專利名稱：檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及一種檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條。
背景技術(shù)：
目前，國內(nèi)用的雙抗原夾心膠體金法檢測土拉菌時，常用土拉菌的脂多糖(LPS) 作為檢測血清中抗體的抗原。但脂多糖在大量的獲取、對環(huán)境的污染及操作人員安全等方 面存在缺陷，限制了這些方法的推廣和應(yīng)用。而 ^ορΑ蛋白是一種具有土拉菌共有的特異性 強和保守性好的外膜蛋白，并具有良好的抗原性，可用作檢測土拉菌的檢測抗原。本實驗利用制備的重組抗原，采用間接法的膠體金免疫層析試紙條來檢測土拉菌 抗體，并對該方法的特異性、敏感性進(jìn)行評價。通過對在人血清中摻入土拉菌 ^ορΑ抗體的 模擬樣品進(jìn)行檢驗，評價該法用于檢測土拉菌的可行性。

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的在于提供一種快速定性和定量檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠 體金免疫檢測試紙條。為實現(xiàn)上述目的，本實用新型檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙 條，包括反應(yīng)支撐物、緊密連接于反應(yīng)支撐物上表面中部的硝酸纖維膜，硝酸纖維膜起始端 的上表面與吸水墊部分重疊連接、硝酸纖維膜末端的下表面與金標(biāo)抗體保護(hù)膜部分重疊連 接，金標(biāo)抗體保護(hù)膜的上表面部分重疊連接有樣品墊，其中，金標(biāo)抗體保護(hù)膜包括膜本體、 及均勻涂布在其上的膠體金標(biāo)記的SPA涂層，硝酸纖維膜上靠近其起始端處設(shè)置有羊抗兔 IgG包被的質(zhì)控條帶、靠近其末端處設(shè)置有重組R)pA蛋白包被的檢測條帶。進(jìn)一步，所述反應(yīng)支持物為PVC板，吸水墊為濾油紙。進(jìn)一步，所述金標(biāo)抗體保護(hù)膜為玻璃纖維膜、聚脂膜或濾紙纖維。進(jìn)一步，所述樣品墊為玻璃纖維膜、聚脂膜或濾紙纖維。進(jìn)一步，所述試紙整體的外部包裹有外殼，該外殼上對應(yīng)于所述樣品墊處設(shè)置有 樣品孔，外殼上對應(yīng)于所述質(zhì)控條帶、檢測條帶處設(shè)置有觀察窗。本實用新型檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，結(jié)合了膠體金標(biāo) 記和雙抗原夾心免疫層析的技術(shù)原理，將樣品結(jié)合墊采用分散劑和封閉劑進(jìn)行預(yù)處理，確 定了最佳反應(yīng)條件，保證了檢測方法的敏感性和特異性，具有操作簡單，檢測時間短，無需 專業(yè)人員，適合快速現(xiàn)場檢測等優(yōu)點。并且，借助于相關(guān)設(shè)備，可做到定性和定量檢測，從而 大大提高了其推廣和應(yīng)用。

圖1為本實用新型檢測試紙條的目測敏感性圖；圖2為特異性檢測試驗圖；圖3為本實用新型檢測試紙條穩(wěn)定性檢測圖；[0014]圖4為本實用新型檢測試紙的擬合直線圖；圖5A為本實用新型檢測試紙的正面示意圖；圖5B為本實用新型檢測試紙的側(cè)面結(jié)構(gòu)示意圖；圖6A為本實用新型檢測試紙的陽性檢測結(jié)果示意圖；圖6B為本實用新型檢測試紙的陰性檢測結(jié)果示意圖；圖6C為本實用新型檢測試紙的無效檢測結(jié)果示意圖。
具體實施方式
如圖1至圖4，圖5A、圖5B、圖6A、圖6B、圖6C所示，圖1是本實用新型檢測試紙 條的目測敏感性圖。1 陰性對照；2-7 土拉菌抗體濃度M00ng/mL、1200ng/mL、120ng/mL、 60ng/mL、30ng/mL、15ng/mL。圖2為特異性檢測試驗。測試條1-6 :lug/mL的馬秋波GP2抗體、天花MlR抗體、 黃熱YF-E-D3抗體、禽流感NP抗體、登革病毒Deng-E-D3抗體和普氏立克次體120N抗體圖3為本實用新型檢測試紙條的目測敏感性圖穩(wěn)定性檢測；測試條1 陰性對照， 2 4 土拉菌抗體濃度 120ng/mL、60ng/mL、30ng/mL圖5A、圖5B中，1 吸水墊；2 硝酸纖維膜，T 包被重組R)pA蛋白檢測條帶；C 包 被羊抗兔IgG的質(zhì)控條帶；3 含有膠體金標(biāo)記SPA的玻璃纖維膜；4 樣品墊；5 反應(yīng)支持 物。圖6A、圖6B、圖6C是本實用新型的檢測結(jié)果示意圖；T、C兩條線陽性；C 一條線陰
