專利名稱：：一種應(yīng)用多重pcr技術(shù)檢測土拉弗朗西斯菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種檢測土拉弗朗西斯菌的方法，特別是涉及一種通過多重PCR來快速檢測土拉弗朗西斯菌的方法。屬于生物戰(zhàn)劑檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：微生物個體微小，與人類生活密切相關(guān)。微生物在自然界中“無處不在，無處不有”，涵蓋了有益有害的眾多種類，廣泛涉及健康、醫(yī)藥、工農(nóng)業(yè)、環(huán)保等諸多領(lǐng)域。由微生物引起的傳染病發(fā)病快、死亡率高、傳播迅速、傳播范圍廣，不僅嚴(yán)重危害著人民健康而且極易引起大眾的心理恐慌，因此，微生物常常被恐怖分子選擇用于制造生物恐怖事件的首選目標(biāo)。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速發(fā)展，對某些烈性病原生物進(jìn)行遺傳改造，使其毒力增強(qiáng)或在其強(qiáng)致病性的基礎(chǔ)上增加各種耐藥基因，使之更加難于救治已愈來愈引起各國的重視。據(jù)《醫(yī)學(xué)假說》雜志報(bào)道，加拿大一項(xiàng)最新研究表明，早在3300年前，人類就曾經(jīng)在戰(zhàn)爭中使用過“生化武器”，這種“生化武器”就是土拉弗朗西斯菌。土拉弗朗西斯菌通過諸如驢等嚙齒類動物，感染了人類和動物，并導(dǎo)致他們發(fā)燒、殘疾和死亡。“生化武器”的使用，使瘟疫持續(xù)了35-40年。生化武器包括天花、炭疽、土拉弗朗西斯菌和鼠疫等致病菌。其中，土拉弗朗西斯菌是重要的生物戰(zhàn)劑，已被列入國際禁止生物武器公約致病微生物核查清單。土拉弗朗西斯菌(Francisellatularensis)能在人和其它許多溫血動物中引起土拉菌病(Tularaemia，或稱野兔熱、鹿蠅熱)，易感動物為嚙齒類動物，人通過破損的皮膚、結(jié)膜感染，吸入或食入極少量(10～50個)土拉菌便可發(fā)病，臨床表現(xiàn)為皮膚潰爛、淋巴腺腫大、肺部感染和傷寒樣癥狀，病情嚴(yán)重甚至死亡。2001年6月美國微生物學(xué)報(bào)刊登了一篇“平民生物危害防范工作組”關(guān)于土拉菌作為生物武器進(jìn)行恐怖襲擊危險(xiǎn)性評估報(bào)告，這個工作組由來自美國醫(yī)學(xué)科研機(jī)隊(duì)、政府有關(guān)部門的25名專家組成，通過檢索1966年1月至2000年10月間的相關(guān)文獻(xiàn)，最后得出結(jié)論，土拉菌具有用作生物武器進(jìn)行恐怖襲擊的潛在危險(xiǎn)，其特點(diǎn)如下(1)通過簡易發(fā)酵即可大量得到；(2)易于傳播，如通過空氣和水傳播，土拉菌具有較強(qiáng)的抵抗力，在水、土壤、尸體和獸皮中可存活幾周，在0℃耐受幾個月，在冷凍的兔肉中存活幾年，患者及病畜皮膚、腺體潰瘍病灶分泌物、血、痰標(biāo)本，或死亡動物肝、脾標(biāo)本中，均含有大量土拉菌；(3)人和動物易感(少于10個菌即可感染)；(4)可引起致死性疾病。土拉菌是苛養(yǎng)菌，人工營養(yǎng)條件要求較高，尤其是初次分離培養(yǎng)比較困難，生長緩慢。因此，研究快速檢出土拉菌的方法對于確定污染源和污染范圍，及時診斷土拉菌感染，防止環(huán)境擴(kuò)散和患者及時治療十分重要，也是在突發(fā)事件中將生物危害減至最小程度的重要保證。土拉弗朗西斯菌常用的檢測方法多為傳統(tǒng)的生理生化試驗(yàn)，血清抗體檢測，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和普通的PCR等，但檢測時間長，靈敏度低，很顯然，面對突然的生物襲擊，上述方法均不能滿足快速檢測的需求。因此，研制開發(fā)靈敏度高，檢測時間短的土拉弗朗西斯菌的檢測方法顯得尤為重要。多重PCR(multiplexPCR，MPCR)技術(shù)，是一種在一個反應(yīng)體系中加入多對引物同時檢測多個目的片段的技術(shù)，可以為單一模板也可以是幾種不同的模板，其反應(yīng)原理、反應(yīng)試劑和操作過程與一般PCR相同。多重PCR在食源性致病菌的檢驗(yàn)上已得到較好應(yīng)用，可以同時檢測一種致病菌的多個基因，也可以同時檢測多種致病菌.多重PCR，只需一次反應(yīng)和一次電泳即可同時檢測出多個目的片段，節(jié)約昂貴試劑、PCR反應(yīng)時間和電泳時間等，又由于各對引物擴(kuò)增時存在競爭，可有效避免假陽性的出現(xiàn)而提高檢測準(zhǔn)確率。多重PCR方法與單一PCR相比，顯得更加穩(wěn)定、準(zhǔn)確、高效、經(jīng)濟(jì)。綜上所述，鑒于土拉弗朗西斯菌有作為生物恐怖武器進(jìn)行生物恐怖襲擊的潛在危害，開發(fā)一種能快速檢測的方法顯得尤為重要，本發(fā)明即通過多重PCR來檢測土拉弗朗西斯菌，由此建立一種新的快速檢測土拉弗朗西斯菌的方法。本發(fā)明所采用的土拉弗朗西斯菌株Francisellatularensissubsp.novicidaU112為實(shí)驗(yàn)室安全菌株，所有的實(shí)驗(yàn)均在生物安全二級實(shí)驗(yàn)室完成。
