專(zhuān)利名稱(chēng)：Rna原位雜交的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在病理學(xué)上和組織化學(xué)上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行簡(jiǎn)便檢測(cè)、定量化、可以用 于研究以及診斷的RNA原位雜交。
背景技術(shù)：
(I)RNA原位雜交
已知有多種病理學(xué)性、組織化學(xué)性檢測(cè)基因表達(dá)的方法。其中，作為對(duì)基因轉(zhuǎn)錄 而形成的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即信使RNA(mRNA)進(jìn)行mRNA所存在的即時(shí)位置(原位)檢測(cè)的方法， 有原位雜交法。該方法通過(guò)將溶解了具有與欲檢測(cè)的mRNA的序列互補(bǔ)的核酸序列的核 酸探針(probe)的原位雜交用的緩沖液(專(zhuān)利文獻(xiàn)1)添加在組織試樣中，使核酸探針與 mRNA雜交。這時(shí)，在核酸探針上附加檢測(cè)用的標(biāo)記，用適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，在顯 微鏡下進(jìn)行觀察(專(zhuān)利文獻(xiàn)幻。多數(shù)情況下，作為標(biāo)記使用異羥基洋地黃毒甙元(Dig， digoxigenin)，使用在抗異羥基洋地黃毒甙元抗體上結(jié)合有堿性磷酸酶的蛋白質(zhì)，利用抗 異羥基洋地黃毒甙元抗體部分檢測(cè)Dig標(biāo)記，進(jìn)一步引發(fā)基于堿性磷酸酶-NBT/BCIP的顯 色反應(yīng)，進(jìn)行致敏(專(zhuān)利文獻(xiàn)3、4、5、6)。作為核酸探針，可以使用在離體(in vitro)轉(zhuǎn)錄 體系中轉(zhuǎn)錄欲檢測(cè)的mRNA的全長(zhǎng)或者一部分的序列而得的互補(bǔ)RNA、或者基于化學(xué)合成的 寡聚DNA (專(zhuān)利文獻(xiàn)7,8)或者寡聚RNA。
這樣的原位雜交法，自從最初的論文由Pardue and Gall (非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)和John et al.(非專(zhuān)利文獻(xiàn)幻發(fā)表以來(lái)，已經(jīng)過(guò)去將近40年。當(dāng)初的標(biāo)記使用放射性同位素，使 其在膠片上感光而檢測(cè)mRNA的存在。然后，作為非放射性同位素的方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)9)，上 述的Dig標(biāo)記法等被開(kāi)發(fā)出來(lái)(專(zhuān)利文獻(xiàn)3、4、5、6)。另外，作為致敏法，除了上述基于堿性 磷酸酶-NBT/BCIP的顯色反應(yīng)之外，開(kāi)發(fā)了酪胺酰胺(Tyramide)致敏法(TSA致敏法)，可 以在提高檢測(cè)靈敏度方面使用(專(zhuān)利文獻(xiàn)10、11、12)，還開(kāi)發(fā)了使用熒光色素的檢測(cè)(非專(zhuān) 利文獻(xiàn)3，專(zhuān)利文獻(xiàn)13、14、15)。
(2)核酸探針
作為與欲檢測(cè)的mRNA對(duì)應(yīng)的核酸探針，使用利用離體轉(zhuǎn)錄體系轉(zhuǎn)錄而得的互補(bǔ) RNA時(shí)，通過(guò)將Dig-UTP混入離體轉(zhuǎn)錄體系，在轉(zhuǎn)錄合成的互補(bǔ)RNA上插入Dig-UTP而附加 Dig標(biāo)記(專(zhuān)利文獻(xiàn)3、4、5、6)，但是各個(gè)互補(bǔ)RNA探針?lè)肿由蠒?huì)插入多少個(gè)的Dig-UTP，另 外在探針序列中的哪個(gè)位置上插入，不能人為地控制。另外，使用互補(bǔ)RNA作為探針時(shí)，為 了獲得強(qiáng)的信號(hào)，在離體轉(zhuǎn)錄體系中合成盡可能長(zhǎng)的互補(bǔ)RNA，可以利用水解制成長(zhǎng)度為從 300堿基至500堿基左右的片段化后的探針再使用。這時(shí)，不能人為地控制所謂何處被水解 的位置，成為各種片段混合存在的探針。為了避免各種片段的混合存在，也有以下情況，即 從作為目標(biāo)的mRNA全長(zhǎng)中，利用計(jì)算機(jī)選擇1個(gè)特性高且長(zhǎng)度為300堿基至500堿基左右 的區(qū)域作為其他基因，克隆該區(qū)域后，利用離體轉(zhuǎn)錄體系制成互補(bǔ)RNA探針，利用1種探針 進(jìn)行RNA原位雜交的情況。但是，在區(qū)域選擇性地進(jìn)行克隆時(shí)，由于作為PCR引物的該區(qū)域 的兩端序列的限制、作為雜交時(shí)的重要參數(shù)的GC含量的限制等，在每個(gè)基因之間，探針的長(zhǎng)度變得形形色色。進(jìn)而存在以下的缺點(diǎn)，除了在離體轉(zhuǎn)錄體系中選擇的區(qū)域以外，還要在 互補(bǔ)的RNA的3’末端側(cè)附加所使用的載體(vector)等多余的序列。這樣，使用離體轉(zhuǎn)錄 體系，將互補(bǔ)RNA作為探針使用時(shí)，每個(gè)探針長(zhǎng)度變得多種多樣，附加的標(biāo)記的位置、數(shù)量 也不能控制，因此存在以下缺點(diǎn)，無(wú)法使在用于對(duì)表達(dá)的mRNA進(jìn)行定量化的檢測(cè)中使用的 探針具有定量性。特別是在以多個(gè)基因間的表達(dá)量的比較為目的的情況下，由于所使用的 探針間的雜交條件不同，所以以往的互補(bǔ)RNA探針并不合適。另外，使用互補(bǔ)RNA作為核酸 探針時(shí)，還伴有實(shí)驗(yàn)條件不易設(shè)定的困難。即，雜交過(guò)程是一種平衡反應(yīng)，因此為了提高檢 測(cè)靈敏度，需要探索核酸探針與盡可能多的mRNA分子雜交的探針的濃度條件和使其雜交 時(shí)的溫度條件，這根據(jù)所用的互補(bǔ)RNA探針的長(zhǎng)度、GC含量的不同而不同。在檢測(cè)雜交后 的互補(bǔ)RNA探針的工藝中，用于檢測(cè)標(biāo)記的抗體反應(yīng)也是平衡反應(yīng)，因此將抗體濃度設(shè)置 為多少，這樣的條件也需要探索。進(jìn)而，基于堿性磷酸酶的顯色反應(yīng)等的致敏也依賴(lài)于反應(yīng) 時(shí)間而增加發(fā)色強(qiáng)度，因此需要控制反應(yīng)時(shí)間?；谝陨?，當(dāng)使用在離體轉(zhuǎn)錄體系中制成的 互補(bǔ)RNA作為核酸探針時(shí)，需要探索復(fù)雜的工藝和條件，并不簡(jiǎn)便。
最近，開(kāi)始嘗試將利用DNA合成機(jī)等化學(xué)合成的寡聚核酸作為探針使用?？梢哉J(rèn) 為，這是因?yàn)榧词共豢寺RNA，也會(huì)以登記在數(shù)據(jù)庫(kù)中的核酸序列為基礎(chǔ)簡(jiǎn)單地進(jìn)行探針 制作。進(jìn)而，由于序列短，與長(zhǎng)度為300堿基至500堿基的互補(bǔ)RNA探針相比，具有對(duì)組織 樣品的浸透性更好的優(yōu)點(diǎn)。另一方面，與互補(bǔ)RNA探針相比，寡聚核酸探針由于長(zhǎng)度短，因 此每1分子探針上帶有的標(biāo)記的數(shù)量更少，所以在檢測(cè)雜交后的寡聚核酸方面，存在信號(hào) 強(qiáng)度弱的缺點(diǎn)。
為了克服該缺點(diǎn)，大致從兩個(gè)方向開(kāi)始嘗試。其一是，作為寡聚核酸探針的標(biāo)記 分子，使用Cy3、熒光素等熒光分子，使用60倍至100倍的高倍率物鏡，將從標(biāo)記的熒光分 子發(fā)出的微弱熒光作為亮點(diǎn)捕捉，在Z軸方提高使用CCD照相機(jī)對(duì)多個(gè)光學(xué)切面(optical section)進(jìn)行攝影，使用計(jì)算機(jī)算法將圖像鮮明化，由此進(jìn)行觀察的方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)13)。 由于進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理，可以測(cè)量1像素中的亮度，mRNA的定量化成為可能。這種情況下，為 了使信號(hào)強(qiáng)度發(fā)揮作用，正在嘗試通過(guò)從附加標(biāo)記分子的堿基間解離掉10堿基以上來(lái)增 加附加于探針的標(biāo)記分子的數(shù)量。進(jìn)而，發(fā)展該方法開(kāi)發(fā)了使用通過(guò)多個(gè)熒光分子進(jìn)行了 彩色編碼的探針在mRNA發(fā)生轉(zhuǎn)錄的位置對(duì)欲檢測(cè)的mRNA進(jìn)行檢測(cè)的方法(專(zhuān)利文獻(xiàn)14， 15)。
另一個(gè)方向是通過(guò)在探針?lè)肿拥暮湍繕?biāo)mRNA互補(bǔ)的序列的外側(cè)帶有尾部(tail) 來(lái)增加附加的標(biāo)記分子的數(shù)量的方法、稱(chēng)為T(mén)SA(酪胺酰胺增敏Tyramide sensitivity amplification)的致敏法(專(zhuān)利文獻(xiàn)10、11、1幻等，對(duì)信號(hào)進(jìn)行致敏而進(jìn)行檢測(cè)、觀察的方 法。通過(guò)基于堿性磷酸酶-NBT/BCIP的發(fā)色致敏、TSA致敏法，背景噪聲由于致敏而存在增 強(qiáng)的趨勢(shì)，表達(dá)的強(qiáng)弱可以被顯微鏡定性觀察，但是還無(wú)法達(dá)到對(duì)mRNA量的定量化。另外， 在相同組織樣品中，也無(wú)法進(jìn)行對(duì)多個(gè)基因的mRNA之間的表達(dá)量的比較。
專(zhuān)利文獻(xiàn)1 美國(guó)專(zhuān)利No. 5750340
專(zhuān)利文獻(xiàn)2 美國(guó)專(zhuān)利No. 4，888，278
專(zhuān)利文獻(xiàn)3 日本專(zhuān)利第1999884號(hào)
專(zhuān)利文獻(xiàn)4 美國(guó)專(zhuān)利No. 5344757
專(zhuān)利文獻(xiàn)5 美國(guó)專(zhuān)利No. 5354657
專(zhuān)利文獻(xiàn)6 美國(guó)專(zhuān)利No. 5702888
專(zhuān)利文獻(xiàn)7 美國(guó)專(zhuān)利No. 5597692
專(zhuān)利文獻(xiàn)8 美國(guó)專(zhuān)利No. 6265156
專(zhuān)利文獻(xiàn)9 美國(guó)專(zhuān)利No. 5，985，549
專(zhuān)利文獻(xiàn)10 美國(guó)專(zhuān)利No. 5196306
專(zhuān)利文獻(xiàn)11 美國(guó)專(zhuān)利No. 5，583001
專(zhuān)利文獻(xiàn)12 美國(guó)專(zhuān)利No. 5，731158
專(zhuān)利文獻(xiàn)13 美國(guó)專(zhuān)利No. 5，866，331
專(zhuān)利文獻(xiàn)14 美國(guó)專(zhuān)利No. 6，534，266
專(zhuān)利文獻(xiàn)15 日本特表2002-542793
非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 :Pardue ML, andGall JG. (1969)Molecular hybridization of radioactive DNA to the DNA of cytological preparations (才目對(duì)于細(xì)胞備 DNA 的放 射性 DNA 的分子雜交).Proc Natl Acad Sci USA. 1969 Oct ；64 (2) :600-4
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非專(zhuān) 利文獻(xiàn) 3 :Levsky JM, and Singer RH, Fluorescence in situ hybridization :past，present and future (原位雜交中的熒光過(guò)去、現(xiàn)在和將 來(lái)).J. Cell Science, 116，2833-2838，2003.