性 ’無效。本實用新型檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，定性檢測土拉弗 朗西斯菌抗體靈敏度達(dá)到30ng/ml。在模擬樣品檢測中，檢測正常人血清中添加不同濃度土 拉弗朗西斯菌抗體的靈敏度達(dá)到到30ng/ml。另外，本實用新型的膠體金免疫層析試紙條在 37°C放置一周后檢測發(fā)現(xiàn)試紙條的檢測敏感性沒有下降，顯示了良好的穩(wěn)定性，相當(dāng)于4°C 存放12個月的效果；與馬秋波GP2抗體、天花MlR抗體、黃熱YF-E-D3抗體、禽流感NP抗 體、登革病毒Deng-E-D3抗體和普氏立克次體120N抗體等相似毒素沒有交叉反應(yīng)特異性良 好。結(jié)合金標(biāo)分析儀建立了膠體金免疫層法定量檢測土拉弗朗西斯菌抗體的工作擬 合曲線，在線性范圍內(nèi)，即R2O. 9905 ；線性范圍30 960ng/ml，可以進(jìn)行定量檢測。經(jīng)檢測 發(fā)現(xiàn)，該方法回收率高Gl. 0% 118. 6% )、重復(fù)性良好。本研究建立的膠體金定量檢測方 法可以在15min內(nèi)完成一定范圍內(nèi)的定量檢測，檢測時間縮短了 3 4個小時。并且經(jīng)過 整個檢測系統(tǒng)的優(yōu)化克服了檢測血清樣品時出現(xiàn)假陽性的現(xiàn)象。本實用新型檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，其中包括將待測 標(biāo)本與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用 上行，10-15分鐘判讀結(jié)果；所述檢測試紙條包括(1)反應(yīng)支持物；(2)吸水墊；(3)硝酸纖維膜，該膜包被有重組R)PA蛋白和質(zhì)控抗體的檢測條帶和質(zhì)控條帶；(4)金標(biāo)抗體保護(hù)膜，其中含有膠體金標(biāo)記的SPA ；[0032](5)樣品墊；其中反應(yīng)支持物選用PVC板；吸水墊選用濾油紙；硝酸纖維膜上靠近其起始端處 設(shè)置有羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶、靠近其末端處設(shè)置有重組R)pA蛋白包被的檢測條帶。 金標(biāo)抗體保護(hù)膜的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維，其上含有膠體金標(biāo)記的SPA ；樣 品墊材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。本實用新型方法所涉及試紙中的所述吸水墊選用濾紙，所述反應(yīng)支持物選用PVC 板，所述金標(biāo)抗體保護(hù)膜的材料選自聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維，其上均勻涂布有膠體金 標(biāo)記的抗體。本實用新型方法所涉及試紙中的所述金標(biāo)抗體保護(hù)膜由將膠體金標(biāo)記的SPA均 勻涂布在聚脂膜、玻璃纖維膜或濾紙纖維膜上來制成。本實用新型檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條的結(jié)構(gòu)為反應(yīng)支 持物5位于底層，硝酸纖維膜2位于反應(yīng)支持物5上的中部，硝酸纖維膜2的T處是重組 ^ορΑ蛋白包被的檢測條帶，C處是羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶；金標(biāo)抗體保護(hù)膜3位于硝酸 纖維膜2上部的一側(cè)并與之部分重疊，該膜含有膠體金標(biāo)記的重組土拉弗朗西斯菌抗體； 吸水墊1位于硝酸纖維膜2上部的相對于金標(biāo)抗體保護(hù)膜3而言的另一側(cè)、并與硝酸纖維 膜2部分重疊；樣品墊4位于硝酸纖維膜2上與吸水墊1相反的一側(cè)并與金標(biāo)抗體保護(hù)膜 3部分重疊。