發(fā)明內(nèi)容發(fā)明目的在于克服當(dāng)前檢測方法的不足，提供一種檢測速度快，靈敏度高，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好的運(yùn)用多重PCR技術(shù)快速檢測土拉弗朗西斯菌的方法，以適應(yīng)衛(wèi)生和公安應(yīng)急檢測，適應(yīng)疾控中心，商檢，衛(wèi)生，海關(guān)，公安，技術(shù)監(jiān)督，科研的基層分析單位檢測的需求。本發(fā)明的技術(shù)方案一種應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測土拉弗朗西斯菌的方法(1)檢測靶基因的選擇及引物設(shè)計(jì)本發(fā)明以土拉弗朗西斯菌的內(nèi)毒素相關(guān)基因lpxF(GeneID:2827873)，lpxE(GeneID:4547731)和flmK(GeneID:4547523)為特異性靶點(diǎn)，通過NCBI微生物基因組全序列Blastp比對(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi)，確立上述三個基因的特異性，設(shè)計(jì)相關(guān)引物，其中l(wèi)pxE從基因兩端設(shè)計(jì)引物，lpxF和flmK均從基因內(nèi)部保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，采用多重PCR進(jìn)行檢測；電泳檢測出現(xiàn)三條條帶，依次為447bp，717bp，1004bp。引物序列如下lpxF(+):TTGGCAAGATTTCATATCATATTAGG，lpxF(-):CATCACCACATACAAAGGAGCAG，lpxE(+):ATGCTCAAACAGACATTACAAACAAA，lpxE(-):AATAATCTCTCTATTTCTCATCCAATA，flmK(+):ATGAATAAATCTAAAAACTCTTACTATTT，flmK(-):AGTGATAATGGCGCAAATATAGGC；(2)樣品制備以土拉弗朗西斯菌基因組DNA或土拉弗朗西斯菌為樣品基因組DNA樣品的提取取土拉弗朗西斯菌過夜培養(yǎng)液3mL，利用TIANampBacteriaDNAKit試劑盒抽提基因組DNA，用核酸定量檢測儀測定，控制基因組DNA濃度為100μg/μL；將所提取的DNA模板，分別以超純水梯度稀釋，反應(yīng)體系中最終模板濃度為5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.05ng/μL，0.01ng/μL或0.005ng/μL；或菌液樣品的制備取土拉弗朗西斯菌單菌落接種于10mLTSB-C液體培養(yǎng)基，于37℃、200rpm/min搖床上培養(yǎng)至OD600值為1，通過菌落平板計(jì)數(shù)，控制為2.0×109cfu/mL；取OD600＝1的菌液，進(jìn)行梯度稀釋，反應(yīng)體系中菌體終濃度為1×108cfu/mL，5×107cfu/mL，1×107cfu/mL，5×106cfu/mL，1×106cfu/mL，5×105cfu/mL或1×105cfu/mL；(3)反應(yīng)條件的確立確定dNTP加量為2μL，Tm℃為55℃，三對引物比例lpxF:lpxE:flmK＝1:1:3；反應(yīng)體系為20μL10×PCRBuffer2μL，dNTP2μL，基因組DNA模板1μL或菌液樣品1μL，Taq酶0.1μL，引物lpxE(+)0.5μL，lpxE(-)0.5μL，lpxF(+)0.5μL，lpxF(+)0.5μL，flmK(+)1.5μL，flmK(-)1.5μL，ddH2O補(bǔ)足20μL；多重PCR擴(kuò)增程序及測定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)樽冃?4℃、5min；變性94℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、1min，循環(huán)30次；延伸72℃、10min；(4)檢測結(jié)果1％瓊脂糖凝膠電泳分析，于紫外光燈下觀察結(jié)果，以447bp，717bp，1004bp三條特異性條帶的出現(xiàn)判為陽性，否則判為陰性。