專利名稱：一種地被菊株型匍匐性分子標記輔助選擇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種地被菊株型匍匐性分子標記輔助選擇方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域， 用于地被菊株型匍匐性的分子標記輔助選擇育種。
二背景技術(shù)：
地被菊是上世紀八十年代由陳俊愉院士首先提出的菊花新品種群(王彭偉等， 1990; ChenJYW /. 1995)。具有株型低矮或匍匐、多分枝、抗性強、適應(yīng)性廣、成型 快、覆蓋能力強、著花繁密等特點，同時具備綠化、美化、彩化和香化綜合功能，園林 應(yīng)用前景極為廣闊(于忠香，2004)。株型是地被菊的重要性狀之一，匍匐型地被菊因 枝條分枝角度小，匍匐地面生長，更適于地被景觀營造。
目前，株型遺傳控制和分子標記研究主要集中在模式植物擬南芥，及水稻、小麥、 玉米等大田作物和番茄、菜豆等蔬菜作物上(嵇怡等，2006;張培通等，2006;李培金
等，2003)，觀賞植物株型遺傳和分子標記鮮有研究，而地被菊株型匍匐性的分子標記 尚未見報道。
SCAR標記是根據(jù)RAPD標記的片段序列，合成一對特異性引物，對基因組進行擴 增，較長的引物有效地減少了非特異性擴增，提高了 SCAR技術(shù)的穩(wěn)定性。所以，在分 子標記輔助選擇育種實踐中常常將RAPD標記轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定的SCAR標記(許勇等， 2000;馬少芹等，2006;王道杰等，2006)。本研究將獲得的與地被菊匍匐性狀控制基 因相連鎖的分子標記轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定而有效的SCAR標記，為匍匐型地被菊新品種選育、 分子標記輔助育種和匍匐性相關(guān)基因的克隆奠定了基礎(chǔ)。
三
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的是篩選出一個或幾個與地被菊株型匍匐性基因緊密連鎖 的分子標記，建立地被菊匍匐株型分子標記輔助選擇體系，從而提高地被菊匍匐株型的 選擇效率，為匍匐型地被菊新品種選育奠定基礎(chǔ)。
技術(shù)方案本發(fā)明的實施方案如下
一種地被菊株型匍匐性分子標記輔助選擇方法，其特征在于
用RAPD引物A-IO，序列為5'-GTGATCGCAG-3，
擴增匍匐型地被菊或育種材料DNA，如果能夠擴增出555bp的片段，則標志著地 被菊匍匐基因的存在；
或者用SCAR引物SCAIO，
上游引物序列5'-GTGATCGCAGGAACAACC隱3， 下游弓I物序列5 ，-GTGATCGCAGCCGCTTGA-3'
擴增匍匐型地被菊或育種材料DNA，如果能夠擴增出555bp的片段，則標志著地 被菊匍匐基因的存在；
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種地被菊株型匍匐性分子標記輔助選擇方法，其中采 用的RAPD引物A-10和SCAR引物SCA10兩種分子標記引物是通過以下方法篩選獲 得的
1) 采用CTAB微量法提取基因組DNA;
2) 根據(jù)BSA (Bulked Segregant Analysis)法原理，分別從Fi株型分離群體中選擇 極端匍匐和直立的單株各10株，將稀釋的基因組DNA分別等量混合構(gòu)成匍匐基因池 和直立基因池；
3) 標記引物的篩選
PCR擴增反應(yīng)在MJ Research公司生產(chǎn)的PTC-10()TM型PCR儀上進行。反應(yīng)體系 共20 pL，包括10xBuffer2pL、 1.625 mmol'I/1 MgCl2、 75 pmol.i;1 dNTP 、 40 ng模 板DNA、 1.5 UTaq polymerase (TaKaRa)、 1.5 pmoH/1 RAPD引物(由南京生興生物 技術(shù)公司合成)、用ddH20補齊20 nL。
反應(yīng)程序為94'C預(yù)變性4min，然后進入下列循環(huán)94"C變性15 s， 35'C復(fù)性15s， 72。C延伸lmin 15s， 3個循環(huán)；94 。C變性30 s， 40。C復(fù)性30 s， 72 。C延伸lmin 15s， 40 個循環(huán)；最后72'C延伸7min; 4"C保溫。
取7pL擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，電極緩沖液為lxTAE， 電壓5V/cm。利用JS-380凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)進行觀察拍照， 記錄多態(tài)性片段。從而獲得一個與地被菊匍匐性狀控制基因相連鎖的分子標記A-10555。