上述試紙中，吸水墊1 一側(cè)為起始端，金標(biāo)抗體保護(hù)膜3 —側(cè)為末端，檢測條帶位 于接近末端，質(zhì)控條帶接近于起始端。上述試紙中，重組 ^ορΑ蛋白的濃度為l_5mg/ml，質(zhì)控羊抗兔I gG的濃度為 0. l_5mg/ml0上述試紙中，羊抗兔IgG抗體濃度優(yōu)選為0. 5-2. 5mg/ml。上述試紙中，SPA標(biāo)記Iml膠體金的量為5_6ug。本實用新型檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條的制備方法，該方 法包括(1)用隔流噴金劃線機以一定噴膜速度噴涂抗土拉弗朗西斯菌抗體抗體和質(zhì)控抗 體兩個條帶的硝酸纖維膜；(2)制備一種含有膠體金標(biāo)記的SPA的金標(biāo)抗體保護(hù)膜，將膠體金標(biāo)記的SPA均勻 涂布在玻璃纖維膜上，并烘干或冷凍干燥后，制成金標(biāo)抗體保護(hù)膜。本實用新型所述的制備方法，其中所述噴涂包被膜的步驟中，噴膜速度是 10-100mm/so本實用新型所述的制備方法，其中所述重組R)PA蛋白，其加入量為l_5mg/ml，該 蛋白的稀釋液可以為PB。本實用新型所述的制備方法，其中質(zhì)控羊抗兔IgG的濃度為0. l-5mg/ml。本實用新型所述的制備方法，其中將膠體金標(biāo)記的SPA均勻涂布在玻璃纖維膜 上，其中PH為6. 4-6.8。本實用新型涉及所述試紙在檢測土拉弗朗西斯菌抗體中的應(yīng)用，其中包括將待測 標(biāo)本與樣品稀釋液混勻，再將樣品混合液加入試紙樣品孔處，樣品中的液體依靠虹吸作用 上行，10-15分鐘判讀結(jié)果。[0049]本實用新型涉及上述方法制備的檢測土拉弗朗西斯菌抗體的試紙。本實用新型所述的方法和產(chǎn)品中使用層析測試條耗材，耗材例如是玻璃纖維的結(jié) 合墊，硝酸纖維素膜(例如NC膜，SHF 1350225)，樣品墊及吸水墊、濾紙，可購自Minipore 公司。本實用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗體的檢測試紙，它還包含金標(biāo)抗體保護(hù)膜。本實用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗體的檢測試紙，其中反應(yīng)支持物選用 PVC 板。本實用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗體的檢測試紙，其中吸水墊選用濾紙。本實用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗體的檢測試紙，其中金標(biāo)抗體保護(hù)膜選 用聚脂膜、玻璃纖維或濾紙纖維。一、膠體金免疫層析試紙條的制備材料和方法1、抗原及抗體純化的天然土拉弗朗西斯菌抗體，研究室制備的兔、鼠抗重組相思子A鏈多克隆 抗體。2、層析測試條耗材結(jié)合墊(玻璃纖維)、硝酸纖維素膜(NC膜，SHF 1350225)、樣品墊及吸水墊、濾紙 購自Minipore公司。3、實驗儀器金標(biāo)分析儀(中國科學(xué)院上海光學(xué)精密機械研究所、中國檢驗檢疫科學(xué)研究院聯(lián) 合研制)。4、膠體金免疫層析試紙條的制備4. 1膠體金結(jié)合墊將pH值6. 4 6. 8、濃度0. 2mg/ml的SPA標(biāo)記于檸檬酸鈉法制備25nm的膠體金 顆粒的膠體金顆粒，37°C干燥[7]。4. 2硝酸纖維素膜檢測帶重組R)pA蛋白lmg/ml ；質(zhì)控帶羊抗兔IgG :lmg/ml，37°C干燥。4. 3 組裝將樣品墊、結(jié)合墊、吸水墊依次貼在帶有豁合劑的底襯卡，切成0. 4cm的條，干燥， 裝殼，室溫貯存?zhèn)溆?參見上述文獻(xiàn))。二、樣品的定性和定量檢測1、模擬樣品的處理采用人的血清樣品進(jìn)行檢測，用樣品處理液進(jìn)行100倍稀釋后作為待檢樣品 ’另 外，把稀釋后的人血清中加入 ^ορΑ抗體同時進(jìn)行檢測。2、定性檢測將處理后的樣品和樣品處理液(作為陰性樣品)IOOul加到制備好的層析條樣品 墊端，靜置15min，觀察結(jié)果。檢測帶和質(zhì)控帶均出現(xiàn)紅色判為陽性，僅質(zhì)控帶出現(xiàn)紅色為陰 性，檢測帶和質(zhì)控帶均不顯色，則為試紙條失效。[0075]3、定量檢測3. 1判定值(CUT-OFF)的確定按1.6. 