在表達(dá)的mRNA的定量化中，使用定量性PCR法。然而，在定量性PCR中，對(duì)組織進(jìn) 行勻質(zhì)化而破壞組織的結(jié)構(gòu)，使用來(lái)自在組織中存在的各種細(xì)胞的mRNA混合后的試樣，因 此不能進(jìn)行在各個(gè)細(xì)胞中表達(dá)的mRNA的定量化。因此，除了局部存在性之外，如果可以對(duì) 組織化學(xué)性表達(dá)的mRNA的量進(jìn)行定量，則由組織中各細(xì)胞表達(dá)的mRNA的定量化就成為可 能，在科學(xué)和產(chǎn)業(yè)上的應(yīng)用會(huì)很廣泛。例如，在癌組織中，癌細(xì)胞和正常細(xì)胞混合存在，進(jìn)而 在正常細(xì)胞中也共存各種物質(zhì)。另外，在癌組織中，多數(shù)情況下有分化度高的癌細(xì)胞和分化 度低的癌細(xì)胞混合存在。在這樣的癌組織的癌細(xì)胞中，通過(guò)對(duì)組織化學(xué)性地表達(dá)的mRNA進(jìn) 行檢測(cè)并定量化，若能夠?qū)拱﹦┑钠鹦С潭冗M(jìn)行診斷，則從癌的化學(xué)治療的觀點(diǎn)出發(fā)可 以期待更大的效果。
作為用于組織化學(xué)性地檢測(cè)組織試樣中的mRNA的局部存在性的方法，有RNA原位 雜交法。以往，作為RNA原位雜交法，多數(shù)情況下使用在離體轉(zhuǎn)錄體系中制成的互補(bǔ)RNA作 為探針。然而，互補(bǔ)RNA探針雖然可以病理學(xué)性地、組織化學(xué)性地檢測(cè)欲檢測(cè)的mRNA的存 在(局部存在性)，但是不適于究竟多少程度的mRNA量局部存在這樣的檢測(cè)，不適于定量 化。另外，使用利用熒光分子標(biāo)記的寡聚DNA探針時(shí)，通過(guò)使用計(jì)算機(jī)測(cè)量熒光強(qiáng)度，可以 對(duì)表達(dá)的mRNA進(jìn)行定量，但是在熒光信號(hào)的檢測(cè)中需要使用60倍至100倍的高倍率物鏡。 因此，組織試樣中的可檢測(cè)范圍非常窄，在采用利用10倍至40倍的物鏡對(duì)大范圍組織試樣 進(jìn)行診斷的通常的病理學(xué)性的、組織化學(xué)性的方法論的情況下，在檢測(cè)mRNA的存在方面存 在困難。而且，需要使用高價(jià)的顯微鏡在Z軸方向的多個(gè)光學(xué)切面中進(jìn)行圖像攝影，使用特 殊的計(jì)算機(jī)算法將圖像鮮明化，因此mRNA的檢測(cè)并不簡(jiǎn)便。另一方面，為了使用10倍至40 倍的物鏡檢測(cè)組織試樣中的mRNA而使用了 TSA致敏等致敏法時(shí)，不只是目標(biāo)信號(hào)被增強(qiáng)， 背景噪聲也同時(shí)被增強(qiáng)，信號(hào)-噪聲比(SN比)變差，mRNA的定量化是困難的。6
通常，進(jìn)行RNA原位雜交時(shí)，為了降低背景噪聲，使用魚(yú)(主要是鮭魚(yú))精子的 DNA、酵母菌tRNA等。由于組織試樣為生物體試樣，分子特性與生物體高分子同等的、核酸 探針?lè)翘禺愋晕街牟课?，多存在于組織試樣之中。非特異性吸附于組織試樣的核酸探 針成為背景噪聲的原因。特別是通過(guò)致敏法來(lái)增強(qiáng)信號(hào)時(shí)，背景噪聲也同時(shí)增加，導(dǎo)致SN 比的惡化。為了防止該核酸探針對(duì)組織試樣的非特異性吸附，在使核酸探針雜交前，將利用 超聲波處理片段化為長(zhǎng)度2000堿基左右的單鏈魚(yú)精子DNA、酵母菌tRNA等用于預(yù)雜交，使 其非特異性地吸附在吸附部位，則可以降低背景噪聲?；蛘呖梢詫Ⅳ~(yú)精子DNA、酵母菌tRNA 在雜交溶液中與核酸探針混合起來(lái)使用。
然而，使用寡聚核酸探針時(shí)，若使用片段化為長(zhǎng)度2000堿基左右的單鏈而得到的 魚(yú)精子DNA，則有可能在魚(yú)精子DNA中存在寡聚核酸探針發(fā)生雜交的部位。該部位與本來(lái)的 組織試樣中的目標(biāo)mRNA發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，由此變得妨礙寡聚核酸探針在目標(biāo)mRNA上雜交，有可能 成為降低本來(lái)的信號(hào)的原因。或者與魚(yú)精子DNA雜交后的寡聚核酸探針成為背景噪聲的原 因，由于致敏而將其噪聲放大。另外，即使魚(yú)精子DNA被片段化為長(zhǎng)度2000堿基左右，寡聚 核酸探針也比魚(yú)精子DNA短，其對(duì)組織試樣的浸透性高，因此在組織試樣中，有可能存在魚(yú) 精子DNA不能到達(dá)的非特異性吸附部位，這也有可能是提高背景噪聲的原因。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是鑒于上述問(wèn)題點(diǎn)而開(kāi)發(fā)的，其課題在于提供以下用于研究以及診斷的方 法通過(guò)降低背景噪聲增強(qiáng)信號(hào)，使用10倍至40倍的物鏡，正確且簡(jiǎn)便地檢測(cè)與mRNA的表 達(dá)量對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度的變化，由此對(duì)病理學(xué)性地和組織化學(xué)性地表達(dá)的mRNA進(jìn)行檢測(cè)、定量化。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，不使用RNA原位雜交中通常使用的鮭魚(yú)等的魚(yú)精子DNA，而是使用 與寡聚核酸探針大致相同長(zhǎng)度的假寡聚核酸來(lái)防止寡聚核酸探針向組織試樣的非特異性 吸附，由此在使用致敏法時(shí)，在熒光顯微鏡中使用10倍至20倍的物鏡并利用CXD照相機(jī)來(lái) 簡(jiǎn)便地進(jìn)行圖像攝影，就會(huì)有SN比的提高以及信號(hào)的增強(qiáng)。于是，以該假寡聚核酸的使用 為前提，隨著寡聚核酸探針的標(biāo)記數(shù)量的增加，可以看出被觀察的信號(hào)強(qiáng)度以加和的形式 增加。進(jìn)而，檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)mRNA時(shí)，隨著帶有有相同數(shù)量的標(biāo)記的寡聚核酸探針的 序列種類(lèi)數(shù)量增加，可以看出被觀察的信號(hào)強(qiáng)度以加和的形式增加。進(jìn)而，隨著寡聚核酸探 針序列中的GC含量增加，可以看出被觀察的信號(hào)強(qiáng)度以增函數(shù)的形式增加。另外，隨著探 針的Tm值上升，可看出被觀察的信號(hào)強(qiáng)度以增函數(shù)的形式增加。
本發(fā)明基于發(fā)明人等的以上的新見(jiàn)解，提供以下技術(shù)。
(1) 一種RNA原位雜交法，其特征在于，其是使1種或多種寡聚核酸探針與在組織 試樣中表達(dá)的目標(biāo)基因mRNA雜交，檢測(cè)在寡聚核酸探針的至少1個(gè)堿基上附加的低分子化 合物標(biāo)記來(lái)鑒定目標(biāo)基因mRNA的存在的方法，
使1種或多種假寡聚核酸對(duì)組織試樣進(jìn)行前處理(預(yù)雜交)后，使寡聚核酸探針 與組織試樣接觸，使其與目標(biāo)基因mRNA雜交，或者
使寡聚核酸探針和上述假寡聚核酸的混合液與試樣組織接觸，使寡聚核酸探針與 目標(biāo)基因mRNA雜交，
其中，上述假寡聚核酸
由與寡聚核酸探針大致相同的長(zhǎng)度形成，
不與目標(biāo)基因mRNA上的寡聚核酸探針進(jìn)行雜交的區(qū)域發(fā)生雜交，而且
不與寡聚核酸探針發(fā)生雜交。
(2)根據(jù)上述(1)所述的RNA原位雜交法，其中，假寡聚核酸量為寡聚核酸探針量 的2 10倍。
(3)根據(jù)上述( 所述的RNA原位雜交法，其中，寡聚核酸探針和假寡聚核酸的堿 基長(zhǎng)度在20bp至70bp的范圍內(nèi)大致相同。
(4)根據(jù)上述(1)所述的RNA原位雜交法，其中，寡聚核酸探針?lè)謩e在其5’末端堿 基或/和3’末端堿基上附帶有低分子化合物標(biāo)記。
(5)根據(jù)上述(1)所述的RNA原位雜交法，其中，將2種以上的上述⑷中所述的 寡聚核酸探針以各自的5’末端和3’末端隔開(kāi)8堿基以上的方式與mRNA進(jìn)行雜交。
(6)根據(jù)上述(1)所述的RNA原位雜交法，其中，使用抗低分子化合物的抗體、在該 抗體上結(jié)合的酶、作為該酶的基質(zhì)的發(fā)色化合物或熒光分子化合物來(lái)將檢測(cè)信號(hào)致敏，使 用10倍至40倍的物鏡來(lái)檢測(cè)信號(hào)。
(7)根據(jù)上述(1)所述的RNA原位雜交法，其中，組織試樣為從哺乳動(dòng)物分離的組 織，假寡聚核酸是與逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列的一部分相當(dāng)?shù)墓丫酆怂帷?br> (8)根據(jù)上述(1)所述的RNA原位雜交法，其中，組織試樣為從哺乳動(dòng)物分離的組 織，假寡聚核酸是與植物基因組的一部分或微生物基因組的一部分相當(dāng)?shù)墓丫酆怂帷?br> (9)根據(jù)上述⑴所述的RNA原位雜交法，其中，
假寡聚核酸是如下得到的寡聚核酸，
將寡聚核酸探針的堿基序列中的A置換為Τ、T置換為A、G置換為C且C置換為 G，
相同堿基連續(xù)M個(gè)(M為4)以上的情況下，將從該連續(xù)序列中的ΜΧ0. 2處(小數(shù) 點(diǎn)以下四舍五入而得的整數(shù))至MX0.8處(小數(shù)點(diǎn)以下四舍五入而得的整數(shù))的堿基利 用其互補(bǔ)的堿基來(lái)置換，
存在無(wú)論從5’側(cè)讀取還是從3’側(cè)讀取都為相同序列的N堿基(N為幻以上的回 文序列時(shí)，利用其互補(bǔ)的堿基置換至少NX0.2處(小數(shù)點(diǎn)以下四舍五入而得的整數(shù))的堿 基，N為偶數(shù)時(shí)至多為(N/2-1)處的堿基，N為奇數(shù)時(shí)至多為((N-I) Λ-1)處的堿基，由此得 到寡聚核酸。
(10) 一種上述(7)所述的RNA原位雜交法中使用的假寡聚核酸，其是含有逆轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列的局部序列的寡聚核酸、或含有與該重復(fù)序列各不相同的局部序列多種 寡聚核酸的組。
(11) 一種上述(8)中所述的RNA原位雜交法中使用的假寡聚核酸，其是含有植物 基因組的一部分或微生物基因組的局部序列的寡聚核酸、或者含有與植物基因組或微生物 基因組各不相同的局部序列的多種寡聚核酸的組多種寡聚核酸的組。
根據(jù)如上所述的本發(fā)明，能夠?qū)Σ±韺W(xué)性地和組織化學(xué)性地表達(dá)的mRNA進(jìn)行簡(jiǎn) 便且高精度地檢測(cè)、定量化，可以推進(jìn)與各種疾患的原因、治療法等相關(guān)的基礎(chǔ)研究，或者 對(duì)各種疾患的診斷精度的提高作出巨大貢獻(xiàn)。


圖1示出在實(shí)施例1中求出假寡聚DNA相對(duì)于寡聚DNA探針濃度的最適添加比率 的RNA原位雜交的結(jié)果。
圖2示出在實(shí)施例1中，為了求出假寡聚DNA相對(duì)于寡聚DNA探針濃度的最適添 加比率，由RNA原位雜交的結(jié)果求出各添加比率中的信號(hào)強(qiáng)度的結(jié)果。
圖3示出在實(shí)施例1中，為了求出假寡聚DNA相對(duì)于寡聚DNA探針濃度的最適添 加比率，求出對(duì)于添加比率1倍和8倍而言各探針濃度中的信號(hào)強(qiáng)度的結(jié)果。
圖4示出在實(shí)施例2中，求出2種假寡聚DNA、鮭魚(yú)精子DNA和無(wú)添加時(shí)相對(duì)于各 寡聚DNA探針濃度的效果的RNA原位雜交的結(jié)果。
圖5示出在實(shí)施例2中，為了求出2種假寡聚DNA、鮭魚(yú)精子DNA和無(wú)添加時(shí)相對(duì) 于各寡聚DNA探針濃度的效果，由RNA原位雜交的結(jié)果計(jì)算出探針濃度為OnM時(shí)的信號(hào)強(qiáng) 度的結(jié)果。
圖6示出在實(shí)施例2中，為了求出2種假寡聚DNA、鮭魚(yú)精子DNA和無(wú)添加時(shí)相對(duì) 于各寡聚DNA探針濃度的效果，由RNA原位雜交的結(jié)果計(jì)算出的各探針濃度中的信號(hào)強(qiáng)度。
圖7示出在實(shí)施例3中，對(duì)假寡聚DNA和鮭魚(yú)精子DNA的RNA原位雜交的RNA檢 測(cè)中的效果進(jìn)行比較的結(jié)果。
圖8示出在實(shí)施例3中，將所得到的SN比設(shè)為縱軸，將探針濃度設(shè)為橫軸，對(duì)添加 假寡聚DNA后的SN比與添加鮭魚(yú)精子DNA后的SN比進(jìn)行比較的結(jié)果。