反應(yīng)條件優(yōu)化將dNTP加量從1μL～3μL，以0.5μL為梯度遞增，試劑盒抽提的土拉弗朗西斯菌DNA模板PCR驗(yàn)證，確定當(dāng)dNTP加量為2μL時特異性較好。再將Tm℃從48.2℃～55℃取6個溫度梯度，即48.2℃、49.2℃、51.0℃、53.2℃、54.5℃、55℃，以土拉弗朗西斯菌DNA為模板PCR驗(yàn)證，確定當(dāng)Tm℃為55℃時特異性較好。最后將三對引物比例設(shè)為1:1:1；1:1:2；1:1:3；1:1:4四個比例做PCR驗(yàn)證，確定當(dāng)引物比例為1:1:3時引物條帶亮度最均勻，故確定引物比例lpxF:lpxE:flmK＝1:1:3。(見附圖1)靈敏度檢測(1)模板的制備以基因組DNA為模板將所提取的DNA模板，分別以超純水梯度稀釋，反應(yīng)體系中最終模板濃度為5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.05ng/μL，0.01ng/μL或0.005ng/μL?；蛞跃w為模板取OD600＝1的菌液，進(jìn)行梯度稀釋。反應(yīng)體系中菌體終濃度為1×108cfu/mL，5×107cfu/mL，1×107cfu/mL，5×106cfu/mL，1×106cfu/mL，5×105cfu/mL或1×105cfu/mL。PCR反應(yīng)條件同上述。檢測結(jié)果及說明以1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA模板多重PCR產(chǎn)物，結(jié)果見附圖2。以1％瓊脂糖凝膠電泳檢測菌體模板多重PCR產(chǎn)物，結(jié)果見附圖3。由電泳圖可知，用DNA模板做多重PCR時最低檢出限約為0.01ng/μL。用菌體做多重PCR時最低檢出限約為5×105cfu/mL。特異性檢測模板的制備實(shí)驗(yàn)中用于特異性檢測菌株見下表，其中FOO1用于反應(yīng)條件優(yōu)化及相關(guān)靈敏度的實(shí)驗(yàn)。表1多重PCR中用于特異性檢測的菌株注，“-”表示多重PCR反應(yīng)陰性結(jié)果，電泳圖中未見任何條帶；“+”表示多重PCR反應(yīng)陽性結(jié)果，電泳圖中有目的條帶出現(xiàn)。菌懸液的制備土拉弗朗西斯菌F001、F004、F005、F006各取一單菌落接于10mLTSB液體培養(yǎng)基，E001，S001，ES001，BS001各取一單菌落接于10mLLB液體培養(yǎng)基，于37℃、200rpm/min搖床上培養(yǎng)至OD600值為1。PCR反應(yīng)條件同上述。檢測結(jié)果及說明以1％瓊脂糖凝膠電泳分析，于紫外光燈下觀察結(jié)果，結(jié)果見附圖4。本發(fā)明的有益效果與傳統(tǒng)的土拉弗朗西斯菌檢測方法相比較，本發(fā)明中所建立的多重PCR方法具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)操作簡便，容易推廣應(yīng)用。本多重PCR檢測方法對于儀器設(shè)備的要求較普通，不需要特別昂貴的儀器和試劑，因而利于基層部門推廣應(yīng)用，且操作方法簡單方便。(2)檢驗(yàn)周期短。相對于傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法得到結(jié)果所需要的5～7d，本多重PCR方法的檢驗(yàn)周期為3h，遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)方法，可以極大提高檢驗(yàn)效率。(3)靈敏度高，特異性好。多重PCR相對于普通PCR具有更高的準(zhǔn)確度，故特異性更好，同時亦保留了普通PCR靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。本研究中所建立的多重PCR檢測方法的檢測限達(dá)到了0.01ng/μL和5×105cfu/mL，達(dá)到并超過傳統(tǒng)的檢測方法，同時檢出率更高。圖1反應(yīng)條件優(yōu)化1道為100bpDNAMarker，2道lpxF(+)(-)PCR結(jié)果，3道lpxE(+)(-)PCR結(jié)果，4道flmK(+)(-)PCR結(jié)果，5-8道三對引物比例分別為1:1:1，1:1:2，1:1:3，1:1:4。