專利名稱：檢測單核苷酸多態(tài)性的長周期光纖光柵核酸傳感器系統(tǒng)及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種將長周期光纖光柵折射率敏感性與光纖檢測技術(shù)結(jié)合在一 起的新型光纖DNA傳感器系統(tǒng)，它可應(yīng)用于人類基因組研究單核苷酸多態(tài)性 (SNP)。
背景技術(shù)：
長周期光纖光柵(以下簡稱LPG)是一種基于纖芯導(dǎo)模與包層模式耦合理論 的傳感性光柵，它對其周圍所處環(huán)境的折射率變化非常敏感，進(jìn)而可以得到溶液 中粒子的濃度?；谠擇詈侠碚摰纳飩鞲屑夹g(shù)已廣泛應(yīng)用于血液中抗原含量測 量、蛋白質(zhì)物質(zhì)鑒別、藥物篩選等多個生化研究領(lǐng)域。
隨著人類基因組精確序列圖的完成，人類基因組研究的重點(diǎn)已進(jìn)入后基因組 時代，其主要內(nèi)容之一就是建立以單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)為代表的脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid， DNA)序 列變異的系統(tǒng)目錄。我國正在構(gòu)建和研究中華民族基因組單核苷酸多態(tài)性(SNP) 系統(tǒng)目錄的。
人類基因組由30億個單核苷酸組成。人類基因組DNA序列中最常見的變異 形式就是單核苷酸多態(tài)性(以下簡稱SNP),即在其DNA序列上的某些特定的位置 出現(xiàn)不同的堿基。SNP是廣泛分布于人類全基因組中穩(wěn)定的多態(tài)位點(diǎn)，代表了不 同個體之間最大的遺傳差異。不同人群間的SNP等位基因頻率可以有相當(dāng)大的差 別，某些SNP甚至還呈現(xiàn)群體專一性。對SNP及其突變的研究已經(jīng)成為當(dāng)今的生 命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
目前，應(yīng)用最為廣泛的研究SNP、發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)的方法主要是依靠對基因的 核苷酸序列測定，即測序的方法。將目標(biāo)基因組用聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài) 性(PCR-SSCP)方法獲得擴(kuò)增產(chǎn)物，對產(chǎn)物分析測序再與公共數(shù)據(jù)庫中的序列比 對。測序法只能發(fā)現(xiàn)少量SNP,低頻率的SNP往往不能發(fā)現(xiàn)。隨著分子生物學(xué)實(shí)
驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，有許多新技術(shù)應(yīng)用于SNP研究。以分子雜交為基礎(chǔ)衍生了很多相 關(guān)的技術(shù)，如位點(diǎn)特異性探針的應(yīng)用、Tagman實(shí)驗(yàn)、分子燈塔(molecular beacons )技術(shù)、Minisequencing等等。但由于這些方法讀需要熒光標(biāo)記以及專 門的分析儀器，大規(guī)模地發(fā)現(xiàn)和篩選SNP的可行性較差。其他一些檢測SNP的方 法也只能發(fā)現(xiàn)SNP所在的區(qū)域，但不能確定SNP的具體定位和特征。
由于LPG測定技術(shù)屬于一種可以在表面上示蹤生物分子特性以及相互作用的 方法，具有實(shí)時、無須標(biāo)記、對樣品本身無損傷等優(yōu)點(diǎn)，并可獲得較許多其他方 法更為精確的數(shù)據(jù)。近兩年來，國內(nèi)外有些研究組已經(jīng)開始試圖應(yīng)用LPG技術(shù)進(jìn) 行生物檢測。
在LPG生物傳感器方面，2000年，Pilevar等人在The 14th OFS著文"Evanecent Wave Antibody—Antigen Biosensor Based on Long Period Fiber Gratings." 利用LPG和Bragg光柵組合制成了抗體一抗原生物傳感器，用來檢測生物溶液中抗 原的有無。2006年，在激光生物學(xué)報中，莊其仁在"長周期光纖光柵生物膜傳感 器"中介紹了一種可測量生物膜厚度的LPG傳感器，可用于確定血液里是否存在 抗原。