圖9示出在實(shí)施例4中，變更所使用的假寡聚DNA序列的種類(lèi)和數(shù)量后進(jìn)行的RNA 原位雜交的結(jié)果。
圖10示出在實(shí)施例4中，由用于求出各種假寡聚DNA的效果的RNA原位雜交的結(jié) 果，求出各假寡聚DNA的效果作為信號(hào)強(qiáng)度的結(jié)果。
圖11示出在實(shí)施例5中檢測(cè)中所使用的探針的種類(lèi)數(shù)和檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系 的RNA原位雜交的照片圖像。
圖12示出實(shí)施例5中的信號(hào)強(qiáng)度和探針的種類(lèi)數(shù)量的相關(guān)關(guān)系。
圖13示出在實(shí)施例6中對(duì)隨著檢測(cè)中所使用的探針的濃度上升而信號(hào)強(qiáng)度有著 怎樣的變化進(jìn)行攝影的照片圖像。
圖14a示出實(shí)施例6中的信號(hào)強(qiáng)度與探針濃度之間的相關(guān)關(guān)系。
圖14b示出實(shí)施例6中的信號(hào)強(qiáng)度與探針濃度之間的相關(guān)關(guān)系。
圖15示出在實(shí)施例7中對(duì)隨著檢測(cè)中所使用的探針的濃度上升而信號(hào)強(qiáng)度有著 怎樣的變化進(jìn)行研究的照片圖像。
圖16示出實(shí)施例7中的信號(hào)強(qiáng)度與探針濃度的相關(guān)關(guān)系。
圖17示出在實(shí)施例8中，對(duì)隨著晝夜節(jié)律而表達(dá)發(fā)生變動(dòng)的基因Arntl而言，研 究從上午9時(shí)開(kāi)始每隔4小時(shí)直至深夜1時(shí)為止，利用RNA原位雜交對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行研究 的照片圖像。
圖18示出在實(shí)施例8中，對(duì)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Actb和隨著晝夜節(jié)律而表達(dá)發(fā)生變動(dòng)的 基因Arntl而言，從上午9時(shí)開(kāi)始每隔4小時(shí)直至深夜1時(shí)，采肝臟，利用定量PCR對(duì)表達(dá) 量的變化進(jìn)行研究的結(jié)果。
圖19示出在實(shí)施例8中，對(duì)于基因Arntl而言，從上午9時(shí)開(kāi)始每隔4小時(shí)直至9深夜1時(shí)，利用RNA原位雜交來(lái)研究肝臟中的表達(dá)變化，求得信號(hào)強(qiáng)度的變化的結(jié)果。
圖20示出在實(shí)施例8中，對(duì)于基因Arntl而言，從上午9時(shí)開(kāi)始每隔4小時(shí)直至 深夜1時(shí)，利用定量PCR和RNA原位雜交來(lái)研究肝臟中的表達(dá)變化，獲得定量PCR的結(jié)果和 信號(hào)強(qiáng)度的結(jié)果的相關(guān)。
圖21示出在實(shí)施例9中，對(duì)于基因Cypla2和Alb而言，通過(guò)使用多個(gè)寡聚DNA探 針同時(shí)實(shí)施RNA原位雜交而得到的肝臟中的表達(dá)的照片圖像。
圖22示出在實(shí)施例10中，對(duì)酪胺酰胺增敏中的酪胺酰胺-Flu的濃度的影響進(jìn)行 研究的結(jié)果。
圖23示出在實(shí)施例11中計(jì)算各寡聚核酸的GC含量(％ )的例子。
圖M示出在實(shí)施例12中，以相對(duì)于大鼠肺中的大鼠β -actin基因Actb的原位 雜交的信號(hào)強(qiáng)度來(lái)確認(rèn)寡聚核酸探針的帶有標(biāo)記的位置(5’末端或3’末端)的效果和數(shù) 量的效果的結(jié)果。
圖25示出在實(shí)施例13中，在一個(gè)基因的mRNA上，要檢測(cè)使用多個(gè)標(biāo)記進(jìn)行雜交 的產(chǎn)物時(shí)，用于確認(rèn)在mRNA的核酸序列上2個(gè)標(biāo)記到底需要隔開(kāi)多少的2個(gè)寡聚DNA探針 的示意圖。
圖沈示出在實(shí)施例13中，在一個(gè)基因的mRNA上，要檢測(cè)使用多個(gè)標(biāo)記進(jìn)行雜交 的產(chǎn)物時(shí)，用于確認(rèn)在mRNA的核酸序列上2個(gè)標(biāo)記到底需要隔開(kāi)多少而實(shí)施的RNA原位雜 交的結(jié)果。
圖27示出在實(shí)施例14中，利用改變了 GC含量的寡聚核酸探針進(jìn)行原位雜交后的結(jié)果。
具體實(shí)施方式
發(fā)明(1)的特征在于，使用與目標(biāo)基因mRNA上寡聚核酸探針發(fā)生雜交的區(qū)域不進(jìn) 行雜交、并且也不與寡聚核酸探針雜交的1種或多種假寡聚核酸。具體而言，使單鏈的假寡 聚核酸對(duì)組織試樣進(jìn)行前處理(預(yù)雜交)之后，使單鏈的寡聚核酸探針與組織試樣接觸并 與目標(biāo)基因mRNA發(fā)生雜交，或者使單鏈的寡聚核酸探針與單鏈的假寡聚核酸的混合液與 組織試樣發(fā)生接觸，并使單鏈的寡聚核酸探針與目標(biāo)基因mRNA發(fā)生雜交。此外，目標(biāo)基因 是在組織試樣中表達(dá)的1種 10種左右的基因mRNA。
假寡聚核酸可以將不與目標(biāo)基因mRNA上寡聚核酸探針發(fā)生雜交的區(qū)域進(jìn)行雜交 且不與寡聚核酸探針雜交作為條件，通過(guò)化學(xué)合成來(lái)制成。化學(xué)合成也可以使用市售的自 動(dòng)DNA合成機(jī)。另外，也可以委托DNA合成服務(wù)公司。所謂假寡聚核酸不與目標(biāo)基因mRNA上 寡聚核酸探針發(fā)生雜交的區(qū)域進(jìn)行雜交的條件，是指其具有不同于與目標(biāo)基因mRNA發(fā)生 雜交的寡聚核酸探針的堿基序列的意思。這時(shí)的所謂不同的堿基序列，可以按照以下基準(zhǔn) 例如在Blast等堿基序列比對(duì)中的一致率為30%以下、優(yōu)選為20%以下、進(jìn)一步優(yōu)選10% 以下?；蛘呖梢园凑找韵禄鶞?zhǔn)是與相當(dāng)于寡聚核酸探針的全長(zhǎng)的70%以上、優(yōu)選80%以 上、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上的連續(xù)堿基序列不同的序列。所述假寡聚核酸不與寡聚核酸探針 雜交的條件，可以按照以下基準(zhǔn)與寡聚核酸探針的互補(bǔ)序列、例如Blast等堿基序列比對(duì) 中的一致率為30%以下、優(yōu)選20%以下、進(jìn)一步優(yōu)選10%以下?；蛘呖梢园凑找韵禄鶞?zhǔn) 是與相當(dāng)于寡聚核酸探針的互補(bǔ)序列的全長(zhǎng)的70%以上、優(yōu)選80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上的連續(xù)堿基序列不同的序列。
假寡聚核酸的種類(lèi)可以為1種，或者可以為多種O 5種)。另外，使用多種假寡 聚核酸時(shí)，其中的2種可以為具有互補(bǔ)序列的假寡聚核酸。
該假寡聚核酸量、即后述的預(yù)雜交溶液或者雜交溶液中的濃度，可以設(shè)為寡聚核 酸探針量、即雜交溶液中寡聚核酸探針的濃度的2 10倍，優(yōu)選設(shè)為6 8倍。使用多種 寡聚核酸探針時(shí)，將它們的濃度的合計(jì)值作為寡聚核酸探針量。使用多種假寡聚核酸時(shí)，將 它們的濃度的合計(jì)值作為假寡聚核酸量。
進(jìn)而，假寡聚核酸的長(zhǎng)度與寡聚核酸探針的長(zhǎng)度大致相同。這時(shí)的所謂大致相同， 是指兩者的長(zhǎng)度差異為士 10%、優(yōu)選為士5%、進(jìn)一步優(yōu)選為士3%、特別優(yōu)選為士0% (完 全相同)的范圍。寡聚核酸探針的堿基長(zhǎng)度可以設(shè)為從20bp到70bp的范圍，因此，假寡聚 核酸的堿基長(zhǎng)也在該范圍內(nèi)與寡聚核酸探針大致相同。
作為這樣的假寡聚核酸，可以選擇不與目標(biāo)基因mRNA雜交但與其他基因的mRNA 雜交的核酸序列。另外，也可以從來(lái)自在哺乳類(lèi)的基因組中反復(fù)出現(xiàn)的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的重 復(fù)序列之中，選擇與寡聚核酸探針的長(zhǎng)度大致相同的序列。進(jìn)而，也可以從在植物、微生物 中從不存在于哺乳類(lèi)的基因序列中選擇長(zhǎng)度大致相同的序列。
就假寡聚核酸的選擇而言，可以對(duì)欲選擇假寡聚核酸的基因組中的重復(fù)序列、植 物或微生物的基因的序列，可以利用簡(jiǎn)單的計(jì)算機(jī)程序一邊從5’側(cè)開(kāi)始一個(gè)堿基一個(gè)堿基 地錯(cuò)開(kāi)一邊計(jì)算所需的長(zhǎng)度的部分序列中的GC含量，對(duì)具有所需GC含量的寡聚核酸序列 進(jìn)行列表。接著將被列表的寡聚序列施以blast檢索，由此確認(rèn)與寡聚核酸探針的一致度， 選擇與寡聚核酸探針一致度低的序列。在進(jìn)行Blast檢索時(shí)，同時(shí)對(duì)互補(bǔ)鏈進(jìn)行檢索，同時(shí) 選擇與寡聚核酸探針的互補(bǔ)鏈一致度低的序列。
另外，作為假寡聚核酸也可以使用如下得到的寡聚核酸將寡聚核酸探針的堿基 序列的例如從5’側(cè)依次將A置換為T(mén)，將T置換為A，將G置換為C且將C置換為G，相同 堿基連續(xù)M個(gè)(M為4)以上時(shí)，將從該連續(xù)序列中的MX0.2處(小數(shù)點(diǎn)以下四舍五入而得 的整數(shù))至MX 0.8處(小數(shù)點(diǎn)以下舍棄而得的整數(shù))的堿基利用其互補(bǔ)堿基進(jìn)行置換；具 有從5’側(cè)讀取或從3’側(cè)讀取為相同序列的N堿基(N為5)以上的回文序列時(shí)，利用其互 補(bǔ)的堿基置換至少NX0.2處(小數(shù)點(diǎn)以下四舍五入而得的整數(shù))的堿基，在N為偶數(shù)的情 況下至多為(N/2-1)處、N為奇數(shù)的情況下至多為((N-1V2-1)處的堿基，由此得到寡聚核 酸。這時(shí)的假寡聚核酸的GC含量、長(zhǎng)度都與寡聚核酸探針相同。
寡聚核酸探針可以在其至少1個(gè)堿基上附加低分子化合物標(biāo)記。另外，也可以附 加2種以上不同種類(lèi)的低分子化合物標(biāo)記。該低分子化合物標(biāo)記可以使用例如與以往方 法一樣的異羥基洋地黃毒甙元(Dig，digoxigenin)、FITC(異硫氰酸熒光素fluorescein isothiocyanate)等熒光色素(非專(zhuān)利文獻(xiàn)幻。使用例如Dig時(shí)，使用在抗異羥基洋地黃毒 甙元抗體上連接有堿性磷酸酶的蛋白質(zhì)，利用抗異羥基洋地黃毒甙元抗體部分來(lái)檢測(cè)Dig 標(biāo)記，進(jìn)而引發(fā)基于堿性磷酸酶-冊(cè)17^(1 的顯色反應(yīng)，進(jìn)行致敏(專(zhuān)利文獻(xiàn)3、4、5、6)。另 外，作為致敏法，除了基于上述堿性磷酸酶-NBT/BCIP的顯色反應(yīng)之外，也可以使用使酪胺 酰胺-熒光色素分子與在抗異羥基洋地黃毒甙元抗體上連接有過(guò)氧化酶的蛋白質(zhì)或者在 抗FITC抗體上連接有過(guò)氧化酶的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而進(jìn)行致敏的酪胺酰胺致敏法(TSA致敏 法)等(專(zhuān)利文獻(xiàn)10、11、12)。
對(duì)于低分子化合物標(biāo)記的附加而言，作為一個(gè)優(yōu)選方式為寡聚核酸探針的5’末端 堿基和3’末端堿基這2處。這樣的附加了標(biāo)記的寡聚核酸，可以從寡聚DNA合成服務(wù)公司 訂貨，可以容易地合成。
就寡聚核酸探針而言，對(duì)于一個(gè)目標(biāo)基因mRNA，使1或多種、即1 20種、優(yōu)選1 10種、進(jìn)一步優(yōu)選1 5種寡聚核酸探針與mRNA的不同區(qū)域發(fā)生雜交。通過(guò)使用這樣的多 種寡聚核酸探針，可以縮短雜交工序時(shí)間。進(jìn)而，寡聚核酸探針的濃度可以設(shè)為0. OlnM IOnM的范圍，通過(guò)使?jié)舛仍谏鲜龇秶鷥?nèi)上升，可以將雜交工序時(shí)間特別地縮短。另外，使用 多個(gè)寡聚核酸探針時(shí)，優(yōu)選寡聚核酸探針間的GC含量大致相同。這時(shí)的所謂大致相同，是 指兩者的GC含量的差異為士 10%、優(yōu)選為士5%、進(jìn)一步優(yōu)選為士3%、特別優(yōu)選為士0% (完全相同)的范圍。
