專利名稱：用于家畜克隆的小量體細(xì)胞的玻璃化冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種玻璃化冷凍保存方法，具體地說是一種用于家畜克隆的小 量體細(xì)胞的玻璃化冷凍保存方法。
背景技術(shù)：
自1997年體細(xì)胞克隆綿羊"多莉"誕生后，多種體細(xì)胞克隆動(dòng)物紛紛問 世。眾所周知，體細(xì)胞克隆研究中，重構(gòu)胚是一核質(zhì)雜交體，細(xì)胞核來源于供 體細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)來源于去核卵母細(xì)胞。只有攜帶正常遺傳物質(zhì)的供體細(xì)胞，融 入去核的卵母細(xì)胞中后，供核才能在胞質(zhì)因子的作用下啟動(dòng)重構(gòu)胚的卵裂并進(jìn) 而指導(dǎo)其進(jìn)行正常的發(fā)育。如果供體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)異常，融合后則會(huì)導(dǎo)致重 構(gòu)胚卵裂異常，進(jìn)而使其發(fā)育受到阻滯。因此，提供形態(tài)良好、核型正常的供 體細(xì)胞是核移植實(shí)驗(yàn)獲得成功的先決條件。
由于體細(xì)胞只能在一定的代數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代次數(shù)過多可造成 細(xì)胞性狀發(fā)生改變，將細(xì)胞儲(chǔ)于冷凍管中在超低溫(-8(TC或-196°C)環(huán)境中 保存可解決這一問題。目前使用的冷凍方法主要有程序冷凍法、分步冷凍法和 玻璃化冷凍法。程序冷凍法使用冷凍儀，在設(shè)置的程序下進(jìn)行批量冷凍，解凍 后各管成活率差異較小，但購買儀器花費(fèi)較大。分步冷凍法是將冷凍管置于4 。C 10分鐘、-20 °C 30分鐘、-80 °C 16 18小時(shí)(或隔夜)，然后放入液 氮中長期儲(chǔ)存。由于此方法不需要冷凍儀，僅需普通冰箱、超低溫冰箱和液氮 罐就可滿足實(shí)驗(yàn)需要，因此廣泛用于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室。玻璃化冷凍法最早開始用于 早期胚胎和卵母細(xì)胞的冷凍保存，是指將裝有胚胎/卵母細(xì)胞的載體工具直接 投入液氮中，解凍后成活率高，而且對(duì)后期發(fā)育能力的損害較輕。但玻璃化冷 凍法存在的問題是高濃度玻璃化冷凍液不可避免地會(huì)對(duì)卵母細(xì)胞造成化學(xué)毒
性損傷和滲透壓損傷。因此，科學(xué)工作者不斷改進(jìn)冷凍方法，通過加快冷凍一 解凍速度，縮短卵母細(xì)胞與玻璃化溶液的接觸時(shí)間，以降低其化學(xué)毒性和滲透 壓損傷，將冷凍造成的卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的損傷降到最低程度。這些方法包括
電子顯微鏡銅網(wǎng)法(Martino等，1996) 、0PS法(小直徑的開放拉長細(xì)管)(Vajta 等，1998)、 SSV法(-150。C的固體表面)(Dinnyes等，2000)和CLV法(小 尼龍環(huán)上的CPA薄膜)(Lane等，1999)，其原理都是通過將卵母細(xì)胞懸浮 于體積很小的液滴中從而極大的提高降溫速率。但電子顯微鏡銅網(wǎng)法中使用的 電子顯微鏡貴重，購買儀器花費(fèi)較大；OPS法中由于OPS管都是用0. 25毫升塑 料管手工拉制，所以管徑大小不是很一致，造成冷凍效果的可重復(fù)性較差；SSV 法中冷凍的小顆粒很容易丟失；CLV法存在的問題是操作難度較大。
核移植中供體細(xì)胞主要有三種來源第一種是直接消化新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞
(陳大元等，1999);第二種是解凍冷凍保存的細(xì)胞，重新接種培養(yǎng)，待細(xì)胞 80-100%貼壁匯合后消化使用(Lan等，2006);第三種是直接使用解凍后細(xì)胞
(梁素麗等，2007)。這三種來源的細(xì)胞都有動(dòng)物出生，說明三種來源的細(xì)胞 在去核的卵胞質(zhì)中都具有去分化重獲全能性的能力。但使用新鮮培養(yǎng)的細(xì)胞工 作量大，而且細(xì)胞性狀容易發(fā)生改變。因此，研究人員一般傾向使用第二種和 第三種來源的細(xì)胞。核移植實(shí)驗(yàn)中，每次操作卵母細(xì)胞大都在100個(gè)以下。因 此，僅需要準(zhǔn)備100個(gè)左右攜帶正常遺傳物質(zhì)的供體細(xì)胞就可以滿足試驗(yàn)需要。 而目前細(xì)胞冷凍中每只冷凍管裝有大約1 X 106-5X 106個(gè)細(xì)胞，若直接使用解 凍后細(xì)胞造成細(xì)胞的大量浪費(fèi)；若解凍后重新接種培養(yǎng)又會(huì)加大工作量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是提供一種用于家畜克隆的小量體細(xì)胞的玻璃化冷凍 保存方法。
本發(fā)明的操作步驟如下 (一)、液體配制
基礎(chǔ)液在100ml細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM液)中添加20ml—30ml胎牛血清(V/V) 禾口 0. 5ml—1. 5ml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic);
玻璃化冷凍液I :在100ml基礎(chǔ)液中添加2ml—4ml乙二醇(V/V)和2ml-一4ml 二甲基亞砜(V/V);
玻璃化冷凍液II:在100 ml基礎(chǔ)液中添加30 ml—35 ml乙二醇(V/V)、 30 ml—35ml份二甲基亞砜(V/V)和0. 2-0. 3摩爾海藻糖；
解凍液在100 ml基礎(chǔ)液中添加0. 25-0. 35摩爾蔗糖；