目前國內(nèi)外研究開發(fā)的大多是用以檢測抗體一抗原的LPG生物傳感器，即 利用特定的生物膜制備技術(shù)，在裸露的LPG表面上將生物傳感元件固定以形成一 層敏感薄膜。根據(jù)待檢對象的不同(如蛋白質(zhì)、抗原等)，傳感信息感受元件可以 是與之相配對的酶、抗體等。由于常用的生物敏感元件(如酶)大多具有很高的催 化效率和專一性，所以固定于裸露LPG表面的活性薄膜可以做得很薄，乃至于是 單分子排列，所以，此時依然可以認(rèn)為光柵是無包層的裸露狀態(tài)。
測量時，將LPG浸入待測液體，若其中存在待檢測物質(zhì)，如某種蛋白質(zhì)(即 對應(yīng)于酶的底物)，將伴隨有相應(yīng)的生化反應(yīng)發(fā)生并有特定的復(fù)合物產(chǎn)生，生成 的復(fù)合物吸附在LPG表面上，從而在其表面上形成了一層鍍膜，該膜可視為裸光 柵的新包層。根據(jù)檢測對象的不同，LPG包層折射率發(fā)生變化，從而，可以判別 是否存在某種抗體一抗原。國內(nèi)很多研究機(jī)構(gòu)對這種傳感器在生物、化學(xué)及生化 檢測等方面的應(yīng)用進(jìn)行了研究，并取得了一定的成果。
隨著研究工作的不斷深入，檢測抗體一抗原的LPG生物傳感器已逐漸不能滿 足人們對于體積、靈敏度等方面的需求。隨之而來，出現(xiàn)了增敏薄膜、單向檢測
等許多改進(jìn)方案，如2005年，關(guān)壽華在傳感技術(shù)學(xué)報中發(fā)表的的"基于單端 長周期光'纖光柵的濃度傳感器"；徐艷平在上海理工大學(xué)報中發(fā)表的"長周期光 纖光柵薄膜傳感器研究"等。我們在對以上新型光纖傳感結(jié)構(gòu)進(jìn)行大量研究的基 礎(chǔ)上，進(jìn)一步引入分布式結(jié)構(gòu)，制成可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定位的長周期光纖光柵核酸傳 感器。
目前最為廣泛的研究SNP、發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)的方法主要是依靠對基因的核苷酸 序列測定，即測序的方法。由于這些方法都需要熒光標(biāo)記以及專門的分析儀器， 大規(guī)模地發(fā)現(xiàn)和篩選SNP的可行性較差，并只能發(fā)現(xiàn)SNP所在的區(qū)域，而無法確 定SNP的具體定位和特征。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服原有核苷酸檢測中的精度較低等缺點(diǎn)。提供一種靈敏 度高、可實(shí)現(xiàn)分布式測量，實(shí)現(xiàn)確定SNP的具體定位和特征的檢測單核苷酸多態(tài) 性的分布式長周期光纖光柵核酸傳感器系統(tǒng)及檢測方法。同時由于釆用了單端檢 測，因此它又可避免LPG傳感系統(tǒng)顯現(xiàn)出的檢測部分體積較大，不適合遠(yuǎn)程遙測 場合、光源波動等外界因素影響的缺點(diǎn)。
一種檢測單核苷酸多態(tài)性的分布式長周期光纖光柵核酸傳感器系統(tǒng)，其特征 在于組成如下寬帶光源與樹型光纖耦合器的輸入端相連，樹型光纖耦合器的 輸出端通過耦合器接頭連于傳感光纖，該傳感光纖末端是終端反射式長周期光纖 光柵核酸傳感器探頭，或者是分布式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭，耦合器的 反射端連于與計算機(jī)相連的光譜儀；所述終端反射式長周期光纖光柵核酸傳感器 探頭，包括設(shè)有LPG傳感柵區(qū)的纖芯、位于纖芯端面的反射金屬膜；所述分布式 長周期光纖光柵核酸傳感器探頭，具體組成是，多根光纖并聯(lián)，且在每一根光纖 纖芯的不同位置刻有LPG傳感柵區(qū)，在每根光纖的終端設(shè)置反射金屬膜，不同根 光纖的LPG傳感器諧振峰值不同。
上述的檢測單核苷酸多態(tài)性的長周期光纖光柵核酸傳感器系統(tǒng)的檢測方法， 其特征在于利用LPG傳感柵區(qū)對柵區(qū)周圍環(huán)境介電常數(shù)變化的敏感性質(zhì)，通 過測量由于液相中待測樣本的介電常數(shù)變化而引起的諧振峰值的改變，從而實(shí)現(xiàn) 對SNP的識別。所說的測量LPG傳感柵區(qū)對柵區(qū)周圍環(huán)境介電常數(shù)變化也就是
測量折射率的變化。
本發(fā)明中終端反射式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭主要是在光柵的另一 端鍍金屬膜，比如金、銀膜，有效提高光在光纖單端內(nèi)表面的反射率，保證損耗 峰峰值的測量精度。LPG的峰值損耗遠(yuǎn)大于3dB,因此可以把LPG對的自干涉效 應(yīng)降到極小，不會產(chǎn)生多個損耗峰峰值影響測量。同時，單端LPG傳感頭便于操 作和移動，從而適應(yīng)各種復(fù)雜的實(shí)際測量條件，并可以簡化傳感系統(tǒng)。分布式長 周期光纖光柵核酸傳感器的組成是在同一根光纖上可以制備多個在線長周期光 纖光柵核酸傳感器探頭，該光纖的末端設(shè)置為終端反射式長周期光纖光柵核酸傳 感器探頭，同時，多根光纖通過耦合器并連起來，用以實(shí)現(xiàn)空分復(fù)用。