此外，使多種在兩端具有標(biāo)記的寡聚核酸探針與目標(biāo)基因mRNA發(fā)生雜交時(shí)，使探 針的5’末端和3’末端相互之間隔開(kāi)8堿基以上。作為一個(gè)優(yōu)選方式，將探針的5’末端和 3’末端相互之間的距離設(shè)成所使用的寡聚核酸探針的長(zhǎng)度以上。
所謂相對(duì)于目標(biāo)基因mRNA設(shè)計(jì)多個(gè)這樣的寡聚核酸探針的方法，首先使用簡(jiǎn)單 的計(jì)算機(jī)程序，利用所需的寡聚核酸探針的長(zhǎng)度窗口，一邊從目標(biāo)基因mRNA的5’末端開(kāi) 始1個(gè)堿基1個(gè)堿基地錯(cuò)開(kāi)，一邊利用其窗口計(jì)算GC含量，直到窗口到達(dá)3’末端為止通過(guò) 實(shí)行計(jì)算可以容易地對(duì)具有所需的GC含量的探針序列的候選序列進(jìn)行列表，對(duì)經(jīng)列表的 候選序列使用NCBI (美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心National Center for Biotechnology hformation，美國(guó))的blast檢索，確認(rèn)作為探針序列的特異性，可以容易地選擇特異性高 的序列的互補(bǔ)鏈作為寡聚核酸探針的序列。
雜交時(shí)使用的緩沖液(雜交溶液)基本上可以采用在專(zhuān)利文獻(xiàn)1中記載的溶 液。在本發(fā)明中，在最終溶液中，使用了甲酰胺12. 5 % 25 %、3 X SSPE (Invitrogen 公司)、1 X Denhardt (和光純藥)，葡聚糖(Dextran) 10 % (V/V) (Sigma 公司)，0. 2 % CHAPS(Sigma-Aldrich公司))。通常在其中添加酵母菌或大腸桿菌的tRNA。另外，雜交的 溫度依賴(lài)于所使用的寡聚DNA探針的長(zhǎng)度和GC含量，但可以在從30攝氏度至45攝氏度的 范圍實(shí)施。例如寡聚DNA探針的長(zhǎng)度為40堿基、GC含量為50%的情況下，優(yōu)選在40攝氏 度至42攝氏度進(jìn)行實(shí)施。雜交的時(shí)間是實(shí)施12小時(shí)至M小時(shí)，優(yōu)選實(shí)施16小時(shí)。
基于如以上所述的RNA原位雜交法，可以定量檢測(cè)目標(biāo)基因mRNA。例如，使用異羥 基洋地黃毒甙元(Dig)作為標(biāo)記時(shí)，使用連結(jié)有過(guò)氧化酶(POD)的抗異羥基洋地黃毒甙元 抗體實(shí)施基于酪胺酰胺-熒光色素的TSA致敏法，通過(guò)10倍至40倍的物鏡的熒光顯微鏡 利用CCD照相機(jī)對(duì)組織試樣進(jìn)行攝影，使用Image J (NIH, http //rsb. info. nih. gov/ij/) 等圖像處理軟件，對(duì)得到的顯微鏡圖像進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理，求出熒光色素的信號(hào)強(qiáng)度，由此就 能夠簡(jiǎn)便且定量地對(duì)目標(biāo)基因的mRNA的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。
酪胺酰胺致敏用的試劑類(lèi)和酪胺酰胺-熒光分子，由Perkin Elmer公司、 Invitrogen公司銷(xiāo)售，可以使用這些產(chǎn)品。另外，相對(duì)于結(jié)合有POD的標(biāo)記分子的抗體，由 Dako公司、Roche公司等銷(xiāo)售，可以使用這些產(chǎn)品。
進(jìn)而，使用附加有2種以上的標(biāo)記i作為低分子化合物標(biāo)記的寡聚核酸探針時(shí)，利 用相對(duì)于附加有POD的各標(biāo)記i的抗體，使用酪胺酰胺-熒光色素i來(lái)多階段地進(jìn)行酪胺 酰胺增敏致敏，使用熒光顯微鏡對(duì)熒光色素i的信號(hào)進(jìn)行多重檢測(cè)，由此能夠?qū)?種以上的目標(biāo)基因的mRNA進(jìn)行局部存在性檢測(cè)和定量檢測(cè)。目標(biāo)基因的表達(dá)量低時(shí)，通過(guò)增加與目 標(biāo)基因的mRNA發(fā)生雜交的寡聚核酸探針的數(shù)量、或寡聚核酸探針的濃度，可以擴(kuò)大檢測(cè)范 圍的寬度。相應(yīng)地，目標(biāo)基因的表達(dá)量高時(shí)，可以通過(guò)降低與目標(biāo)基因的mRNA雜交的寡聚 核酸探針中的標(biāo)記的數(shù)量、探針的數(shù)量、寡聚核酸探針的濃度或所使用的酪胺酰胺-熒光 色素的濃度，使檢測(cè)范圍的寬度與表達(dá)量低的基因mRNA為同等程度。由此，對(duì)表達(dá)量不同 的多個(gè)基因的mRNA而言，可以以同等程度的信號(hào)的強(qiáng)度和范圍寬度來(lái)進(jìn)行局部存在性檢 測(cè)和定量檢測(cè)，可以在病理組織診斷等中利用。
以下，示出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)且具體的說(shuō)明，但是本發(fā)明不限于以 下的例子。
此外，在實(shí)施例中，使用包含以下的堿基序列的合成寡聚核酸。
序列編號(hào)1 5，-catccagaacactaaacagaagatggcagtggccagtagc-3'
序列編號(hào)2 5，-gaagaagtccactgcattccctgaggtgacattctccaca-3'
序列編號(hào)3 5，-tcattgaaggtcttaaacctcttgagggccgggttgggca-3'
序列編號(hào)4 5，-cgctgtgcttgaacagggcacttgtgatgtcttggatact-3'
序列編號(hào)5 5，-tagtcccagctactcaggaagctgaggtgggaggatggct-3'
序列編號(hào)6 5，-gctcccggcgatacgagggtccgatcttagctcgttgaca-3'
序列編號(hào)7 5，-cttataagtgggagctgaacaatgagaacacatggacaca-3'
序列編號(hào)8 5，-gggaggggaacattgcacaccagggcctgttgtgggggag-3'
序列編號(hào)9 5，-agccatcctcccacctcagcttcctgagtagctgggacta-3'
序列編號(hào)105-tgtgtccatgtgttctcattgttcagctcccacttataag-3
序列編號(hào)115-ctcccccacaacaggccctggtgtgcaatgttcccctccc-3
序列編號(hào)125-ctggagatactgggaaaaggcaatcaggactaggcctttg-3
序列編號(hào)135-cgcagtgtccgaggaagatagctgttccttaactttggca-3
序列編號(hào)145-caggggttatatccgttttaaccggaagtccagtcttggc-3
序列編號(hào)155-gaacagctatcttcctcggacactgcg-3，
序列編號(hào)165-ggtagaggcgaagtccttatcttccac-3，
序列編號(hào)175-attgatgccaagactggacttccggtta-3'
序列編號(hào)185-tgtccttccaaatgagctggcaagtg-3，
序列編號(hào)195-ggagtttcccaaacactcagtgaaacaaag-3'
序列編號(hào)205-acttcaacaagaacagtatccaagacatcac-3'
序列編號(hào)215-gggtgcatcgctggtaacatcc-3，
序列編號(hào)225-ctcaagatcgcattcatgcgtcttcac-3，
序列編號(hào)235-aaatcccttcacactctttttggagata-3'
序列編號(hào)245-aagcacatggcaccaatgacgttagccaccgattccacca-3
序列編號(hào)255-gtcttggtagtgctcctggacagttttctgcagaaacagc-3
序列編號(hào)265-atgttgacaatcttctcctcggggatgagaccgccattgt-3
序列編號(hào)275-ctcatggatcttcctctgcacgttaggccatgtcacaagt-3
序列編號(hào)285-cggcaacacacgtctttgcaaagtctgttacttcctgcac-3
序列編號(hào)295-ctttaatgtcacgcacgatttccctctcagctgtggtggt-3
序列編號(hào) 30 :5，-atttctcgtggttcacacccatcacaaacatgggggcatc-3，
Ιψβ}^^ 31 :5，—gtggtgcaggatgcattgctgac已已tcttgagggagttgt_3，
Ιψβ}^^ 32 :5，—tggtggtgcaggatgcattgctgac已已tcttgagggagtt_3，
Ιψβ}^^ 33 :5，—agttggtggtgcaggatgcattgctgac已已tcttgaggga_3，
i^^lllS^ 34 :5，_agcagttggtggtgcaggatgcattgctgacaatcttgag_3，
序列編號(hào) 35 :5，-aattgaatgtagtttcatggatgccacaggattccatacc-3，
序列編號(hào) 36 :5，-ggatgcggcagtggccatctcttgctcgaagtctagggca-3，
序列編號(hào) 37 :5，-ctgtcaggtcccggccagccaggtccagacgcaggatggc-3，
序列編號(hào) 38 :5，-cagaaccatcacgaggacctgtcataagacgtctttgtcg-3，
序列編號(hào)1 4分別是與小鼠Cypla2基因mRNA發(fā)生雜交的寡聚核酸的堿基序列。
序列編號(hào)5、7、8是包含人轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列的局部序列的寡聚核酸的堿基序列。序 列編號(hào)9-11分別是包含序列編號(hào)5、7、8的互補(bǔ)序列的寡聚核酸的堿基序列。
序列編號(hào)6是包含擬南芥POD基因的局部序列的寡聚核酸的堿基序列。
序列編號(hào)12是與小鼠alb基因mRNA雜交的寡聚核酸的堿基序列，序列編號(hào)13、14 是與小鼠Arntl基因mRNA雜交的寡聚核酸的堿基序列。
序列編號(hào)15、16是小鼠Arntl基因的PCR引物組的堿基序列，序列編號(hào)17是與小 鼠Arntl基因?qū)?yīng)的TaqMan Probe的堿基序列。
序列編號(hào)18、19是小鼠Cypla2基因的引物組的堿基序列，序列編號(hào)20是與小鼠 Cypla2基因?qū)?yīng)的TaqMan Probe的堿基序列。
序列編號(hào)21、22是小鼠Alb基因的引物組的堿基序列，序列編號(hào)23是與小鼠Alb 基因?qū)?yīng)的TaqMan Probe的堿基序列。
序列編號(hào)M-27分別是與小鼠Cypla2基因mRNA雜交的寡聚核酸的堿基序列。
序列編號(hào)觀是與小鼠Alb基因mRNA雜交的寡聚核酸的堿基序列。
序列編號(hào)四是大鼠Actb基因mRNA，序列編號(hào)30-34分別是大鼠Gapdh基因mRNA， 序列編號(hào)35-37分別是與大鼠Actb基因mRNA雜交的寡聚核酸的堿基序列。
序列編號(hào)38是從序列編號(hào)27的寡聚核酸的5’側(cè)依次將A置換為T(mén)、T置換為Α、 G置換為C并且將C置換為G、將TTTT的連續(xù)序列與ATAA置換而合成的寡聚核酸的堿基序 列。
實(shí)施例1 (假寡聚核酸添加比率的實(shí)驗(yàn))
