met Trp Arg Asp lie Leu 225 230 235 240
Leu His Asn Lys Asp Lys lie Leu Asp Arg Phe Asp G]u 丁rp lie Arg
245 250 255
Glu lie Asp Lys lie Arg Thr Tyr Val Glu Gin Glu Asp Ala Glu Asn
260 265 270
Leu Phe Arg Tyr Phe Lys Thr Ala Lys Asp Tyr Arg Asp Gly Leu Pro
275 280 285
Leu Arg Gin Lys Gly Ala lie Pro Ala Phe Tyr Asp Leu Tyr Val Asp
290 295 300
Val Pro Asp His Pro Gly Val lie Ser Glu lie Thr Ala lie Leu Ala 305 310 315 320
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325 330 335
Asp lie Asn Gly lie Leu Arg lie Ser Phe Gin Ser Asp Asp Asp Arg
340 345 350
Lys Arg Ala Glu Gin Cys lie Glu Ala Arg Ala Glu Tyr Glu Thr Phe
355 360 365
Tyr Ala Asp 370
〈210〉 18 <212〉 DNA
<213〉大腸桿菌(Escherichia coli)
<220>
<221〉 CDS
〈222〉 (1)., (1122)
<400〉 18
atg gU get g犯
Met Val Ala Glu
aaa gcg ctg ctg Lys Ala Leu Leu 20
gtg ggc gag gtg Val Gly Glu Val 35
cgc gag gca tct Arg Glu Ala Ser 50
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ttg acc gca tta Leu Thr Ala Leu 5
aat tta tta gcg Asn Leu Leu Ala
aaa age cgc ttt lys Ser Arg Phe 40
atg Ug gcc teg Met Leu Ala Ser 55
gat ctg att gag Asp Leu lie Glu 70
cgc gat c犯3tt gst Arg Asp Gin lie Asp 10
aag cgt ctg gaa ctg Lys Arg Leu Glu Leu 25
gga ctg cct att tat Gly Leu Pro lie Tyr 45
cgt cgt gca gag gcg Arg Arg Ala Glu Ala 60
gat gtt Ug cgt egg Asp Val Leu Arg Arg 75
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gtt get gaa 96 Val Ala Glu 30
gtt ccg gag 144 Val Pro Glu
gaa get ctg 192 Glu Ala Leu
gtg atg cgt 240 Val Met Arg 80
47gaa tct tac tec agt gaa aac gac aaa gga ttt a犯aca ctt tgt ccg 288 Glu Ser Tyr Ser Ser Glu Asn Asp Lys Gly Phe Lys Thr Leu Cys Pro
85 90 95
tea ctg cgt ccg gtg gtt ate gtc ggc ggt ggc ggt cag atg gga cgc 336 Ser Leu Arg Pro Val Val lie Val Gly Gly Gly Gly Gin Met Gly Arg
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
atg gtg att gtt agt gtg cca ate esc gtt act g兆ess gtt att ggc 480 Met Val Ie Val Ser Val Pro lie His Val Thr Glu Gin Val lie Gly 145 150 155 160
aaa tta ccg cct tta ccg aaa gat tgt att ctg gtc gat ctg gca tea 528 Lys Leu Pro Pro Leu Pro Lys Asp Cys lie Leu Val Asp Leu Ala Ser
165 170 175
gtg aaa aat ggg cca Ua cag gcc atg ctg gtg gcg cat gat ggt ccg 576 Val Lys Asn Gly Pro Leu Gin Ala Met Leu Val Ala His Asp Gly Pro
180 185 190
gtg ctg ggg eta cac ccg atg ttc ggt ccg gac age ggt age ctg gca 624 Val Leu Gly Leu His Pro Met Phe Gly Pro Asp Ser Gly Ser Leu Ala
195 200 205
aag caa gtt gtg gtc tgg tgt gat gga cgt aaa ccg gaa gca tac caa 672 Lys Gin Vai Val V'al Ti，p Cys Asp Gly Arg Lys Pro Glu Ala Tyr Gin
210 215 220
tgg ttt ctg gag caa att cag gtc tgg ggc get egg ctg cat cgt att 720 Trp Phe Leu Glu Gin lie Gin Val Trp Gly Ala Arg Leu His Arg lie 225 230 235 240
age gcc gtc gag cac gat cag aat atg gcg Ut att cag gca ctg cgc 768 Ser Ala Val Glu His Asp Gin Asn Met Ala Phe lie Gin /Ua Leu Arg