利用大連寶生物公司的DNA純化回收試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNA
Purification Kit Ver.2.0)回收、純化八-10555特異DNA片段(555bp)。連接pGEM-T Easy Vector質(zhì)粒載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選、鑒定A-10555特異DNA片段重組質(zhì)粒， 并委托上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。
根據(jù)A-10s55特異DNA片段測序結(jié)果，利用軟件Primer Premier設(shè)計的特異引物 SCA10(上游引物序列5，-GTGATCGCAGGAACAACC-3，， 下游引物序歹U : 5，-GTGATCGCAGCCGCTTGA-3，；委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)，進行SCAR 擴增，25nL的反應(yīng)體系中含有2.5 10xBuffer， 1.5 25mM MgCl2， 2.0 2.5mM dNTP， 1U Taq DNA聚合酶，1.5 pmol'I/1 SCAR引物，20 ng模板DNA，用ddH20補 齊25pL。
PCR反應(yīng)程序為94"C預(yù)變性5min，然后進入下列循環(huán)94 "C變性lmin， 67'C復(fù)
性lmin, 72。C延伸lmin， 35個循環(huán)；最后72°C延伸10min; 4。C保溫。取7 擴增 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，電極緩沖液為lxTAE，電壓5V/cm。利用 JS-380凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)進行觀察拍照，記錄多態(tài)性片段555bp。
從而獲得一個與地被菊匍匐性狀控制基因相連鎖的分子標記SCA10555。
有益效果本發(fā)明選用的是以'早意大利紅，(Pl)為母本、03(6)-12為父本(P2) 雜交獲得的152株Fi分離群體為試材，構(gòu)建株型匍匐/直立基因池開展地被菊株型匍匐 性分子標記的篩選及分子標記輔助選擇體系的建立。與目前技術(shù)相比，其優(yōu)點是
(1) 標記穩(wěn)定。本研究以株型匍匐/直立基因池為材料，鑒定出RAPD標記1個， 并轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的SCAR標記，分別用這些標記對后代單株進行檢測，表明該標記表現(xiàn) 穩(wěn)定，不受環(huán)境條件的影響。
(2) 分子標記輔助選擇體系操作方便，能夠克服地被菊匍匐性狀基因型鑒定的困 難。選擇范圍更廣，強度更大。匍匐型地被菊的常規(guī)選育方法周期長，費時又費力。通 過本發(fā)明探索出了簡易、快速提取地被菊DNA的方法；篩選出了與地被菊匍匐性狀控 制基因相連鎖的1個RAPD標記及1個SCAR分子標記用于輔助選擇，并建立了 PCR 產(chǎn)物的快速檢測技術(shù)；建立的分子標記輔助選擇方法可以實現(xiàn)苗期提早選擇，減少工作 量，大大提高匍匐型地被菊的選擇效率，從而加快育種進程。
四

圖l RAPD引物A-10在兩池、兩親本及F!中部分單株DNA擴增結(jié)果
C:匍匐基因池；E:直立基因池；PI:早意大利紅；P2: 03(6)-12; 1-12:匍匍單
株；M: Ladder DNA; 13-24直立單株；21:重組單株 圖2 RAPD引物A-10對群體內(nèi)的部分單株DNA的PCR擴增產(chǎn)物 圖3 SCAR引物SAC10在兩池、兩親本及Fi中部分單株DNA擴增結(jié)果 圖4 SCAR引物SAC10對群體內(nèi)的部分單株DNA的PCR擴增產(chǎn)物
五具體實施例方式
(一) 材料與方法
供試材料為"中國菊花種質(zhì)資源保存中心"公開對外提供的地被菊品種03(6)-12和 盆栽小菊品種'早意大利紅，及其以'早意大利紅，(PI)為母本、03(6)-12為父本(P2) 雜交獲得的152株包括直立、匍匐和中間型的Fi株型分離群體。采用測分枝角度的方 法(分枝角度的測定于苗期進行，用量角器測量一級主分枝延伸方向與地平面的角度， 取平均值。將分枝角度分成9個等級差，0 10。為1級，11 20。為2級，以此類推， 81 90。為9級。規(guī)定分枝角度在l、 2、 3級范圍的為匍匐株型；4、 5、 6級為中間型； 7、 8、 9級為直立株型)對單株株型進行鑒定，進行分子標記的篩選及連鎖分析，重組 率計算公式為重組率z重組型植株數(shù)/總株數(shù)x100。/。。利用Kosambi函數(shù)將重組率轉(zhuǎn)化 為遺傳距離(Centimorgan， cM)。