圖2靈敏度檢測(DNA為模板)1道為1kbDNAMarker，2-8道中DNA模板濃度分別為5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.05ng/μL，0.01ng/μL，0.005ng/μL。圖3靈敏度檢測(菌體為模板)1道為1kbDNAMarker，2-8道中菌液濃度分別為1×108cfu/mL，5×107cfu/mL，1×107cfu/mL，5×106cfu/mL，1×106cfu/mL，5×105cfu/mL，1×105cfu/mL。圖4特異性檢測1道為1kbDNAMarker，2道為F001菌體模板，3道為F004菌體模板，4道為F005菌體模板，5道為F006菌體模板，6道為E001菌體模板，7道為ES001菌體模板，8道為S001菌體模板，9道為BS001菌體模板。圖5環(huán)境樣品檢測1道為1kbDNAMarker，2道為加入污染菌的土壤樣本，3道為未污染的土壤樣本，4道為加入污染菌的水樣本，5道為未污染的水樣本，6道為加入污染菌的空氣樣本，7道為未污染的空氣樣本。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1土壤中的土拉弗朗西斯菌的PCR檢測1、樣品前處理采集兩份土樣(1g/份)，加入30mLTSB培養(yǎng)基，其中一份接種土拉弗朗西斯菌F001單菌落，37℃200rpm/min培養(yǎng)6h進(jìn)行前增菌。增菌后靜置，土樣沉淀后，取1μL菌懸液作為菌體模板進(jìn)行多重PCR檢測。2、PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系(20μL)10×PCRBuffer2μL，dNTP2μL，模板1μL，Taq酶0.1μL，引物lpxE(+)0.5μL，lpxE(-)0.5μL，lpxF(+)0.5μL，lpxF(+)0.5μL，flmK(+)1.5μL，flmK(-)1.5μL，ddH2O補(bǔ)足20μL。PCR反應(yīng)過程多重PCR擴(kuò)增程序及測定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)棰僮冃?94℃5min②變性:94℃30s③退火:55℃30s④延伸:72℃1min⑤延伸:72℃10min②至④步循環(huán)30cycle3、檢測結(jié)果及說明以1％瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，加入菌的土樣中擴(kuò)增出相應(yīng)特異條帶(見附圖5第2道)，而未人工加菌的樣品中未出現(xiàn)相應(yīng)條帶(見附圖5第3道)。實(shí)施例2水中的土拉弗朗西斯菌的PCR檢測1、樣品前處理采集兩份水樣(5mL/份)，加入30mLTSB培養(yǎng)基，其中一份接種土拉弗朗西斯菌F001單菌落，37℃200rpm/min培養(yǎng)6h進(jìn)行前增菌。增菌后取1μL菌懸液作為菌體模板進(jìn)行多重PCR檢測。2、PCR反應(yīng)反應(yīng)條件及體系同實(shí)施例1。3、檢測結(jié)果及說明以1％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果見附圖5。結(jié)果顯示，加入菌的水樣中擴(kuò)增出相應(yīng)特異條帶(見附圖5第4道)，而未人工加菌的樣品中未出現(xiàn)相應(yīng)條帶(見附圖5第5道)。實(shí)施例3空氣中的土拉弗朗西斯菌的PCR檢測1、樣品前處理用吸塵器采集兩份空氣中的灰塵樣品(1g/份)，加入30mLTSB培養(yǎng)基，其中一份接種土拉弗朗西斯菌F001單菌落，37℃，200rpm/min培養(yǎng)6h進(jìn)行前增菌。增菌后取1μl菌懸液作為模板進(jìn)行多重PCR檢測。2、PCR反應(yīng)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系同實(shí)施例1。3、檢測結(jié)果及說明以1％瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，加入菌的樣品中擴(kuò)增出相應(yīng)特異條帶(見結(jié)果見附圖5第6道)，而未人工加菌的樣品中未出現(xiàn)相應(yīng)條帶(見附圖5第7道)。權(quán)利要求1.