245 250 255
cac ttt get act ttt get tac ggg ctg cac ctg gca gaa gaa aat gtt 816 His Phe Ala Thr Phe Ala Tyr Gly Leu His Leu Ala Glu Glu Asn Val
260 265 270
cag ctt gag caa ctt ctg gcg etc tct teg ccg att tac cgc ctt gag 864 Gin Leu Glu G]n Leu Leu Ala Leu Ser Ser Pro lie 丁yr Arg Leu Glu
275 280 285ctg gcg atg gtc ggg cga ctg ttt get cag gat ccg cag ctt tat gcc 912 Uu Ala Met Val Gly Arg Leu Phe Ala Gin Asp Pro Gin Leu Tyr Ala
290 295 300
gac ate att atg teg tea gag cgt aat ctg gcg Ua ate aaa cgt tac 960 Asp lie lie Met Ser Ser Giu Arg Asn Leu Ala Leu lie Lys Arg Tyr 305 310 315 320
tat aag cgt Uc ggc gag gcg att gag "ttg ctg gag cag ggc gat aag 1008 Tyr Lys Arg Phe Gly Glu Ala lie Glu Leu Leu Glu Gin Gly Asp Lys
325 330 335
cag gcg Ut att gac agt Uc cgc aag gtg gag cac tgg ttc ggc gat 1056 Gin Ala Phe lie Asp Ser Phe Arg Lys Val Glu His Trp Phe Gly Asp
340 345 350tac gca cag Tyr Ala Gin 355
aat gac aat Asn Asp Asn 370
cgt ttt cag agt Arg Phe Gin Ser
cgc cag taa Arg Gin
g犯age cgc Glu Ser Arg 360
gtg ttg Val Leu Leu 365
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Gin
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<210〉 19
<211〉 373
<212〉 PRT
<213>大腸桿菌(Escherichia coli)
<400〉 19
Met 1
Lys
Val
Arg
Gly 65 Glu
Ser
Leu
Glu
Met 145
Lys
Val
Val
Lys
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Gin
Leu
Val Ala Glu Ala
Gly
Glu 50 Val
Ser
Leu
Phe
Gin 130 Val
Leu
tys
Leu
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Ala
Phe
Leu
Ala 290
Leu
Glu 35 Ala
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Tyr
Arg
Glu 115 His
lie
Pro
Asn
Gly 195 Val
Leu
Val
Ala
Glu 275 Met
Leu 20 Val
Ser
Pro
Ser
Pro 100 Lys
Asp
Val
Pro
Gly 180 Leu
Val
Glu
Glu
Thr 260 Gin
Val
leu 5
Asn
Lys Ser Arg
Met
Ser 85 Val
Met
Trp
Ser
Leu 165 Pro
His
Val
Gin
His 245 Phe
Leu
Gly
Thr
Leu
Ser
Leu
Leu 70 Glu
Val
Leu
Asp
Val 150 Pro
Leu
Pro
Ala Leu
Ala 55 lie
Asn
lie
Thr
Arg 135 Pro
Lys
Gin
Met
Trp Cys 215 Gin
lie 230 Asp
Ala
Leu
Arg
Gin
丁yr
Ala
Leu 295
Leu
Ala
Phe 40 Ser
Glu
Asp
Val
Leu 120 Ala
lie
Asp
Ala
Phe 200 Asp
Val
Asn
Gly
Leu 280 Phe
Arg Asp 10
Lys Arg
25 Gly Leu
Arg Arg
Asp Val
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Ala Glu Ala 60
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Lys Gly 90
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Cys lie 170 Met Leu 185
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Gly Arg
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Met Ala 250 leu His 265
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lie Val Ala 140
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Leu Vsl Asp
Val Ala His
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220 Ala Arg Leu 235
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Leu Ala Glu
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Glu