求出與假寡聚DNA的探針濃度相對(duì)應(yīng)的最適添加比率。對(duì)象組織使用小鼠肝臟， 將檢測(cè)對(duì)象的基因設(shè)為Cypla2。將8周齡雄小鼠的肝臟利用通常的福爾馬林固定、石蠟包 埋制成石蠟塊，制成厚度5微米的連續(xù)切片，進(jìn)行脫石蠟處理，再利用蛋白酶Kanvitrogen 公司，Proteinase K SOL. RNA, 25530049)處理，然后實(shí)施RNA原位雜交。作為檢測(cè)基因 Cypla2的mRNA的探針，使用兩端被FITC標(biāo)記了的4種單鏈寡聚DNA探針(序列編號(hào)1 4)。在Cypla2基因的mRNA上，序列編號(hào)1 4按照編號(hào)順序沿著從5’末端至3’末端的 方向排列，對(duì)于到相鄰的寡聚DNA探針為止的距離，序列編號(hào)1和2為594堿基，序列編號(hào) 2和3為16堿基，序列編號(hào)3和4為61堿基。另外，使用序列編號(hào)5所示的假寡聚DNA (單 鏈)。FITC標(biāo)記的檢測(cè)使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗體P5100，實(shí)施基于酪胺酰 胺-FLU (Perkin-Elmer 公司，TSA Plus 熒光素系統(tǒng)，NEL741B001KT)的 TSA 致敏。圖 1 示出14相對(duì)于4種探針濃度分別為1ηΜ(納摩爾)、2nM、3nM3nM、5nM，即分別合計(jì)4nM、8nM、12nM、 16nM、20nM的情況，使用假寡聚DNA的濃度是以1倍、2倍、4倍、6倍、8倍、10倍的濃度進(jìn) 行添加的雜交溶液進(jìn)行定量性RNA原位雜交的結(jié)果。此外，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)的OnM時(shí)，添加 200nM的假寡聚DNA。圖像是以10倍物鏡并使用Zeiss熒光顯微鏡Axioplan2和CXD照相 機(jī)AxioCam對(duì)連續(xù)切片的相同區(qū)域進(jìn)行攝影。利用Image J軟件(NIH，http //rsb. info, nih. gov/ij/)對(duì)這些圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理，將從各圖像的信號(hào)強(qiáng)度中減去探針濃度為 OnM時(shí)的信號(hào)強(qiáng)度而得到的值作為各圖像的信號(hào)強(qiáng)度，從而求得。圖2是將這些結(jié)果作為假 寡聚DNA的添加比率與檢測(cè)Cypla2基因mRNA而得到的信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系，將橫軸設(shè)為假寡 聚DNA的添加比率，將縱軸設(shè)為信號(hào)強(qiáng)度(IntDen)而進(jìn)行圖示。由圖2可知，假寡聚DNA 的添加比率為8倍時(shí)，寡聚DNA探針的濃度與信號(hào)強(qiáng)度的順序關(guān)系得到維持，與信號(hào)強(qiáng)度的 范圍也維持相同順序關(guān)系的1倍相比，較寬。另外，由圖2可知，一般而言隨著探針濃度的 升高信號(hào)強(qiáng)度也增強(qiáng)。進(jìn)而，算出了對(duì)于在寡聚DNA探針的濃度和信號(hào)強(qiáng)度的順序關(guān)系得 到維持的添加比率為8倍時(shí)和1倍時(shí)的各圖像來(lái)說(shuō)，表示其熒光強(qiáng)度相對(duì)于寡聚DNA探針 的濃度為OnM時(shí)的圖像的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了多少倍的比率(圖3)。探針濃度低的情況下，例 如如InM時(shí)那樣，在RNA原位雜交的信號(hào)弱時(shí)，該比率顯示出背景噪聲的增強(qiáng)。S卩，假寡聚 DNA的添加比率為1倍時(shí)，與添加比率為8倍時(shí)相比該比率大，背景噪聲高的現(xiàn)象可以從圖 3得知。另一方面，寡聚DNA探針的濃度高時(shí)，該比率顯示出基于RNA原位雜交的信號(hào)強(qiáng)度 的增加。添加比率為8倍時(shí)，添加比率與1倍時(shí)相比，背景噪聲少的部分，圖像整體的信號(hào) 強(qiáng)度降低。然而，隨著寡聚DNA探針的濃度提高，對(duì)于該比率的上升度而言，添加比率為8 倍時(shí)比添加比率為1倍時(shí)大，這表示添加比率為8倍時(shí)動(dòng)態(tài)范圍寬。由圖3可知，添加比率 為8倍時(shí)與添加比率為1倍時(shí)相比，動(dòng)態(tài)范圍變寬1. 375倍。
實(shí)施例2 (假寡聚DNA、鮭魚(yú)精子DNA和無(wú)添加的比較)
對(duì)假寡聚DNA和鮭魚(yú)精子DNA、及不添加的情況下的定量性RNA原位雜交的RNA 檢測(cè)中的效果進(jìn)行比較。在實(shí)驗(yàn)中，與實(shí)施例1同樣地使用福爾馬林固定、石蠟包埋的小鼠 肝臟組織試樣，制成連續(xù)切片，在實(shí)驗(yàn)中使用。檢測(cè)基因與實(shí)施例1相同，使用為Cypla2且 兩端進(jìn)行了 FITC標(biāo)記的由序列編號(hào)1 4所示的4種單鏈寡聚DNA探針，與4種探針各自 的濃度為0ηΜ(納摩爾)、1ηΜ、2ηΜ、3ηΜ、4ηΜ、5ηΜ的各種探針濃度相對(duì)應(yīng)，以添加比率為8倍 的濃度使用序列編號(hào)5(記為L(zhǎng)1C1)和序列編號(hào)6(記為arbp)所示的2種假寡聚DNA(單 鏈)。另外，相對(duì)于同樣的寡聚DNA探針濃度，使用^witrogen公司(分類(lèi)編號(hào)15632-011， Salmon Sperm DNA solution)的鮭魚(yú)精子DNA，添加至終濃度為100ug/ml (微克/毫升) (相當(dāng)于80nM)。另外，作為對(duì)照，進(jìn)行了不添加假寡聚DNA或者鮭魚(yú)精子DNA(記為無(wú)添 加)的實(shí)驗(yàn)。在FITC標(biāo)記的檢測(cè)中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗體P5100，實(shí)施基 于酪胺酰胺-FLU (Perkin-Elmer公司，TSA Plus熒光素系統(tǒng)，NEL741B001KT)的TSA致敏。 在圖4中，示出對(duì)于在連續(xù)切片的相同區(qū)域所得到的原位雜交圖像。從上段按順序示出無(wú) 添加的圖像、添加了鮭魚(yú)精子DNA時(shí)的圖像、添加了假寡聚DNA的LlCl時(shí)的圖像、添加了假 寡聚DNA的arbp時(shí)的圖像。另外，從左按順序4種寡聚DNA探針各自的濃度為OnM(納摩 爾)、1ηΜ、2ηΜ、3ηΜ、4ηΜ、5ηΜ。圖像為以10倍物鏡并使用Zeiss熒光顯微鏡Axioplan2和 CCD照相機(jī)AxioCam，對(duì)連續(xù)切片的相同區(qū)域進(jìn)行攝影而得到的。使用Image J軟件(NIH， http://rsb. info. nih. gov/ij/)對(duì)這些圖像進(jìn)行計(jì)算機(jī)處理，求得各濃度下的信號(hào)強(qiáng)度。寡聚DNA探針的濃度為OnM時(shí)，圖像的信號(hào)強(qiáng)度為背景的熒光強(qiáng)度QntDen)，將無(wú)添加、添 加了鮭魚(yú)精子DNA時(shí)、添加了假寡聚DNA的LlCl和arbp時(shí)的熒光強(qiáng)度示于圖5。添加了鮭 魚(yú)精子DNA時(shí)，背景的熒光強(qiáng)度比其他情況更強(qiáng)。接著，通過(guò)從各濃度下的信號(hào)強(qiáng)度減去該 背景的熒光強(qiáng)度，求出各濃度下的真實(shí)信號(hào)強(qiáng)度。將其示于圖6。在寡聚DNA探針濃度為 InM濃度而添加了假寡聚DNA的arbp時(shí)，真實(shí)信號(hào)強(qiáng)度比其他情況小，但是可以對(duì)比度良好 地看到信號(hào)，顯示出了伴隨寡聚DNA探針的添加而背景噪聲的上升小。由圖6可知，對(duì)于真 實(shí)信號(hào)而言，在添加了假寡聚DNA的LlCl或者arbp時(shí)，與添加了鮭魚(yú)精子DNA時(shí)或者無(wú)添 加時(shí)相比可以得到強(qiáng)1. 4倍至2. 5倍左右的信號(hào)(特別是探針濃度為2nM以上時(shí))。進(jìn)而 可知，添加了假寡聚DNA的LlCl時(shí)以及添加了 arbp時(shí)，探針濃度與信號(hào)強(qiáng)度之間的線(xiàn)性非 常好。
實(shí)施例3 (假寡聚DNA和鮭魚(yú)精子DNA的比較)
對(duì)假寡聚DNA、鮭魚(yú)精子DNA的定量性RNA原位雜交的RNA檢測(cè)中的效果進(jìn)行比 較。在實(shí)驗(yàn)中，與實(shí)施例1相同地使用福爾馬林固定、石蠟包埋的小鼠肝臟組織試樣，制成 連續(xù)切片，在實(shí)驗(yàn)中使用。檢測(cè)基因與實(shí)施例1相同，使用為Cypla2且兩端進(jìn)行了 FITC標(biāo) 記的由序列編號(hào)1 4所示的4種單鏈寡聚DNA探針，與4種探針各自的濃度為0ηΜ(納 摩爾)、1ηΜ、2ηΜ、3ηΜ、4ηΜ、5ηΜ的各種探針濃度相對(duì)應(yīng)，以添加比率為8倍的濃度使用序列 編號(hào)5所示的假寡聚DNA(單鏈)。另外，相對(duì)于同樣的探針濃度，使用^witrogen公司 (分類(lèi)編號(hào)15632-011，Salmon Sperm DNA solution)的鮭魚(yú)精子DNA，添加至終濃度為 100ug/ml (微克/毫升)(相當(dāng)于80nM)。在FITC標(biāo)記的檢測(cè)中，使用Dako公司的抗FITC 兔多克隆抗體P5100，實(shí)施基于酪胺酰胺-FLU (Perkin-Elmer公司，TSA Plus熒光素系統(tǒng)， NEL741B001KT)的致敏。圖7中，示出對(duì)于在連續(xù)切片的相同區(qū)域所得到的原位雜交圖像。 上段示出添加了假寡聚DNA的圖像，下段示出添加了鮭魚(yú)精子DNA的圖像。另外，從左按順 序4種寡聚0嫩探針各自的濃度為011]\1(納摩爾)、111]\1、211]\1、311]\1、411]\1、511]\1。圖像為以10倍 物鏡并使用Zeiss熒光顯微鏡AXioplan2和CXD照相機(jī)AxioCam，對(duì)連續(xù)切片的相同區(qū)域 進(jìn)行攝影而得到的。在這些圖像中，如圖7所示，設(shè)定信號(hào)存在的信號(hào)區(qū)域S和信號(hào)不存在 的噪聲區(qū)域N，使用Image J軟件(NIH, http://rsb. info. nih. gov/ij/)求出各區(qū)域中的 信號(hào)強(qiáng)度，再求出區(qū)域S、N中的信號(hào)強(qiáng)度的比率作為SN比(signal-to-noise ratio)。圖 8中，將所得到的SN比定為縱軸，將探針濃度定為橫軸，示出添加了假寡聚DNA的情況的SN 比和添加了鮭魚(yú)精子DNA的情況的SN比的比較。如圖8所示，寡聚DNA探針濃度和SN比 的關(guān)系呈現(xiàn)吊鐘狀，但也可以看出寡聚DNA探針濃度為2nM以上時(shí)假寡聚DNA與鮭魚(yú)精子 DNA相比SN比更優(yōu)良。
實(shí)施例4 (假寡聚DNA序列的種類(lèi))
實(shí)施對(duì)所使用的假寡聚DNA序列的種類(lèi)和數(shù)量進(jìn)行測(cè)試的實(shí)施例。在實(shí)驗(yàn)中，與 實(shí)施例1相同地使用福爾馬林固定、石蠟包埋的小鼠肝臟組織試樣，制成連續(xù)切片，進(jìn)行脫 石蠟處理,利用蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase K SOL. RNA, 25530049)進(jìn)行處理， 然后實(shí)施RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)基因與實(shí)施例1相同，使用為Cypla2且兩端進(jìn)行了 FITC 標(biāo)記的序列編號(hào)1 4的4種單鏈寡聚DNA探針，根據(jù)實(shí)施例2的結(jié)果，以4種探針各自濃 度為2nM(納摩爾)的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于在實(shí)驗(yàn)中使用的假寡聚DNA(單鏈)而言，使序 列L1W1、L1W2、L1W3(序列編號(hào)5、7、8)和序列L1W1、L1W2、L1W3 (序列編號(hào)9 11)為1種(L1C1、L1C2、L1C3 各 1 種、組 ID = 1)、1 種(LlffU L1W2、L1W3 各 1 種、組 ID = 2)、2 種混 合(L1C1和Llffl的混合、L1C2和L1W2的混合、L1C3和L1W3的混合、組ID = 5),3種混合 (L1CUL1C2 和 L1C3 的混合、組 ID = 3)、3 種混合(L1W1、L1W2、L1W3 的混合、組 ID = 4)、和 6種混合(組ID = 6)來(lái)進(jìn)行。此外，LlffU L1W2、L1W3的序列分別為與L1W1、L1W2、L1W3 互補(bǔ)的序列。以假寡聚DNA的濃度合計(jì)分別為64nM(各寡聚DNA探針的濃度2nM的合計(jì) SnM的8倍)的方式實(shí)施。在FITC標(biāo)記的檢測(cè)中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗體 P5100，實(shí)施基于酪胺酰胺-FLU (Perkin-Elmer公司，TSA Plus熒光素系統(tǒng)，NEL741B001KT) 的致敏。圖像是以10倍物鏡并利用Zeiss熒光顯微鏡Axioplan2和CXD照相機(jī)AxioCam 對(duì)連續(xù)切片(各圖像右上的數(shù)字表示連續(xù)切片的順序)的相同區(qū)域進(jìn)行攝影而得到的。在 圖9中示出該RNA原位雜交的結(jié)果。如圖9所示，混合6種上述假寡聚DNA時(shí)，對(duì)比度比其 他情況差，但是在任何假寡聚DNA組合中都得到良好的圖像。接著使用Image J軟件(NIH， http://rsb. info.nih.gov/ij/)求出各圖像的信號(hào)強(qiáng)度，在圖10和表1中示出。如圖10 所示，根據(jù)所使用的假寡聚DNA的種類(lèi)和組，在信號(hào)強(qiáng)度上沒(méi)有大的差別，可以得到良好的 結(jié)果。