(二) 分子標記篩選分析主要利用RAPD標記及SCAR標記。
本試驗DNA的提取采用CTAB微量法(鄒喻萍等，系統(tǒng)與進化學(xué)中的分子標記[M], 科學(xué)出版社，2001: 9-17)、 Lambda DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質(zhì)量，最后 將濃度調(diào)至20 ng'nL"。
根據(jù)BSA (Bulked Segregant Analysis)法原理，分別從Ft分離群體152株中選擇
極端匍匐和直立的單株各10株，將稀釋的基因組DNA分別等量混合構(gòu)成匍匐基因池 和直立基因池。
用200個RAPD引物(由南京生興生物技術(shù)公司合成)對匍匐基因池和直立基因池 進行擴增篩選。
PCR擴增反應(yīng)在MJ Research公司生產(chǎn)的PTC-10()TM型PCR儀上進行。反應(yīng)體系 共20 pL，包括10xBuffer2pL、 1.625 mmol.L-1 MgCl2、 75 pmoH/1 dNTP 、 40ng模 板DNA 、 1.5 UTaq polymerase (TaKaRa)、 1.5 pmol丄-1 RAPD引物(由南京生興生物 技術(shù)公司合成)、用ddH20補齊20 pL。
反應(yīng)程序為94。C預(yù)變性4min，然后進入下列循環(huán)94。C變性15 s， 35。C復(fù)性15 s， 72'C延伸lmin 15s， 3個循環(huán)；94 。C變性30 s， 40。C復(fù)性30 s， 72 。C延伸lmin 15s， 40個循環(huán)；最后72。C延伸7min; 4"C保溫。
取7^iL擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，電極緩沖液為lxTAE， 電壓5V/cm。利用JS-380凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)進行觀察拍照， 記錄多態(tài)性片段。
其中A-10 (5'-GTGATCGCAG-3')引物在兩基因池間檢測到多態(tài)性，即在匍匐基 因池中擴增出特異的555bp DNA片段，而在直立基因池中未擴增出相應(yīng)的DNA片段。 從而獲得一個與地被菊匍匐性狀控制基因相連鎖的分子標記A-10555 (圖1)。 利用大連寶生物公司的DNA純化回收試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNA
Purification Kit Ver.2.0)回收、純化八-10555特異DNA片段(555bp)。連接pGEM-TEasy
Vector質(zhì)粒載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，篩選、鑒定A-10555特異DNA片段重組質(zhì)粒，
并委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進行測序，獲得A-10555片段序列如下(斜體加粗部
分為RAPD引物序列，下劃線部分為SCAR引物序列)
CGATCAC-3，
根據(jù)測序結(jié)果，利用軟件Primer Premier設(shè)計的特異引物SCAIO (上游引物序列 5，-GTGATCGCAGGAACAACC-3，；下游引物序列5，-GTGATCGCAGCCGCTTGA-3，； 委托上海英駿生物技術(shù)有限公司合成)進行SCAR擴增，25pL的反應(yīng)體系中含有2.5 10xBuffer， 1.5 25mM MgCl2， 2.0 nL2.5mM dNTP， lUTaqDNA聚合酶，1.5 pmoI.L.1 SCA10引物，20ng模板DNA，用ddH20補齊25pL。
PCR反應(yīng)程序為94。C預(yù)變性5min，然后進入下列循環(huán)94 。C變性lmin， 67。C復(fù) 性lmin， 72。C延伸lmin， 35個循環(huán)；最后72。C延伸10min; 4'C保溫。取7 擴增 產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，電極緩沖液為lxTAE，電壓5V/cm。利用 JS-380凝膠成像分析儀(上海培清科技有限公司)進行觀察拍照，記錄多態(tài)性片段，特 異片段大小為555bp。
從而獲得一個與地被菊匍匐性狀控制基因相連鎖的分子標記SCA10555 (圖3)。 (三)應(yīng)用結(jié)果與分析