Val 30 Val
Glu
Val
Leu
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Asp
Val
Leu
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Ala
His
Ala
Glu 270 Arg
Leu
Val 15 Ala
Pro
Ala
Met
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lie
Ala
lie
Ala 175 Gly
Leu
Tyr
Arg
Leu 255 Asn
Leu
Tyr
Asp
Glu
Glu
Leu
Arg 80 Pro
Arg
Leu
Gly
Gly 160 Ser
Pro
Ala
Gin
lie 240 Arg
Val
Glu
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Gin
Tyr
Asn
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Lys Arg
Ala Phe
Ala Gin 355 Asp Asn 370
Met Ser Ser Glu Arg Asn Leu Ala Leu lie Lys Arg Tyr 310 315 320
Phe Gly Glu /Ua lie Glu Leu Leu Glu Gin Gly Asp Lys
325 330 335
lie Asp Ser Phe Arg Lys Val Glu His T卬Phe Gly Asp 345 350 Glu Ser Arg Val Leu Leu Arg Gin Ala 360 365
340
Arg Phe Gin Ser
Arg Gin
<210〉 20
〈211〉 1152 <212〉纖
<213〉草生歐文氏菌(Envinia herbicola〉
<220〉 <221〉 <222〉
CDS (1).
(1119)
<400〉 20 atg gtg get Val
Met 1
a朋
Val
cgt Arg
ggc Gly 65 gas Giu
gcg Ala
ggt Gly
gag Glu 50 gta Val
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Ala
ctg Leu
gsg Glu 35 gcg Ala
gaa
ctg Leu 20 gtg Val
ctg Leu
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130 gtg Val
ctg Leu
5
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ctg ctg Leu Leu
sgc cgt Ser Arg
Pro
tat 丁yr
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ctg Leu 70 gag Glu
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cgc Arg
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gat Asp 10 cga Arg
ctg Leu
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Tyr 45 gcc Ala
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gtt Val 125 age Ser
cag Gin
gtg Val 30 gtg Val
gaa Glu
gtg Val
etc Leu
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gat Asp
gtg Val
g"ta Val 15 gcc Ala
gat Asp
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lie
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48
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384
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480
50Gin
Val
gta Val
ctg Leu
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get Ala
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ctg Leu
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gcg Ala 290 ate lie
Gin
c&g gcg Gin Ala
His
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ggt Gly 195 gtg Val
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gtg Val
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ctg Leu
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ttt Phe
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cgc Arg
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Asp
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Ser 310
Glu
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ttt Phe
gtc Val
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Ala