表1
假寡聚DNAIntDen組ID組 a.v.組 s.d.L1C12196.30212249.49162.96Ll C22432.394Ll C32119.767L1W12572.02422547.4734.298L1W22508.280L1W32562.096L1C1.C2.C32532.91532532.9264.242L1W1.W2.W32442.06342442.0664.242L1C1.W12398.46352459.60124.27L1C2.W22602.592L1C3.W32377.751L1C1,C2,C3, W1,W2,W32823.04462823.040
實(shí)施例5 (探針數(shù)和信號(hào)強(qiáng)度)
實(shí)施例示出在檢測(cè)中使用的探針的種類(lèi)數(shù)和所檢測(cè)的信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系。理論上， 在雜交溶液中，發(fā)生雜交的各寡聚核酸探針的濃度均勻且GC含量為50%并均勻時(shí)，雜交過(guò) 程中的平衡常數(shù)K在各寡聚核酸探針間是相同的，相對(duì)于寡聚核酸探針i，下式是成立的，
K = [Hi]/[fR] · [fPi](式 1)
游離的寡聚核酸探針濃度[fPi]相對(duì)于各寡聚核酸探針是相同的。進(jìn)而，寡聚核 酸探針i發(fā)生雜交的量(濃度)Hi用下式表示，
[Hi] = K · [fR] · [fPi](式 2)
其中，17
[HI] = [H2]=…=[HN](式 3)
因此，所觀察的信號(hào)強(qiáng)度I以來(lái)加和計(jì)算，
I = S([Hl])+....+S([HN])(式 4)
依賴(lài)于雜交溶液中的寡聚核酸探針的種類(lèi)數(shù)N以增函數(shù)的方式(理論上成比例) 增加。
在實(shí)驗(yàn)中，與實(shí)施例1相同地使用福爾馬林固定、石蠟包埋的小鼠肝臟組織試 樣，制成連續(xù)切片，進(jìn)行脫石蠟處理，再以蛋白酶Kanvitrogen公司，Proteinase K SOL. RNA, 25530049)進(jìn)行處理，然后實(shí)施RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)基因與實(shí)施例1相同，使用為 Cypla2且兩端進(jìn)行了 FITC標(biāo)記的序列編號(hào)1 4的4種單鏈寡聚DNA探針，以4種寡聚DNA 探針各自的濃度為2nM(納摩爾)、寡聚DNA探針為1種、2種、3種、4種的條件以及不插入寡 聚DNA探針的條件來(lái)進(jìn)行。在假寡聚DNA (單鏈)中，使用序列編號(hào)5的假寡聚DNA (LlCl)， 以濃度為所使用的寡聚DNA探針濃度的合計(jì)的8倍來(lái)實(shí)施。即，1種寡聚DNA探針時(shí)，為 16nM，2種寡聚DNA探針時(shí)為32nM，3種寡聚DNA探針時(shí)為48nM，4種寡聚DNA探針時(shí)為64nM。 此外，在沒(méi)有寡聚DNA探針的條件下，將假寡聚DNA的濃度設(shè)為64nM。在FITC標(biāo)記的檢測(cè) 中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗體P5100，實(shí)施基于酪胺酰胺-FLU(Perkin-Elmer 公司，TSA Plus熒光素系統(tǒng)，NEL741B001KT)的致敏。圖像是以10倍物鏡并使用Zeiss熒 光顯微鏡AXioplan2和CXD照相機(jī)AxioCam，對(duì)連續(xù)切片的相同區(qū)域進(jìn)行攝影而得到的。在 圖11示出圖像。接著使用Image J軟件(NIH, http://rsb. info. nih. gov/ij/)臨時(shí)求出 各圖像的信號(hào)強(qiáng)度，并求出從這些數(shù)值中減去沒(méi)有加入寡聚DNA探針的條件下的圖像的信 號(hào)強(qiáng)度，將所得值作為在各探針?lè)N類(lèi)數(shù)的圖像中的信號(hào)強(qiáng)度。將結(jié)果在圖12中示出，其中 將縱軸定為信號(hào)強(qiáng)度，橫軸定為寡聚DNA探針的種類(lèi)數(shù)來(lái)繪圖。如圖所示，添加假寡聚DNA 時(shí)，寡聚DNA探針的種類(lèi)數(shù)和信號(hào)強(qiáng)度落在清晰的右上直線(xiàn)上，存在線(xiàn)形的關(guān)系。
實(shí)施例6 (探針濃度)
本實(shí)施例示出了隨著在檢測(cè)中使用的寡聚DNA探針的濃度上升，信號(hào)強(qiáng)度發(fā)生怎 樣的變化。
雜交是一種平衡反應(yīng)，理論上成為下式的平衡常數(shù)與雜交產(chǎn)物的濃度[H]、游離 mRNA濃度[fR]和游離寡聚DNA探針的濃度[fP]之間的關(guān)系式是成立的。
K= [H] / [fR] ‘ [fP]
由于下述2式成立，因此雜交的寡聚DNA探針的濃度越高，雜交了的產(chǎn)物越增加。 在本實(shí)施例中，隨著寡聚DNA探針的濃度的升高，信號(hào)強(qiáng)度也顯示出線(xiàn)性增強(qiáng)。
雜交的寡聚DNA探針的濃度PO = [H] + [fP]
組織樣品中存在的mRNA濃度RO = [H] + [fR](在組織試樣中恒定)
在實(shí)驗(yàn)中，與實(shí)施例1相同地使用福爾馬林固定、石蠟包埋的小鼠肝臟組織試樣， 制成連續(xù)切片，進(jìn)行脫石蠟處理，再以蛋白酶Kanvitrogen公司，Proteinase K SOL. RNA， 25530049)進(jìn)行處理，然后實(shí)施RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)基因使用為白蛋白Alb且兩端進(jìn)行 7 FITC標(biāo)記的序列編號(hào)12的單鏈寡聚DNA探針，以O(shè)nM(無(wú)探針)、0· 1ηΜ、0. 25ηΜ、0· 5ηΜ、 InM、1. 5nM的6種濃度來(lái)實(shí)施。在假寡聚DNA中，使用序列編號(hào)5的假寡聚DNA (單鏈)，以 濃度為所使用的寡聚DNA探針的濃度的8倍來(lái)實(shí)施。在沒(méi)加入寡聚DNA探針的雜交溶液中， 使用了 12nM的假寡聚DNA。在FITC標(biāo)記的檢測(cè)中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗體P5100，實(shí)施基于酪胺酰胺-FLU (Perkin-Elmer公司，TSA Plus熒光素系統(tǒng)，NEL741B001KT) 的致敏。圖像是以10倍和20倍的物鏡并使用Zeiss熒光顯微鏡Axioplan2和CXD照相機(jī) AxioCam，對(duì)連續(xù)切片的相同區(qū)域進(jìn)行攝影而得到的。在圖13中示出圖像(上段為10倍物 鏡，下段為20倍物鏡的圖像)。另外，使用Image J軟件(NIH,http//rsb. info. nih. gov/ ij/)，利用計(jì)算機(jī)求得各濃度下的圖像的信號(hào)強(qiáng)度，再求出減去寡聚DNA探針的濃度為OnM 的圖像中的信號(hào)強(qiáng)度所得的值，作為真實(shí)信號(hào)強(qiáng)度。將其結(jié)果示于圖14，其中縱軸定為信號(hào) 強(qiáng)度，橫軸定為探針濃度，從而畫(huà)圖(圖Ha為與圖13的10倍物鏡的圖像相對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng) 度，圖14b為與圖13的20倍物鏡的圖像相對(duì)應(yīng)的信號(hào)強(qiáng)度)。如圖所示，隨著探針濃度上 升，信號(hào)強(qiáng)度也線(xiàn)性地增強(qiáng)，但是從某些濃度(如圖14所示，為Alb基因時(shí)是InM)開(kāi)始以 上，信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到飽和。這反映出，如實(shí)施例9中定量PCR的結(jié)果所示那樣，Alb基因在肝 臟中的表達(dá)量非常高。
實(shí)施例7 (探針濃度)
該實(shí)施例示出了隨著檢測(cè)中使用的探針的濃度上升，信號(hào)強(qiáng)度有著怎樣的變化。 在實(shí)驗(yàn)中，與實(shí)施例1相同地使用福爾馬林固定、石蠟包埋的小鼠肝臟組織試樣，制成連續(xù) 切片，進(jìn)行脫石賭處理，再以蛋白酶Kanvitrogen公司，Proteinase K SOL. RNA, 25530049) 進(jìn)行處理，然后實(shí)施RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)基因與實(shí)施例1、2相同，使用為Cypla2且兩 端進(jìn)行了 FITC標(biāo)記的序列編號(hào)1 4的4種單鏈寡聚DNA探針，相對(duì)于4種寡聚DNA探 針各自的濃度為0ηΜ(納摩爾)、1ηΜ、2ηΜ、3ηΜ、4ηΜ、5ηΜ的各種寡聚DNA探針的濃度，以添 加比率為8倍的濃度使用序列編號(hào)5所示的假寡聚DNA (單鏈)。在未加入寡聚DNA探針 的雜交溶液中，使用64ηΜ的假寡聚DNA。在FITC標(biāo)記的檢測(cè)中，使用Dako公司的抗FITC 兔多克隆抗體Ρ5100，實(shí)施基于酪胺酰胺-FLU (Perkin-Elmer公司，TSA Plus熒光素系統(tǒng)， NEL741B001KT)的致敏。圖像是以10倍物鏡使用Zeiss熒光顯微鏡Axioplan2和CCD照相 機(jī)AxioCam，對(duì)連續(xù)切片的相同區(qū)域3處進(jìn)行攝影而得到的。在圖15中示出圖像。另外，使 用Image J軟件(NIH, http://rsb. info. nih. gov/i j/)，利用計(jì)算機(jī)求出各濃度下的各區(qū) 域的圖像的信號(hào)強(qiáng)度，再計(jì)算減去探針濃度為OnM的圖像中的信號(hào)強(qiáng)度所得的值，作為真 實(shí)信號(hào)強(qiáng)度，并求出3處的平均值。將其結(jié)果示于圖16，其中將縱軸定為信號(hào)強(qiáng)度，將橫軸 定為探針濃度，從而畫(huà)圖。如圖所示，由于假寡聚DNA的添加，隨著探針濃度上升，信號(hào)強(qiáng)度 也直線(xiàn)性地增強(qiáng)。
實(shí)施例8 (表達(dá)量和信號(hào)強(qiáng)度)
本實(shí)施例是示出基于表達(dá)量和信號(hào)強(qiáng)度的關(guān)系呈線(xiàn)性的原理，通過(guò)利用本發(fā)明的 RNA原位雜交可以對(duì)目標(biāo)基因mRNA進(jìn)行定量檢測(cè)的實(shí)施例。本實(shí)施例中的檢測(cè)基因?yàn)殡S 著晝夜節(jié)律而表達(dá)量發(fā)生變動(dòng)的Arntl，使用8周齡的雄小鼠，在上午9時(shí)至深夜1時(shí)(25 時(shí))為止每隔4小時(shí)一個(gè)取樣點(diǎn)的5點(diǎn)之中，每2個(gè)個(gè)體采對(duì)象組織的肝臟(外側(cè)左葉)， 切成兩半之后，將從切斷面分別向兩側(cè)2mm的范圍制成用于福爾馬林固定、石蠟包埋的組 織試樣和用于提供給定量PCR的RNA提取用組織試樣。