一種應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測土拉弗朗西斯菌的方法，其特征是(1)檢測靶基因的選擇及引物設(shè)計(jì)以土拉弗朗西斯菌的內(nèi)毒素相關(guān)基因lpxF，lpxE和flmK為特異性靶點(diǎn)，通過NCBI微生物基因組全序列Blastp比對，確立上述三個基因的特異性，設(shè)計(jì)相關(guān)引物，其中l(wèi)pxE從基因兩端設(shè)計(jì)引物，lpxF和flmK均從基因內(nèi)部保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，采用多重PCR進(jìn)行檢測；電泳檢測出現(xiàn)三條條帶，依次為447bp，717bp，1004bp；引物序列如下lpxF(+)TTGGCAAGATTTCATATCATATTAGG，lpxF(-)CATCACCACATACAAAGGAGCAG，lpxE(+)ATGCTCAAACAGACATTACAAACAAA，lpxE(-)AATAATCTCTCTATTTCTCATCCAATA，flmK(+)ATGAATAAATCTAAAAACTCTTACTATTT，flmK(-)AGTGATAATGGCGCAAATATAGGC，(2)樣品制備，以土拉弗朗西斯菌基因組DNA或土拉弗朗西斯菌為樣品基因組DNA樣品的提取取土拉弗朗西斯菌過夜培養(yǎng)液3mL，利用TIANampBacteriaDNAKit試劑盒抽提基因組DNA，用核酸定量檢測儀測定，控制基因組DNA濃度為100μg/μL；將所提取的DNA模板，分別以超純水梯度稀釋，反應(yīng)體系中最終模板濃度為5ng/μL，1ng/μL，0.5ng/μL，0.1ng/μL，0.05ng/μL，0.01ng/μL或0.005ng/μL；或菌液樣品的制備取土拉弗朗西斯菌單菌落接種于10mLTSB-C液體培養(yǎng)基，于37℃、200rpm/min搖床上培養(yǎng)至OD600值為1，通過菌落平板計(jì)數(shù)，控制為2.0×109cfu/mL；取OD600＝1的菌液，進(jìn)行梯度稀釋，反應(yīng)體系中菌體終濃度為1×108cfu/mL，5×107cfu/mL，1×107cfu/mL，5×106cfu/mL，1×106cfu/mL，5×105cfu/mL或1×105cfu/mL；(3)反應(yīng)條件的確立確定dNTP加量為2μL，Tm℃為55℃，三對引物比例lpxF:lpxE:flmK＝1:1:3；反應(yīng)體系為20μL10×PCRBuffer2μL，ddNTP2μL，基因組DNA模板1μL或菌液樣品1μL，Taq酶0.1μL，引物lpxE(+)0.5μL，lpxE(-)0.5μL，lpxF(+)0.5μL，lpxF(+)0.5μL，flmK(+)1.5μL，flmK(-)1.5μL，ddH2O補(bǔ)足20μL；多重PCR擴(kuò)增程序及測定擴(kuò)增片段的熔解溫度程序?yàn)樽冃?4℃、5min；變性94℃、30s，退火55℃、30s，延伸72℃、1min，循環(huán)30次；延伸72℃、10min；(4)檢測結(jié)果1％瓊脂糖凝膠電泳分析，于紫外光燈下觀察結(jié)果，以447bp，717bp，1004bp三條特異性條帶的出現(xiàn)判為陽性，否則判為陰性。全文摘要一種應(yīng)用多重PCR技術(shù)檢測土拉弗朗西斯菌的方法，屬于生物戰(zhàn)劑檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明以土拉弗朗西斯菌的內(nèi)毒素相關(guān)基因lpxF，lpxE和flmK為特異性靶點(diǎn)，通過NCBI微生物基因組全序列Blastp比對，確立上述三個基因的特異性，設(shè)計(jì)相關(guān)引物，采用多重PCR進(jìn)行檢測；電泳檢測出現(xiàn)三條條帶，依次為447bp，717bp，1004bp，依據(jù)三條特異性條帶的出現(xiàn)判為陽性，否則判為陰性。本發(fā)明檢測方法操作簡便，容易推廣應(yīng)用；檢驗(yàn)周期短，相對于傳統(tǒng)檢驗(yàn)方法得到結(jié)果所需要的5～7d，本方法的檢驗(yàn)周期為3h，遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)方法，可以極大提高檢驗(yàn)效率；靈敏度高，特異性好；檢測限達(dá)到了0.01ng/μL和5×105cfu/mL，達(dá)到并超過傳統(tǒng)的檢測方法，同時檢出率更高。文檔編號C12Q1/04GK101372713SQ20081015666公開日2009年2月25日申請日期2008年9月23日優(yōu)先權(quán)日2008年9月23日發(fā)明者王小元,李顏顏,許陽光,燁李,峰史,易吝申請人:江南大學(xué)