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gtc Val
Asn
ggt Gly
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agt Ser
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Asn
g犯 Glu 360
Met 185 ggc Gly
gga Gly
tgg Trp
stg Met
ctg Leu 265 teg Ser
get Ala
Asn
gcg Ala
egg Arg 345 age Ser
an lie 170 ctg Leu
ctg Leu
get Ala
gtc Val
gcc Ala
gst ctg Asp Leu
ccg gac age Pro Asp Ser
柳 Arg
ggt Gly
Ala 250 cat His
Gin
gcg Ala 235 ttc Phe
tta Leu
ccg Pro 220 cgt Arg
att lie
gcc Ala
teg ccc att Ser Pro lie
C3g
Gin
ctg Leu
ctg Leu 330 gtt Val
gat Asp
gcg A丄a 315 ctg Leu
gaa Glu
C3t
His
ggc Gly 205 g犯 Glu
Asn 190 age Ser
gcg Ala
ccg Pro 300 ctg Leu
gag Glu
cag Gin
g犯 Glu
tac Tyr 285 cas Gin
gag Glu 270 egg Arg
etc Leu
3犯 lie Lys
cag ggc Gin Gly
cgei age ctg Arg Ser Leu
tgg Trp
ttg Leu 365
ttt Phe 350 cga Arg
gcg Ala 175 ggg Gly
tea Ser
cct Pro
ctg gca leu Ala
tat cag Tyr Gin
ctg cat Leu Kis
csg gcg Gin Ala
cgt Arg
ctg Leu 255 aac Asn
乙eu
tat Tyr
cgc Arg
ga_c Asp 335 ggc Gly
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gt.c Val
gaa
gcg Ala
tat Tyr 320 卿 lys
g3t
Asp
teg gcc Ser Ala
cca taaaaaaaag gcatccagtt ggatgect" ttt Pro
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576
624
672
720
768
816
864
912
960
1008
1056
1104
1152
<210〉 21
〈211〉 373
<212> PRT
<213〉草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)
<400〉 21
Met Val Ala Glu Leu Thr Ala Leu Arg Asp Gin He Asp Ser Val 15 10 15
AspLys
Val
Arg
Gly 65 Glu
Glu
Leu
Asp
Met 145 Gin
Val
Val
Lys
Trp 225 Ser
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Leu
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Gin
His
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Ser
Leu
Phe
lys 130 Val
Leu
Lys
Leu
Gin 210 Phe
Ala
Phe
Leu
Ala 290 lie
Gin
Ala
Ala
Asp 370
Leu
Glu 35 Ala
Pro
Tyr
Arg
Glu 115 Glu
lie
Pro
Asn
Gly 195
Val
Leu
Val
Ala
Asp 275 Met
lie
Arg
Phe
Lys 355 Ser
Leu 20 Val
Ser
Pro
Thr
Pro 100 Lys
Asp
lie
Pro
Arg 180 Leu
Val
Glu
Glu
Thr 260 Gin
Val
Met
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lie 340 Arg
Asp
Lys
Met
Asp
Ser 85 Val
Met
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Ser
Leu 165 Pro
His
Val
Gin
His 245 Phe
Leu
Gly
Ser
Gly 325 Ala
Phe
Leu Leu Ala Ser Leu
Arg
Leu 70 Glu
Val
Leu
Pro
Val 150 Pro
Leu
Pro
lie 230 Asp
Ala
Leu
Arg
Ser 310 Glu
Ser
Leu
Ala 55 lie
Asn
lie
Gly
Gin 135 Pro
Glu
Gin
Met
Tyr 40 Ser
Trp Cys 215 Gin
Gin
Tyr
Ala
Leu 295 Glu
Ala
Phe
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Glu
Asp
Val
Leu 120
Ala
lie
Asp
Ala
Phe 200 Asp
Val
Asn
Gly
Leu 280 Phe
Ser
lie
Asn
Glu 360
Lys 25 Gly
Arg
Asp
Lys
Gly 105 Ser
Glu
His
Cys
Met 185 Gly
Gly
Trp
Met
Leu 265 Ser
Ala
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Ala
Arg 345 Ser
Arg Leu Glu Leu Leu Pro Arg Lys
Val Leu 75
Gly Phe
90 Gly Lys
Gly Tyr