與實(shí)施例1相同地通過(guò)福爾馬林固定、石蠟包埋制成組織試樣，制成連續(xù)切片，進(jìn) 行脫石賭處理，再以蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase KS0L. RNA, 25530049)進(jìn)行處 理，然后實(shí)施RNA原位雜交實(shí)驗(yàn)。對(duì)于檢測(cè)基因Arntl的寡聚核酸探針而言，使用濃度分 別為2nM(納摩爾)的兩端進(jìn)行了 Dig標(biāo)記的序列編號(hào)13和14(在Arntl基因的mRNA上的距離為21堿基)的單鏈寡聚DNA探針。假寡聚DNA(單鏈)以相比于序列編號(hào)5所示的 LlCl為8倍的添加比率的濃度使用。在Dig標(biāo)記的檢測(cè)中，使用抗Dig抗體(羅氏公司，抗 異羥基洋地黃毒甙元-P0D，1207733)，在TSA致敏中，使用了酪胺酰胺_Cy3 (Perkin-Elmer 公司，TSA Plus花青素3系統(tǒng)，NEL744B001KT)。圖像是利用10倍物鏡，使用Zeiss熒光顯 微鏡AXioplan2和CXD照相機(jī)AxioCam攝影而得到的。圖17中示出了各時(shí)間點(diǎn)的1個(gè)個(gè) 體的肝臟中的2區(qū)域的圖像。另外，使用Image J軟件(NIH, http://rsb. info. nih. gov/ ij/)，利用計(jì)算機(jī)求出各時(shí)刻的圖像的信號(hào)強(qiáng)度，與基于定量PCR的表達(dá)量進(jìn)行了比較。在 Arntl基因mRNA的定量PCR中的表達(dá)量的定量中，使用序列編號(hào)15和16所示的正向和反 向引物，利用TaqMan法實(shí)施定量PCR。此外，TaqMan探針的序列由序列編號(hào)17示出。另夕卜， 同時(shí)進(jìn)行了作為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的Actb的定量PCR (Actb的PCR引物和TaqMan探針由Applied Biosystems購(gòu)買(mǎi))。此外，定量PCR使用Applied Biosystems 7500 Reat-time PCR System, 按照其帶有的操作流程實(shí)施。圖18以對(duì)每4小時(shí)采取的組織試樣進(jìn)行定量PCR而求得的 Ct值的變化的形式示出了目標(biāo)基因Arntl和Actb的表達(dá)量的變化。圖19中示出基于目標(biāo) 基因Arntl的RNA原位雜交而求得的信號(hào)強(qiáng)度的變化。另外，在圖20中，對(duì)通過(guò)各個(gè)體所 采取的肝臟中的目標(biāo)基因Arntl的定量PCR而求得的Ct值和通過(guò)RNA原位雜交求得的信 號(hào)強(qiáng)度的各時(shí)刻組的平均值繪圖，示出了基于定量PCR的Ct值和基于RNA原位雜交的信號(hào) 強(qiáng)度之間的關(guān)系。如圖20所示，由于假寡聚DNA的添加，定量PCR的Ct值和信號(hào)強(qiáng)度顯示 了良好的相關(guān)(mRNA的表達(dá)量多時(shí)Ct值變小，因此將Ct值定為縱軸，將信號(hào)強(qiáng)度定為橫軸 時(shí)，為如該圖所示的朝向右下的相關(guān))。
實(shí)施例9 (表達(dá)量和信號(hào)強(qiáng)度，2色)
在該實(shí)施例中，作為組織試樣，使用實(shí)施例8中使用的午后1時(shí)的8周齡的雄小鼠 1個(gè)個(gè)體的肝臟，與目標(biāo)基因Cypla2相對(duì)應(yīng)使用兩端利用Dig標(biāo)記了的寡聚DNA探針，與目 標(biāo)基因Alb相對(duì)應(yīng)使用兩端利用FITC標(biāo)記了的寡聚DNA探針，實(shí)施多階段的TSA致敏，利 用2色的熒光色素對(duì)2個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行定量檢測(cè)，與這些基因的基于定量PCR的Ct值進(jìn)行 比較。
在Cypla2基因mRNA的基于定量PCR的表達(dá)量的定量中，使用序列編號(hào)18和19 所示的正向和反向引物，實(shí)施基于iTaqMan法的定量PCR。此外，TaqMan探針的序列如序列 編號(hào)20所示。在Alb基因mRNA的基于定量PCR的表達(dá)量的定量中，使用序列編號(hào)21和22 所示的正向和反向引物，實(shí)施基于iTaqMan法的定量PCR。此外，TaqMan探針的序列如序列 編號(hào) 23 所示。此外，定量 PCR 使用 Applied Biosystems 7500 Reat-time PCR System，按 照其帶有的流程實(shí)施。Alb基因的Ct值為22. 135 (擴(kuò)增效率1. 0178)，Cypla2基因的Ct值 為27. 053 (擴(kuò)增效率1. 0008)，約2的5次方即1 倍左右，顯示出Alb基因的表達(dá)量多。
對(duì)于所使用的寡聚DNA探針而言，與Cypla2基因相對(duì)應(yīng)使用5種兩端Dig標(biāo)記 的寡聚DNA探針(序列編號(hào)2和M 27所示的探針組)或者1種序列編號(hào)2所示的探 針，與Alb基因相對(duì)應(yīng)使用了 2種兩端FITC標(biāo)記的序列編號(hào)12和28所示的寡聚DNA探 針。另外，假寡聚DNA使用序列編號(hào)5中示出的L1C1。在實(shí)驗(yàn)中，將小鼠肝臟進(jìn)行通常的 福爾馬林固定、石蠟包埋后，制成連續(xù)切片，進(jìn)行脫石蠟處理，再以蛋白酶Kanvitrogen 公司，Proteinase K SOL. RNA, 25530049)進(jìn)行處理后，使用上述探針的混合物，實(shí)施RNA 原位雜交。Dig標(biāo)記的檢測(cè)使用抗Dig抗體(羅氏公司，抗異羥基洋地黃毒甙元-P0D，1207733)，在TSA致敏中使用酪胺酰胺_Cy3 (Perkin-Elmer公司，TSA Plus花青素3系統(tǒng)， NEL744B001KT)。另外，在FITC標(biāo)記的檢測(cè)中使用抗FITC抗體(Dako公司的抗FITC兔多 克隆抗體，P5100)，TSA致敏中使用酪胺酰胺-FLU (Perkin-Elmer公司，TSA Plus熒光素系 統(tǒng)，NEL741B001KT)。此外，顯微鏡攝影利用10倍的物鏡，使用kiss熒光顯微鏡AXioplan2 和CCD照相機(jī)AxioCam。
由定量PCR的結(jié)果可知，Cypla2基因僅表達(dá)了 Alb基因的大約1 分之一。圖19 中示出了使用2枚連續(xù)切片，在相同切片中利用Cy3檢測(cè)Cypla2基因mRNA，利用FLU檢測(cè) Alb基因mRNA的例子。圖21的上段示出在Cypla2基因的檢測(cè)中僅使用1個(gè)探針時(shí)(切片 1)的結(jié)果，下段表示使用了 5種探針的組時(shí)(切片2)的原位雜交圖像。如圖所示，二個(gè)基 因的表達(dá)的局部存在性不同，Alb基因在PV(門(mén)靜脈)區(qū)域表達(dá)，Cypla2基因在CV(中央靜 脈)區(qū)域表達(dá)。進(jìn)而，對(duì)于Cypla2基因mRNA的檢測(cè)，在探針數(shù)為1時(shí)，信號(hào)非常弱，但是將 探針數(shù)設(shè)為5時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度與Alb基因mRNA的FLU的信號(hào)強(qiáng)度接近。即，如上述所述，定量 PCR的結(jié)果雖然是Cypla2基因僅表達(dá)了 Alb基因大約1 分之一，但是通過(guò)增加探針的種 類(lèi)數(shù)，掩蓋了 10的2次方倍的表達(dá)量的差距，成功地提高了信號(hào)強(qiáng)度。圖21的圖像中，使 用Image J分別對(duì)切片1、切片2在PV區(qū)域、CV區(qū)域中分別設(shè)定8個(gè)圖21所示尺寸的圓形 小區(qū)域，測(cè)定FLU的信號(hào)強(qiáng)度和Cy3的信號(hào)強(qiáng)度，將該情況在表2中匯總。如表2的范圍評(píng) 價(jià)的CV區(qū)域的項(xiàng)中所記載那樣，Cy3的最大信號(hào)強(qiáng)度從與Cypla2對(duì)應(yīng)的1種寡聚DNA探 針時(shí)的39. 75增強(qiáng)至5種寡聚DNA探針時(shí)的151. 00，可以與Alb的PV區(qū)域中的最大信號(hào)強(qiáng) 度(切片1中137. 88，切片2中142. 38)相匹敵。
如該實(shí)施例這樣，由于假寡聚DNA的添加，通過(guò)相對(duì)于多個(gè)目標(biāo)基因，調(diào)整所使用 的寡聚DNA探針的數(shù)和濃度，即使在目標(biāo)基因的表達(dá)量存在IO2 IO3倍差距的情況下，也 可以將信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整為相同程度。
[表2] 對(duì)比度評(píng)價(jià)切片ID基因探針濃度 合計(jì)(nm)探針數(shù)IntaFLUCy3PV區(qū)域CV區(qū)域Atb PV/CVCyp1a2 CV/PV3V0.ave.s.d.切片1 切片2Alb AlbI I2 241,96 41.25292 3.0226.07 22.801.98 .851働 Γ610切片1 切片2Cyp1α2 Cypla22 1DI 56.86 11.490.40 0.989.79 26.53Q.5G 2.811.422 2.309
范圍評(píng)價(jià)
切片IDGbne探針濃度 合計(jì)(nm)探針數(shù)Range (Signal mex-mir>)范圍比PV區(qū)域CV區(qū)域Afb PV/CVCypla CV/PVeve.s.d.ave.6.d.叻片1 切片2Alb Alb！ 12 2 37.Β8 142.3810.99 θ.6298.38 104.387.87 5.131.402 1.354切片1 切片2Cyp 1a2 Cyp1a22 !01 533.88 57.257.1B )3.8439-75 151.005.7B 15.421.173 2.638
實(shí)施例10 (酪胺酰胺濃度)
該實(shí)施例在小鼠肝臟中，使用與白蛋白(Alb)基因相對(duì)應(yīng)的寡聚DNA探針(序列編 號(hào)12，兩端FITC標(biāo)記，濃度InM)，觀察到了酪胺酰胺增敏中的酪胺酰胺-FLU(Perkin-Elmer 公司，TSA Plus熒光素系統(tǒng)，NEL741B001KT)的濃度的影響。實(shí)驗(yàn)中，將小鼠肝臟進(jìn)行通常的福爾馬林固定、石蠟包埋后，制成連續(xù)切片，利用蛋白酶Kanvitrogen公司，I^roteinase K SOL. RNA, 25530049)進(jìn)行處理，使用上述寡聚DNA探針和濃度8nM的作為假寡聚DNA的序 列編號(hào)四的未附加標(biāo)記的大鼠Actb基因的寡聚DNA，進(jìn)行RNA原位雜交。在FITC標(biāo)記的 檢測(cè)中，使用Dako公司的抗FITC兔多克隆抗體P5100。將其結(jié)果示于圖22。圖中的稀釋 倍率1為制造廠(chǎng)商推薦的流程中的酪胺酰胺-FLU的濃度，以2倍稀釋、5倍稀釋、10倍稀釋 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如圖22所示，隨著酪胺酰胺-FLU的濃度減少，信號(hào)強(qiáng)度也減少。此外，在顯微 鏡攝影中利用10倍的物鏡并使用Zeiss熒光顯微鏡AXioplan2和CXD照相機(jī)AxioCam，使 用Image J處理所得到的各圖像，求出信號(hào)強(qiáng)度。
實(shí)施例11 (也可以是不同的基因)
圖23示出了一邊從大鼠GAPDH基因的mRNA序列的5’末端開(kāi)始，以欲作為寡聚核 酸探針而使用的長(zhǎng)度的窗口(該例中為40堿基)一個(gè)堿基一個(gè)堿基地錯(cuò)開(kāi)，一邊計(jì)算各寡 聚核酸的GC含量(％)的例子。
實(shí)施例12 (使用了鮭魚(yú)精子DNA)