1將陰性樣品檢測20次，用金標(biāo)免疫分析儀掃描讀取信號T/C比值。20個 樣品T/C比值的平均值(AVERAGE)與3倍標(biāo)準(zhǔn)差(STDEVA)之和為CUT-OFF值。3. 2定量檢測判定將顯色后的金標(biāo)條放入金標(biāo)免疫分析儀掃描，讀取信號T/C比值，大于判定值為陽性。 三、靈敏度試驗[0081] 1、定量檢測[0082] 1、定量檢測的靈敏度[0083] 檢測不同濃度土拉弗朗西斯菌抗體，經(jīng)過計算判定值(CUT-OFF)為0.002，濃度為 15ng/ml的土拉菌R)pA多抗的平均T/C比值均為0. 001，低于0. 002，為陰性；30 2400ng/ ml 的土拉菌 FopA 多抗的平均 T/C 比值分別為 0. 03,0. 061,0. 122,0. 211,0. 367,0. 627， 高于0. 002的結(jié)果為陽性；當(dāng)土拉菌R)pA多抗?jié)舛却笥?0ng/ml時，T/C比值平均值大于 0. 002，故檢測靈敏度為30ng/ml。 表1 土拉弗朗西斯菌抗體膠體金免疫層析試紙條各濃度檢測結(jié)果
權(quán)利要求1.檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，其特征在于，該試紙條包括反 應(yīng)支撐物、緊密連接于反應(yīng)支撐物上表面中部的硝酸纖維膜，硝酸纖維膜起始端的上表面 與吸水墊部分重疊連接、硝酸纖維膜末端的下表面與金標(biāo)抗體保護(hù)膜部分重疊連接，金標(biāo) 抗體保護(hù)膜的下表面部分重疊連接有樣品墊，其中，金標(biāo)抗體保護(hù)膜包括膜本體、及均勻涂 布在其上的膠體金標(biāo)記的SPA涂層，硝酸纖維膜上靠近其起始端處設(shè)置有羊抗兔IgG包被 的質(zhì)控條帶、靠近其末端處設(shè)置有重組 ^ορΑ蛋白包被的檢測條帶。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，其特征在 于，所述反應(yīng)支持物為PVC板，吸水墊為濾油紙。
3.如權(quán)利要求1所述的檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，其特征在 于，所述金標(biāo)抗體保護(hù)膜為玻璃纖維膜、聚脂膜或濾紙纖維。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，其特征在 于，所述樣品墊為玻璃纖維膜、聚脂膜或濾紙纖維。
5.如權(quán)利要求1所述的檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，其特征在 于，所述試紙整體的外部包裹有外殼，該外殼上對應(yīng)于所述樣品墊處設(shè)置有樣品孔，外殼上 對應(yīng)于所述質(zhì)控條帶、檢測條帶處設(shè)置有觀察窗。
專利摘要本實用新型公開了一種檢測土拉弗朗西斯菌抗體的膠體金免疫檢測試紙條，包括反應(yīng)支撐物、緊密連接于反應(yīng)支撐物上表面中部的硝酸纖維膜，硝酸纖維膜起始端的上表面與吸水墊部分重疊連接、硝酸纖維膜末端的下表面與金標(biāo)抗體保護(hù)膜部分重疊連接，金標(biāo)抗體保護(hù)膜的下表面部分重疊連接有樣品墊，其中，金標(biāo)抗體保護(hù)膜包括膜本體、及均勻涂布在其上的膠體金標(biāo)記的SPA涂層，硝酸纖維膜上靠近其起始端處設(shè)置有羊抗兔IgG包被的質(zhì)控條帶、靠近其末端處設(shè)置有重組FopA蛋白包被的檢測條帶。本實用新型結(jié)合了膠體金標(biāo)記和雙抗原夾心免疫層析的技術(shù)原理，將樣品結(jié)合墊采用分散劑和封閉劑進(jìn)行預(yù)處理，具有操作簡單，檢測時間短，適合快速現(xiàn)場檢測等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/569GK201903546SQ20102054668
公開日2011年7月20日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者孫肖紅, 景瀅瀅, 楊宇, 楊永莉, 王靜, 胡孔新 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院