用A10引物對除構(gòu)建基因池的24個F,單株之外的128個Fi單株進行RAPD擴增 驗證(圖2)，標記的分離情況見表l，發(fā)現(xiàn)標記A-10s55的有無在152個Fi中分離比為 2.70: 1，接近3: 1，其中有12個單株發(fā)生了交換。采用Mapmaker/Exp3.0軟件對所得 RAPD標記和株型匍匐性基因之間的遺傳關(guān)系進行連鎖分析，結(jié)果表明標記A-10555 與匍匐性基因存在連鎖關(guān)系，重組率為7.89%，連鎖距離為7.96cM。
利用設(shè)計的特異引物SCA10對兩親本及152個F！單株進行SCAR分析驗證(圖3， 圖4)，其擴增結(jié)果與RAPD標記A-10555在雙親及152Fi單株中的分離相一致，特異片 段大小為555bp，命名為SCA10555，表明該RAPD標記已成功轉(zhuǎn)化為更為穩(wěn)定和便于應(yīng) 用的SCAR標記。
建立的分子標記輔助選擇方法能夠克服地被菊匍匐株型性狀基因型鑒定的困難。選 擇范圍更廣，強度更大。可以實現(xiàn)苗期提早選擇，減少工作量，大大提高匍匐型地被菊 的選擇效率，從而加快育種進程。
表l RAPD標記在Fi群體中的分離
株型性狀不同株型個體數(shù)有A-10s55株數(shù)無A-10555株數(shù)
匍匍型36342
中間型75714
直立型41635
序列表
<110>南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
<120> —種地被菊株型匍匐性分子標記輔助選擇方法
<130> 說明書
<140> 00
<141> 2008-09-18
<160> 4
< 170> Patentln version 3.1
<210> 1
<211> 10
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221> RAPD引物A-IO
<222> (I)..(IO) <223>
<400> 1
gtgatcgcag 10
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221> SCAR引物SCA10上引物序列
<222> (1)..(18) <223>
<400> 2
gtgatcgcag gaacaacc 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213>人工合成
<220>
<221>者用SCAR引物SCA10下游引物序列
<222> (1)..(18)
<223> <400> 3
gtgatcgcag ccgcttga 18
<210> 4
<211> 610
<212> DNA
<213> 菊
<220>
<221>分子標記八-10555片段序列 <222> (1)..(610) <223> <400> 4
gtgatcgcag gaacaacctc ggagacaatc cactgaccag agtagcaacc gtaacaacaa 60 ctaccgcggc caggggagcg gacgggataa tgacagatat acccactaac caagactcca 120 aaggagatat tcgcgacgga aggcgcgaac ttcccaagac ccccaccaat gcgcacccca 180 gaggatcgac gcgtggggag tagatactgt gactatcatg ggaagaaggg ccacaccacc 240 aatgaatgtt tccaattgcg ccagttaatt gataaactag taaaagaagg cagattggac 300 catctggtca agaacatcaa ggagggaaaa gataggcaga aaattgggag aaaaaaagag 360 gcacacaaag ataaggccaa caccatctac atgatacaat catggtagcg agtaactagg 420 cagaagatca gccagaagtt ttcccgtgga agtgaaattt ctttccccac attgactgcg 480 gacaacgcag tggttgaacc gctcaccatt gaaattaatg cagggggtca cgatatccac 540 cgcatgtatg ttgatggagg agcatatgca gacataatgt acgaacattg tttcaagcgg 600 ctgcgatcac 610
權(quán)利要求