該實(shí)施例中，在為寡聚核酸探針時(shí)，在探針上附加標(biāo)記，通過(guò)相對(duì)于大鼠肺中的大 鼠β -actin基因Actb的原位雜交的信號(hào)強(qiáng)度，確認(rèn)了附加標(biāo)記的位置和標(biāo)記數(shù)會(huì)對(duì)雜交 產(chǎn)生怎樣的影響(圖。即，將大鼠肺進(jìn)行通常的福爾馬林固定、石蠟包埋后，制成連續(xù)切 片，進(jìn)行脫石賭處理和蛋白酶K(Invitrogen公司，Proteinase K SOL. RNA, 25530049)處理 后，使用FITC標(biāo)記附加在5’末端的寡聚DNA探針(探針1) ,FITC標(biāo)記附加在3’末端寡聚 DNA探針(探針幻、在5，末端和3，末端的兩端附加有FITC標(biāo)記的寡聚DNA探針(探針3)， 實(shí)施RNA原位雜交，比較得到的熒光強(qiáng)度。此外，在該實(shí)施例中，未使用假寡聚DNA，而是使 用了鮭魚(yú)精子DNA。在此使用的附加有FITC標(biāo)記的3種寡聚DNA探針的序列是相同的，長(zhǎng) 度為40堿基，如序列編號(hào)四所示。在實(shí)驗(yàn)中，使用在用于檢測(cè)FITC標(biāo)記的抗FITC抗體上 連接有POD的蛋白質(zhì)(Dako公司的抗FITC兔多克隆抗體，P5100)來(lái)檢測(cè)FITC，再添加酪胺 酰胺-FLU，實(shí)施TSA致敏。在TSA致敏中使用Perkin-Elmer公司的試劑盒(TSA Plus熒光 素系統(tǒng)，NEL741B001KT), TSA致敏的流程按照該試劑盒的附帶文件進(jìn)行。雜交的探針的濃 度都設(shè)為5nM。在攝影中，利用10倍的物鏡并使用了 Zeiss熒光顯微鏡Axioplan2和CXD 照相機(jī)AxioCam。圖Ma、b、c分別是利用探針1、探針2、探針3檢測(cè)大鼠肺的Actb基因的 mRNA的結(jié)果。利用僅在5’末端帶有標(biāo)記的探針1進(jìn)行檢測(cè)而得的Actb基因的mRNA的信 號(hào)強(qiáng)度以及利用僅在3’末端帶有標(biāo)記的探針2進(jìn)行檢測(cè)而得的Actb基因的mRNA的信號(hào) 強(qiáng)度是大致相同的。另外，利用在兩端附加有標(biāo)記的探針3進(jìn)行檢測(cè)的Actb基因的mRNA 的信號(hào)強(qiáng)度為它們的倍數(shù)的程度。即，信號(hào)強(qiáng)度依賴(lài)于標(biāo)記的數(shù)量，通過(guò)使用在兩端附加有 標(biāo)記的探針，可以提高檢測(cè)靈敏度。此外，圖24d所示的Actb的有義探針的序列為序列編 號(hào)29的互補(bǔ)鏈。
實(shí)施例13 (不將信號(hào)強(qiáng)度數(shù)值化，使用鮭魚(yú)精子DNA)
在本實(shí)施例中，在一個(gè)基因的mRNA上，欲檢測(cè)使用了多個(gè)標(biāo)記進(jìn)行雜交的產(chǎn)物 時(shí)，確認(rèn)了在mRNA的核酸序列上2個(gè)標(biāo)記到底需要多大的距離。這些情況也依賴(lài)標(biāo)記的 致敏方法、所使用的顯微鏡、CCD照相機(jī)的光學(xué)系統(tǒng)的析像度。在本實(shí)施例中，相對(duì)于基因 GAPDH的mRNA的核酸序列，準(zhǔn)備2個(gè)寡聚核酸探針Al和A2，將Al的5’末端和A2的3’末 端利用FITC進(jìn)行標(biāo)記(圖25)。附加有標(biāo)記的Al和A2的長(zhǎng)度為40堿基，以A2的3，末端22與序列編號(hào)30所示的Al的5’末端相距3堿基、5堿基、8堿基、11堿基的方式使用4種探 針八21422423424(序列編號(hào)分別為31、32、33、34)。此外，使用的試樣組織為大鼠肺，將 其進(jìn)行通常的福爾馬林固定、石蠟包埋后，制成連續(xù)切片，利用蛋白酶Kanvitrogen公司， Proteinase K SOL. RNA, 25530049)進(jìn)行處理后，使用上述探針的組(Al和A21、Al和A22、 Al和A23、A1和A24)、和鮭魚(yú)精子DNA，實(shí)施RNA原位雜交。在FITC的檢測(cè)中，使用Dako公 司的抗FITC兔多克隆抗體P5100，為了致敏而使用Perkin-Elmer公司的試劑盒(TSA Plus 熒光素系統(tǒng)，NEL741B001KT)進(jìn)行TSA致敏。顯微鏡攝影中利用10倍的物鏡，使用Zeiss熒 光顯微鏡Axioplan2和CXD照相機(jī)AxioCam。如圖洸所示，Al的3，末端和A2的5’末端 的距離為8堿基以上時(shí)，可以觀察到信號(hào)的加和性增強(qiáng)。即，標(biāo)記間的距離為8堿基的情況 作為條件。
實(shí)施例14 (不將信號(hào)強(qiáng)度數(shù)值化，使用鮭魚(yú)精子DNA)
相對(duì)于大鼠ACTB基因的mRNA，在兩端利用FITC標(biāo)記了的長(zhǎng)度40堿基的寡聚核酸 探針中，使用GC含量為40% (序列編號(hào)35)、50% (序列編號(hào)四)、60% (序列編號(hào)36)、70% (序列編號(hào)37)的4種探針，分別單獨(dú)地作為探針使用，利用大鼠肺進(jìn)行RNA原位雜交，進(jìn)而 使用抗FITC抗體(Dako公司的抗FITC兔多克隆抗體P5100)進(jìn)行TSA致敏(Perkin-Elmer 公司，TSAPlus熒光素系統(tǒng)，NEL741B001KT)。在顯微鏡攝影中，利用10倍的物鏡并使用了 kiss熒光顯微鏡Axioplan2和CCD照相機(jī)AxioCam(圖27)?？芍S著探針的GC含量的 增加，信號(hào)增強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度上升。換言之，由于雜交的平衡常數(shù)K和融解溫度Tm為GC含量 的增函數(shù)，隨著融解溫度Tm的增大，信號(hào)強(qiáng)度會(huì)提高，檢測(cè)靈敏度提高。此外，圖27的Actb 有義探針的序列為序列編號(hào)四的互補(bǔ)鏈。
實(shí)施例15 (假寡聚DNA)
實(shí)施例1至實(shí)施例10中使用的假寡聚DNA為序列編號(hào)5 11、序列編號(hào)四。序 列編號(hào)5和序列編號(hào)7 11是從來(lái)自人基因組上的轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列中選擇的。序列編 號(hào)6是從植物擬南芥的過(guò)氧化酶基因的序列中選擇的。另外，序列編號(hào)四是從大鼠Actb 基因中選擇的，不與實(shí)施例10中的目標(biāo)基因Alb的mRNA發(fā)生雜交。另外，相對(duì)于序列編號(hào) 27的寡聚DNA探針
-gtcttggtagtgctcctggacagttttctgcagaaacagc-S'，
從5’側(cè)依次將A置換為Τ、T置換為A、G置換為C且C置換為G，將TTTT的連續(xù) 序列置換為ATAA而合成如下的寡聚DNA
5，-cagaaccatcacgaggacctgtcataagacgtctttgtcg-3，(序列編號(hào) 38)，
該寡聚DNA也可以作為假寡聚DNA使用。在該序列編號(hào)38的假寡聚核酸的例子 中，長(zhǎng)度和GC含量與寡聚DNA探針(序列編號(hào)27)相同。
權(quán)利要求
1.一種RNA原位雜交法，其特征在于，其是使1種或多種寡聚核酸探針與在組織試樣中 表達(dá)的目標(biāo)基因mRNA雜交，檢測(cè)在寡聚核酸探針的至少1個(gè)堿基上附加的低分子化合物標(biāo) 記來(lái)鑒定目標(biāo)基因mRNA的存在的方法，在使1種或多種假寡聚核酸對(duì)組織試樣進(jìn)行前處理即預(yù)雜交后，使寡聚核酸探針與組 織試樣接觸，使其與目標(biāo)基因mRNA雜交，或者使寡聚核酸探針和所述假寡聚核酸的混合液與試樣組織接觸，使寡聚核酸探針與目標(biāo) 基因mRNA雜交，其中，所述假寡聚核酸由與寡聚核酸探針大致相同的長(zhǎng)度形成，不與目標(biāo)基因mRNA上的寡聚核酸探針進(jìn)行雜交的區(qū)域發(fā)生雜交，而且 不與寡聚核酸探針發(fā)生雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA原位雜交法，其中，假寡聚核酸量為寡聚核酸探針量的 2 10倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的RNA原位雜交法，其中，寡聚核酸探針和假寡聚核酸的堿基長(zhǎng) 度在20bp至70bp的范圍內(nèi)大致相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA原位雜交法，其中，寡聚核酸探針?lè)謩e在其5’末端堿基 或/和3’末端堿基上附帶有低分子化合物標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA原位雜交法，其中，將2種以上的權(quán)利要求4所述的寡聚 核酸探針以各自的5’末端和3’末端隔開(kāi)8堿基以上的方式與mRNA進(jìn)行雜交。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA原位雜交法，其中，使用抗低分子化合物的抗體、在該抗 體上結(jié)合的酶、作為該酶的基質(zhì)的發(fā)色化合物或熒光分子化合物來(lái)將檢測(cè)信號(hào)致敏，使用 10倍至40倍的物鏡來(lái)檢測(cè)信號(hào)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA原位雜交法，其中，組織試樣為從哺乳動(dòng)物分離的組織， 假寡聚核酸是含有逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的重復(fù)序列的局部序列的寡聚核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA原位雜交法，其中，組織試樣為從哺乳動(dòng)物分離的組織， 假寡聚核酸是含有植物基因組的一部分或微生物基因組的局部序列的寡聚核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的RNA原位雜交法， 其中，假寡聚核酸是如下得到的寡聚核酸，將寡聚核酸探針的堿基序列中的A置換為Τ、T置換為A、G置換為C且C置換為G， 相同堿基連續(xù)M個(gè)以上的情況下，將從該連續(xù)序列中的ΜΧ0. 2處至ΜΧ0. 8處的堿基 利用其互補(bǔ)的堿基來(lái)置換，其中所述M為4，所述ΜΧ0. 2和所述ΜΧ0. 8分別取小數(shù)點(diǎn)以下 四舍五入而得的整數(shù)，存在無(wú)論從5’側(cè)讀取還是從3’側(cè)讀取都為相同序列的N堿基以上的回文序列時(shí)，利 用其互補(bǔ)的堿基置換至少ΝΧ0. 2處的堿基，N為偶數(shù)時(shí)至多為(N/2-1)處的堿基，N為奇數(shù) 時(shí)至多為((N-1V2-1)處的堿基，其中所述N為5，所述ΝΧ0. 2取小數(shù)點(diǎn)以下四舍五入而得 的整數(shù)，由此得到寡聚核酸。
10.一種權(quán)利要求7所述的RNA原位雜交法中使用的假寡聚核酸，其是含有逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座 子的重復(fù)序列的局部序列的寡聚核酸、或含有與該重復(fù)序列各不相同的局部序列多種寡聚 核酸的組。
11. 一種權(quán)利要求8所述的RNA原位雜交法中使用的假寡聚核酸，其是含有植物基因組 的局部序列或微生物基因組的局部序列的寡聚核酸、或者含有與植物基因組或微生物基因 組各不相同的局部序列的多種寡聚核酸的組。
全文摘要
本發(fā)明提供一種RNA原位雜交法，其特征在于，其是使1種或多種寡聚核酸探針與在組織試樣中表達(dá)的目標(biāo)基因mRNA雜交，檢測(cè)在寡聚核酸探針的至少1個(gè)堿基上附加的低分子化合物標(biāo)記來(lái)鑒定目標(biāo)基因mRNA的存在的方法，在使1種或多種假寡聚核酸對(duì)組織試樣進(jìn)行前處理即預(yù)雜交后，使寡聚核酸探針與組織試樣接觸，使其與目標(biāo)基因mRNA雜交，或者使寡聚核酸探針和上述假寡聚核酸的混合液與試樣組織接觸，使寡聚核酸探針與目標(biāo)基因mRNA雜交，其中，上述假寡聚核酸由與寡聚核酸探針大致相同的長(zhǎng)度形成，不與目標(biāo)基因mRNA上的寡聚核酸探針進(jìn)行雜交的區(qū)域發(fā)生雜交，而且不與寡聚核酸探針發(fā)生雜交。
文檔編號(hào)G01N33/58GK102037137SQ20098011791
公開(kāi)日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2009年5月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月19日
發(fā)明者中野龍心, 土居洋文, 松岡雅裕, 永吉千鶴 申請(qǐng)人:株式會(huì)社賽力氏Fd