本發(fā)明的有益效果是釆用可以在表面上測試生物分子特性以及相互作用的 LPG技術(shù)，利用LPG對環(huán)境介質(zhì)折射率、溶液濃度變化分辨率高、響應(yīng)快、高通
量、敏感、特異、簡便、對樣品本身無損傷等優(yōu)點(diǎn)；同時由于采用了光纖作為傳 感基體，又具有抗電磁干擾能力強(qiáng)、耐高壓、耐腐蝕、可實(shí)現(xiàn)分布式測量以及遠(yuǎn) 程遙測監(jiān)控等優(yōu)點(diǎn)；通過簡化傳感系統(tǒng)結(jié)構(gòu)且采用光譜檢測技術(shù)，可提高測量精 度，克服光強(qiáng)測量易受光源不穩(wěn)定影響的缺點(diǎn)。


圖1是長周期光纖光柵核酸傳感器系統(tǒng)組成示意圖。 圖2是樹型光纖耦合器示意圖。
圖3是終端反射式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭示意圖。 圖4是分布式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭示意圖。
圖中的標(biāo)號名稱l.寬帶光源，2.樹型光纖耦合器，3.耦合器接頭，4.傳感 光纖，5.終端反射式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭，6.光譜儀，7.計算機(jī)， 61.LPG柵區(qū)，62.纖芯，63.纖芯終端反射金屬膜，64.特異性DNA探針，9.在 線式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭，ll.輸入端，12.反射端，13.輸出端。
具體實(shí)施例方式
由圖1可知，本發(fā)明的長周期光纖光柵核酸傳感器系統(tǒng)的具體組成是，寬帶 光源1 (可采用LG150型寬帶光源)，進(jìn)入樹型光纖耦合器2 (如圖2所示)的輸
入端，傳播到樹型光纖耦合器2的輸出端，再通過耦合器接頭3，經(jīng)過傳感光纖 4傳播到終端反射式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭5，與待測樣本中的DNA分 子相互作用產(chǎn)生纖芯和包層的耦合效應(yīng)，在經(jīng)過探頭10中的纖芯端面的反射金 屬膜作用后形成反射光線通過樹型光纖耦合器2的反射端進(jìn)入光譜儀6 (可采用 AQ6317型光譜儀)，再經(jīng)過計算機(jī)7處理輸出反射光強(qiáng)度與光峰值之間的關(guān)系曲
線，從而實(shí)現(xiàn)了整個測量光路部分的全光纖化。
圖3是終端反射式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭示意圖。它包括柵區(qū)61、 柵區(qū)表面的特異性DNA探針64、纖芯終端反射金屬膜(金或銀)63以及固定架 62。固定架62主要用于使長周期光纖光柵的柵區(qū)保持平直，避免由于柵區(qū)彎曲 而影響檢測結(jié)果，其兩固定端距離應(yīng)大于柵區(qū)長度。
在光柵表面通過共價交聯(lián)法利用y-(2, 3-環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅垸
(YDH-560 )進(jìn)行化學(xué)修飾，將所設(shè)計的用于檢測SNP的特異性DNA探針結(jié)合到 光柵表層，與待測樣本DNA分子在液相中進(jìn)行雜交過程，雜交物通過生物素與磁 珠上包被的親和素結(jié)合而被捕獲。通過檢測諧振峰值的變化情況實(shí)現(xiàn)對樣本DNA 分子的SNP位點(diǎn)的識別。
LPG核酸技術(shù)可以定性的判斷兩分子之間是否有相互作用，比較一種分子與 其他分子之間相互作用的強(qiáng)弱，也可以實(shí)時定量的測定分子間相互作用的親和 力參數(shù)(平衡常數(shù))和動力學(xué)參數(shù)(速率常數(shù))，甚至熱力學(xué)參數(shù)(反應(yīng)的焓)。 該技術(shù)利用了物理光學(xué)的原理，在研究兩分子相互作用時，將一種分子固定在 LPG傳感探頭表面，而另一種分子的溶液流過其表面，兩種分子的結(jié)合會使傳感 光柵表面的折射率發(fā)生改變，因此可以檢測兩分子間的相互作用。