1.一種地被菊株型匍匐性分子標記輔助選擇方法，其特征在于用RAPD引物A-105’-GTGATCGCAG-3’擴增匍匐型地被菊品種或育種材料DNA，如果能夠擴增出555bp的片段，則標志著地被菊匍匐基因的存在；或者用SCAR引物SCA10，上游引物序列5’-GTGATCGCAGGAACAACC-3’下游引物序列5’-GTGATCGCAGCCGCTTGA-3’擴增匍匐型地被菊品種或育種材料DNA，如果能夠擴增出555bp的片段，則標志著地被菊匍匐基因的存在。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種株型匍匐性分子標記輔助選擇方法，其特征在于， 所用分子標記引物是通過以下方法篩選獲得的1) 采用CTAB微量法提取地被菊基因組DNA;2) 根據(jù)BSA法原理，分別從Fi株型分離群體中選擇極端匍匐和直立的單株各lO 株，將稀釋的基因組DNA分別等量混合構(gòu)成匍匐基因池和直立基因池；3) 標記引物的篩選PCR擴增反應(yīng)在MJ Research公司生產(chǎn)的PTC-100TM型PCR儀上進行，反應(yīng)體系 共20 pL,包括lOxBuffer 2 ^L、 1.625 mmol.U1 MgCl2、 75 nmol.L-1 dNTP、 40 ng模 板DNA、 1.5 U Taq polymerase、 1.5 nmol丄-1 RAPD引物、用ddH20補齊20 pL;反應(yīng)程序為94。C預(yù)變性4min，然后進入下列循環(huán)94。C變性15 s， 35。C復(fù)性15s， 72t:延伸lmin 15s， 3個循環(huán);94。C變性30s， 40。C復(fù)性30s， 72 。C延伸lmin 15s， 40 個循環(huán)；最后72X:延伸7min; 4卩保溫；取7pL擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，電極緩沖液為lxTAE，電壓5V/cm，利用JS-380凝膠成像分析儀進行觀察拍照，記錄多態(tài)性片段555bp，其 RAPD引物為A-10: 5'-GTGATCGCAG-3'，從而獲得一個與地被菊匍匐性狀控制基因相連鎖的分子標記A-10555， A-10555片段序列如下，斜體加粗部分為RAPD引物序列，下劃線部分為SCAR引物序列 根據(jù)測序結(jié)果，利用軟件Primer Premier設(shè)計的特異引物SCA10 上游弓I物序列5，-GTGATCGCAGGAACAACC陽3 ，； 下游弓I物序列5，-GTGATCGCAGCCGCTTGA-3 ，進行SCAR擴增地被菊基因組DNA， 25pL的反應(yīng)體系中含有2.5 nL 10xBuffer， 1.5 nL25mMMgCl2， 2.0 2.5mMdNTP， lUTaqDNA聚合酶，1.5 nmol.L-1 SCA10引 物，20ng模板DNA，用ddH20補齊25pL;PCR反應(yīng)程序為94。C預(yù)變性5min，然后進入下列循環(huán)94。C變性lmin， 67。C復(fù) 性lmin， 72。C延伸lmin， 35個循環(huán)；最后72°C延伸10min; 4'C保溫；取7pL擴增產(chǎn)物在質(zhì)量比為2^的瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)EB染色，電極緩沖液為 1 xTAE，電壓5V/cm，利用JS-380凝膠成像分析儀進行觀察拍照，記錄多態(tài)性片段555bp，從而獲得一個與地被菊匍匐性狀控制基因相連鎖的分子標記SCA10555。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種地被菊株型匍匐性分子標記輔助選擇方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，用于地被菊株型匍匐性的分子標記輔助選擇育種。用RAPD引物A-10，或者用SCAR引物，擴增地被菊或育種材料DNA，如果能夠擴增出555bp的片段，均標志著地被菊匍匐基因的存在。本發(fā)明對以‘早意大利紅’(P1)為母本、03(6)-12為父本(P2)雜交獲得的152株F₁分離群體為試材，構(gòu)建株型匍匐/直立基因池進行RAPD及SCAR分子標記的篩選，可有效開展地被菊株型匍匐性的分子標記輔助育種，大大提高選擇效率，從而加快育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK101368208SQ20081015617
公開日2009年2月18日 申請日期2008年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月24日
發(fā)明者姜貝貝, 崔新利, 房偉民, 管志勇, 繆恒彬, 趙靜媛, 陳發(fā)棣, 陳素梅 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)