Thr Leu
Leu Thr 155 lie Leu 170
Leu Ala
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Arg Gin
Gly Ala 235 Ala Phe 250
His Leu Ser Pro Gin Asp
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Leu AI3 315 Leu Leu 330
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Ala
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Ala
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Leu
Glu Gin Gly
Arg Ser
Leu Leu 365
Phe 350 Arg
Ala
Pro
Ala
Met
Cys 95 Gly
Thr
Ala
lie
Ala 175 Gly
Leu
Tyr
Arg
Leu 255 Asn
Leu
Tyr
Arg
Asp 335 Gly
Ser
Glu
Glu
Leu
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Arg
Leu
Gly
Ala 160 Ser
Pro
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lie 240 Arg
Val
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Ala
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<210〉 22 <211〉 1129 <212>脆
〈213>番琉(Lycopersicon esculent咖)〈400> 22
atgttttccctttcatctatacaatctaeic
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aatattcaatctcaatcatc ttcgtcgcta 60atttcaactcggtttcatca ccaccgccta120
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gataaatttt貼gtstttcg240
ctcttatgttgctc犯aata300
tttattgccaaatcctttatcaaacaaggc360
tattccctcaccttaatgtc420
gaacaacatcctgacgttattttactttgc480
cgttcccttcccatcca犯a gcttaaacgt540
aaagaattccttttcttcaa600
actcatcctatgtttggtccaacaagtggt660
tatgacaaagacaagaagag720
aacatttttgt犯aaga3ggttgtag貼tg780
tatgctgctggatcac幼tttattacacat840
acac犯ac犯ctcctataaacacaaaagga900
acaactagtgatagttttgatttgtattgt960
gaggtgttagagaaactags tgcagcattg1020
gttcttcaaaagttggagaa卿agtgg犯1080
gattttagtaaga犯attg1129
〈210〉 23
〈211〉 32
〈212〉 DNA <213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述寡核苷酸PI <400〉 23
tctccatatg atctttcaat ctcattctca tc 32
<210〉 24 <211> 32 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223〉人工序列的描述寡核苷酸P2 〈400〉 24
ctaactaact aactacatac ctcatcatat cc 32
〈210> 25 <211〉 26 <212> DNA <213>人丁序列
<220〉
<223〉人工序列的描述寡核苷酸P3<400> 25
cctctctttc catatgctcc cttctc 26
<210〉 26 <211> 33 〈212〉 DNA <213〉人工序列
<220〉
〈223>人工序列的描述寡核苷酸P4 <400> 26
ccgccagcca cctccatatg accgacacca tcc 33
<210> 27
<211> 25 <212>飄 <213〉人工序列
<220〉
<223〉人工序列的描述寡核苷酸P5 〈400〉 27
cgccacccct catatgcgta tcgcc 25
<210> 28 〈211> 34 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
<220〉
<223>人工序列的描述寡核苷酸P6 <400> 28
gatgcatctt tgcatatgat gaggtcagaa gatg 34
<210〉 29
<211〉 35
<212〉 DNA <213>人工序列
<220〉
<223〉人工序列的描述寡核苷酸P7 <400〉 29
cagtataatt agtagtcaag gatcctgact gagag 35
<210> 30 <211> 31 〈212〉腿
54<213>人工序列 <220>
〈223>人工序列的描述寡核苷酸P8 <400〉 30
gctaaaactc ttctccttca atacttacct g
權(quán)利要求
1.一種能耐受以參與預(yù)苯酸轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-酪氨酸的代謝步驟中任一步驟的酶為靶酶的除草化合物的植物細(xì)胞，其特征在于，它包括了一個(gè)編碼預(yù)苯酸脫氫酶的基因并在它的組織中表達(dá)所述的酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的植物細(xì)胞，其特征在于，它能耐受以arogenate脫氫 酶為耙酶的除草劑化合物。