圖4是分布式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭示意圖。它的具體組成是在同 一根光纖纖芯的不同位置刻入LPG傳感柵區(qū)，或在不同根光纖分別采用不同諧 振峰值的LPG傳感器，并在每根光纖的終端鍍上反射金或銀膜。因此可在同一根 光纖上可以同時設(shè)置多個反射式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭，并將該光纖的 末端加工為終端反射式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭。
根據(jù)LPG光譜輸出特性，通過不同諧振峰值的LPG可對SNP實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)探測 的分布式長周期光纖光柵核酸傳感器。當(dāng)這些LPG傳感段處于不同在測試環(huán)境或 介質(zhì)中時，不同的待測DNA分子與傳感器探針會發(fā)生不同的雜交，從而引起各個
LPG傳感器附近介電常數(shù)的變化。通過對傳感器輸出LPG光譜的不同諧振峰值的 檢測，可以得到分布式檢測的信號。
權(quán)利要求
1.一種檢測單核苷酸多態(tài)性的分布式長周期光纖光柵核酸傳感器系統(tǒng)，其特征在于組成如下寬帶光源(1)與樹型光纖耦合器(2)的輸入端相連，樹型光纖耦合器的輸出端通過耦合器接頭(3)連于傳感光纖(4)，該傳感光纖(4)末端是終端反射式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭(5)，或者是分布式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭，耦合器的反射端連于與計算機(jī)(7)相連的光譜儀(6)；所述終端反射式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭(5)，包括設(shè)有LPG傳感柵區(qū)(61)的纖芯、位于纖芯端面的反射金屬膜，位于LPG傳感柵區(qū)表面的特異性DNA探針(64)；所述分布式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭，具體組成是，多根光纖并聯(lián)，且在每一根光纖纖芯(62)的不同位置刻有LPG傳感柵區(qū)，每一根LPG傳感柵區(qū)表面設(shè)有檢測特定液相的特異性DNA探針(64)，在每根光纖的終端設(shè)置纖芯終端反射金屬膜(63)，不同根光纖LPG傳感器的初始諧振峰值不同。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測單核苷酸多態(tài)性的長周期光纖光柵核酸傳感 器系統(tǒng)的檢測方法，其特征在于利用LPG傳感柵區(qū)對光柵柵區(qū)周圍環(huán)境折射率 變化的敏感性質(zhì)，通過測量由于待測樣本試液中介電常數(shù)的變化而引起的諧振峰 值的變化，檢測待檢樣本中DNA的SNP;即當(dāng)自組裝在光柵表面的DNA探針與 液相中待檢測的靶序列發(fā)生反應(yīng)時，通過檢測由柵區(qū)表面液相環(huán)境中介電常數(shù)的 變化引起的諧振峰值改變，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對SNP的識別。
全文摘要
檢測單核苷酸多態(tài)性的分布式長周期光纖光柵核酸傳感器系統(tǒng)及檢測方法，屬于生物傳感器測試領(lǐng)域。該系統(tǒng)由寬帶光源(1)、樹型光纖耦合器(2)、傳感光纖(4)、計算機(jī)(7)、光譜儀(6)以及終端反射式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭(5)或分布式長周期光纖光柵核酸傳感器探頭組成。該方法是通過測量由于待測樣本試液中介電常數(shù)的變化而引起的諧振峰值的變化，檢測待檢樣本中DNA的SNP。本發(fā)明有靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)分布式測量，實(shí)現(xiàn)實(shí)時高通量檢測的特點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK101368207SQ200810156160
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月24日
發(fā)明者劉宏月, 張曉麗, 捷 曾, 梁大開, 名 齊 申請人:南京航空航天大學(xué)