3. 如權(quán)利要求2所述的植物細(xì)胞，其特征在于，它能耐受除草劑化合物，所 述除草劑化合物以arogenate脫氫酶為耙酶。
4. 如權(quán)利要求3所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述arogenate脫氫酶是以 多核苷酸編碼的。
5. 如權(quán)利要求4所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含以下的多 核苷酸.-(a) 編碼由序列標(biāo)示符SEQ ID N0: 3 ， SEQ ID NO: 5 ， SEQ ID NO: 7或SEQ ID N0:13所描述的多肽的分離的多核苷酸；(b) 與(a)的多聚核苷酸雜交的分離的多核苷酸。(c )與(a )或(b )的多聚核苷酸有同源性的分離的多核苷酸； (d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
6. 如權(quán)利要求5所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含選自序列 標(biāo)示符SEQ ID NO:l， SEQ ID N0:2， SEQ ID N0:4， SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:8的多核苷酸。
7. 如權(quán)利要求4所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含選自以下 的多核苷酸(a) 編碼由序列標(biāo)示符SEQ ID N0:11所描述的多肽的分離的多核苷酸；(b) 與(a)所述的多核苷酸雜交的分離的多核苷酸；(c) 與(a)或(b)所述多核苷酸同源的分離的多核苷酸；(d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
8. 如權(quán)利要求7所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含選自序列 標(biāo)示符SEQ ID NO:IO的多核苷酸。
9. 如權(quán)利要求4-8任一所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源于植物。
10. 如權(quán)利要求6所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源于擬南芥
11. 如權(quán)利要求8所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源于灰綠云 衫(尸j'ces ^卵cs)。
12. 如權(quán)利要求11所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述酶來源于植物。
13. 如權(quán)利要求10所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述arogenate脫氫酶是 以多核苷酸編碼的，所述多核苷酸選自以下的一個(gè)多聚核苷酸(a) 編碼由序列標(biāo)示符SEQ ID N0:13所描述的多肽的分離的多核苷酸；(b) 與(a)所述多核苷酸雜交的分離的多核苷酸。(c) 與(a )或(b )所述多核苷酸同源的分離的多核苷酸；(d) (a)、 (b)或(c)所述多核苷酸的片段。
14. 如權(quán)利要求13所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包括選自序 列標(biāo)示符SEQ ID NO: 11的多核苷酸。
15. 如權(quán)利要求13或14所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源于 細(xì)菌。
16. 如權(quán)利要求15所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源于集胞 藻屬的細(xì)菌。
17. 如權(quán)利要求16所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述酶來源于細(xì)菌。
18. 如權(quán)利要求13-17任一所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述除草劑化合物 是用鑒定以具有arogenate脫氫酶活性的酶為靶酶的除草化合物的方法得到的， 該方法包括步驟(a) 至少準(zhǔn)備兩個(gè)樣品，每一個(gè)在溶液中含有等量的arogenate脫氫酶；(b) 其中的一個(gè)樣品用一種化合物處理；(c) 測(cè)定所述的每一樣品的arogenate脫氫酶活性；(d) 當(dāng)(c)步驟測(cè)定的經(jīng)處理樣品的酶活性比未處理樣品的酶活性明顯低 時(shí)，則可以認(rèn)定步驟(b)中所用的化合物是一種除草化合物；(e) 將步驟(d)中所鑒定的化合物的除草活性通過用所述的化合物處理植物 予以驗(yàn)證。
19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所用的具有arogenate 脫氫酶活性的酶是由多核苷酸編碼的。
20. 如權(quán)利要求19所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含以下的多核苷酸(a) 編碼由序列標(biāo)示符SEQ ID NO: 3 ， SEQ ID NO: 5 ， SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 13所描述的多肽的分離的多核苷酸；(b) 與(a)的多聚核苷酸雜交的分離的多核苷酸。(c )與(a )或(b )的多聚核苷酸有同源性的分離的多核苷酸； (d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
21. 如權(quán)利要求20所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含選自序 列標(biāo)示符SEQ ID NO:l， SEQ ID N0:2， SEQ ID N0:4， SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:8的多核苷酸。
22. 如權(quán)利要求19所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含選自以 下的多核苷酸(a) 編碼由序列標(biāo)示符SEQ ID N0:11所描述的多肽的分離的多核苷酸；(b) 與(a)所述的多核苷酸雜交的分離的多核苷酸；(c )與(a )或(b )所述多核苷酸同源的分離的多核苷酸； (d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
23. 如權(quán)利要求22所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含選自序 列標(biāo)示符SEQ ID N0:10的多核苷酸。
24. 如權(quán)利要求19-23任一所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源 于植物。
25. 如權(quán)利要求21所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源于擬南
26. 如權(quán)利要求23所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源于灰綠 云衫(尸ices W卵C3)。
27. 如權(quán)利要求1所述的植物細(xì)胞，其特征在于，它能耐受以預(yù)苯酸氨基轉(zhuǎn)移 酶為靶酶的除草劑化合物。
28. 如權(quán)利要求1至27任一項(xiàng)所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，它的編 碼預(yù)苯酸脫氫酶的基因是一種酵母基因。
29. 如權(quán)利要求28所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，它的編碼預(yù)苯酸脫 氫酶的基因來源于酵母菌屬的酵母菌。
30. 如權(quán)利要求28所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，它的編碼預(yù)苯酸脫氫酶的基因的由序列標(biāo)示符是SEQ ID NO: 14。
31. 如權(quán)利要求1至27任一項(xiàng)所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，它的編 碼預(yù)苯酸脫氫酶的基因是來源于細(xì)菌。
32. 如權(quán)利要求31所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，它的編碼預(yù)苯酸脫 氫酶的基因是來源于芽胞桿菌屬細(xì)菌。
33. 如權(quán)利要求32所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，它的編碼預(yù)苯酸脫 氫酶的基因的序列標(biāo)示符是SEQ ID NO: 16.
34. 如權(quán)利要求31所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，它的編碼預(yù)苯酸脫 氫酶的基因是來源于大腸桿菌屬細(xì)菌。
35. 如權(quán)利要求34所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，它的編碼預(yù)苯酸脫 氫酶的基因的序列標(biāo)示符是SEQ ID NO: 18.
36. 如權(quán)利要求31所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，它的編碼預(yù)苯酸脫 氫酶的基因是來源于Erwinia屬細(xì)菌。
37. 如權(quán)利要求36所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，它的編碼預(yù)苯酸脫 氫酶的基因的序列標(biāo)示符是SEQ ID N0:20.
38. 如權(quán)利要求1至37任一項(xiàng)所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，它除了 含有嵌合基因外，至少還含有編碼一個(gè)感興趣蛋白質(zhì)的多聚核苷酸的另一個(gè)基因， 所述嵌合基因至少包含功能上相互聯(lián)系的以下成分(a) 在宿主生物中有功能的啟動(dòng)子；(b) 編碼arogenate脫氫酶的活性的酶的多核苷酸；(c) 在宿主生物中有功能的終止子元件。
39. 如權(quán)利要求38所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含以下的 多核苷酸(a) 編碼由序列標(biāo)示符SEQ ID N0: 3 ， SEQ ID NO: 5 ， SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 13所描述的多肽的分離的多核苷酸；(b) 與(a)的多聚核苷酸雜交的分離的多核苷酸。(c )與(a )或(b )的多聚核苷酸有同源性的分離的多核苷酸；(d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
40. 如權(quán)利要求39所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含選自序 列標(biāo)示符SEQ ID NO:l， SEQ ID NO:2， SEQ ID NO:4， SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的多核苷酸。
41. 如權(quán)利要求38所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含選自以 下的多核苷酸(a) 編碼由序列標(biāo)示符SEQ ID N0:11所描述的多肽的分離的多核苷酸；(b) 與(a)所述的多核苷酸雜交的分離的多核苷酸；(c )與(a )或(b )所述多核苷酸同源的分離的多核苷酸； (d) (a)， (b)或(c)所述的多核苷酸的片段。
42. 如權(quán)利要求41所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包含選自序 列標(biāo)示符SEQ ID N0:10的多核苷酸。
43. 如權(quán)利要求38-42任一所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源 于植物。
44. 如權(quán)利要求40所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源于擬南 芥(^rs^it/op57'51 t力sJis/ a)。
45. 如權(quán)利要求42所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源于灰綠 云衫(尸ices ^朋cs)。
46. 如權(quán)利要求38所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸選自以下的 一個(gè)多聚核苷酸(a) 編碼由序列標(biāo)示符SEQ ID N0:13所描述的多肽的分離的多核苷酸；(b) 與(a)所述多核苷酸雜交的分離的多核苷酸。(c) 與(a )或(b )所述多核苷酸同源的分離的多核苷酸；(d) (a)、 (b)或(c)所述多核苷酸的片段。
47. 如權(quán)利要求46所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸包括選自序 列標(biāo)示符SEQ ID NO:ll的多核苷酸。
48. 如權(quán)利要求46或47所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源于細(xì)菌。
49. 如權(quán)利要求48所述的植物細(xì)胞，其特征在于，所述多核苷酸來源于集胞 藻屬的細(xì)菌。
50. 如權(quán)利要求38所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，所述啟動(dòng)子是組成 型啟動(dòng)子。
51. 如權(quán)利要求38所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，所述啟動(dòng)子是誘導(dǎo) 型啟動(dòng)子。
52. 如權(quán)利要求38-51任一所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，所述嵌合基因還包括在所述的宿主生物中有功能的信號(hào)肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
53. 如權(quán)利要求38-52任一所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，所述宿主生 物是微生物。
54. 如權(quán)利要求38-52任一所述的耐受性植物細(xì)胞，其特征在于，所述宿主生 物是植物細(xì)胞或植物。
55. —種獲得對(duì)以參與預(yù)苯酸轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)-酪氨酸的代謝步驟中任一步驟的酶為 靶酶的除草劑化合物有耐受性的植物的方法，其特征在于，該方法用編碼預(yù)苯酸 脫氫酶的基因通過一種使它能在植物組織中表達(dá)的方法轉(zhuǎn)化所述的植物。
56. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，該方法用于產(chǎn)生對(duì)以arogenate 脫氫酶為耙酶的除草劑化合物有耐受性的植物。
57. 如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于，該方法用于產(chǎn)生對(duì)以預(yù)苯酸脫氫酶為靶酶的除草劑化合物有耐受性的植物。
58. 如權(quán)利要求55至57任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，預(yù)苯酸脫氫酶來源于酵母。
59. 如權(quán)利要求55至57任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，預(yù)苯酸脫氫酶來源 于真菌。
60. 如權(quán)利要求55至57任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，預(yù)苯酸脫氫酶來源 于細(xì)菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及除草劑的新靶標(biāo)和對(duì)所述的除草劑有抗性的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明涉及具有arogenate脫氫酶活性的新酶，特別是植物的arogenate脫氫酶以及編碼所述酶的基因。本發(fā)明的arogenate脫氫酶催化酪氨酸生物合成代謝途徑的最后一步并因此構(gòu)成除草劑的潛在靶標(biāo)。因此本發(fā)明也涉及鑒定以所述的酶為靶酶的除草劑的方法，所述的除草劑化合物通過與所述的酶結(jié)合而防止酪氨酸的生物合成。本發(fā)明還涉及對(duì)以參與酪氨酸生物合成途徑的酶為靶酶，特別是以參與轉(zhuǎn)化L-酪氨酸為預(yù)苯酸的酶，具體是arogenate脫氫酶為靶酶的除草劑，有耐受性的轉(zhuǎn)基因植物。這些植物成為耐受性是由于在植物組織中表達(dá)了預(yù)苯酸脫氫酶，此酶對(duì)所述的除草劑不敏感并使植物即使在用所述的除草劑處理后仍能合成酪氨酸。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101560499SQ20081017670
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2001年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月5日
發(fā)明者M·馬特林格, P·里珀特 申請(qǐng)人:阿方蒂農(nóng)科股份有限公司