(二) 、玻璃化冷凍
用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合程度為80%-90%時(shí)先消化1孔細(xì)胞， 用1. 5毫升離心管收集細(xì)胞懸液，800g-1000g離心5-8分鐘，去上清；接著加 入lml玻璃化冷凍液I ，再800g-1000g離心5-8分鐘，去上清；然后加入0. 5ml 玻璃化冷凍液II，混勻；之后，用移液器吸取2微升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一平皿的 空白處； 一支顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標(biāo)記線處，立即將顯微玻璃管 投入液氮中儲(chǔ)存；如此反復(fù)進(jìn)行冷凍操作，細(xì)胞進(jìn)入玻璃化冷凍液II的時(shí)間控 制在1分鐘內(nèi)，超過1分鐘，剩余細(xì)胞不再作冷凍處理；再消化l孔細(xì)胞，重 復(fù)前面步驟，直至將所有孔內(nèi)細(xì)胞冷凍保存。
(三) 、解凍
首先在一平皿中放置2ml解凍液，接著從液氮中取出1支顯微玻璃管， 將顯微玻璃管標(biāo)記線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利用手指的溫 度驅(qū)使細(xì)胞進(jìn)入到解凍液中，停留3-5分鐘；之后，用口吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝 有2 ml基礎(chǔ)液的另一平皿中，停留3-5分鐘；最后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到進(jìn)行核移植實(shí) 驗(yàn)的平皿中即可。
所述的顯微玻璃管其外徑為1毫米，內(nèi)徑為0. 75毫米，長為10厘米。 本發(fā)明的用于家畜克隆的小量體細(xì)胞的玻璃化冷凍保存方法與現(xiàn)有技術(shù)
相比，具有成本花費(fèi)低，方法簡單，不需昂貴儀器，而且冷凍保存效果好、解
凍后成活率高的特點(diǎn)。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1:
牛耳成纖維細(xì)胞的玻璃化冷凍保存步驟如下
(1) 、配置液體
基礎(chǔ)液在100ml細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM液)中添加20ml胎牛血清(V/V) 禾口 0. 5ml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic);
玻璃化冷凍液I :在100ml基礎(chǔ)液中添加2ml乙二醇(V/V)和2ml 二甲 基亞砜(V/V);
玻璃化冷凍液II:在100 ml基礎(chǔ)液中添加30 ml乙二醇(V/V)、 30 ml 份二甲基亞砜(V/V)和0.2摩爾海藻糖；
解凍液在100 ml基礎(chǔ)液中添加0. 25摩爾蔗糖；
(2) 、冷凍用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合程度為85%時(shí)先消化1孔 細(xì)胞，用1.5毫升離心管收集細(xì)胞懸液，1000g離心5分鐘，去上清。接著加 入1毫升玻璃化冷凍液I ，再1000g離心5分鐘，去上清。然后加入0. 5毫升 玻璃化冷凍液II,混勻。之后，用移液器吸取2微升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一平皿的 空白處。顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標(biāo)記線處，立即將顯微玻璃管投入 液氮中儲(chǔ)存；如此反復(fù)進(jìn)行冷凍操作，細(xì)胞進(jìn)入玻璃化冷凍液II的時(shí)間控制在
l分鐘內(nèi)，超過1分鐘，剩余細(xì)胞不再作冷凍處理；再消化l孔細(xì)胞，重復(fù)前 面步驟，直至將所有孔內(nèi)細(xì)胞冷凍保存；
(3) 、解凍首先在一平皿中放置2毫升解凍液。然后從液氮中取出1支 顯微玻璃管，將顯微玻璃管劃線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利 用指頭的溫度驅(qū)使細(xì)胞進(jìn)入到解凍液中，停留5分鐘。之后，用口吸管將細(xì)胞 轉(zhuǎn)移到裝有2毫升基礎(chǔ)液的另一平皿中，停留5分鐘。最后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到進(jìn)行 核移植實(shí)驗(yàn)的平皿中即可。
試驗(yàn)中冷凍牛耳成纖維細(xì)胞1 0 0管，解凍后成活率在85%-92%，染色體核 型正常率為95%。 實(shí)施例2:
冷凍牛輸卵管上皮細(xì)胞的玻璃化冷凍保存步驟如下
(1) 、配置液體
基礎(chǔ)液在100ml細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM液)中添加30ml胎牛血清(V/V)和 1.5ml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic);
玻璃化冷凍液I :在100ml基礎(chǔ)液中添加4ml乙二醇(V/V)和4ml 二甲 基亞砜(V/V);
玻璃化冷凍液II:在100 ml基礎(chǔ)液中添加35 ml乙二醇(V/V)、 35ml份 二甲基亞砜(V/V)和0.3摩爾海藻糖；
解凍液在100 ml基礎(chǔ)液中添加0. 35摩爾蔗糖；
(2) 、冷凍用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合程度為80%時(shí)先消化1孔 細(xì)胞，用1. 5毫升離心管收集細(xì)胞懸液，800g離心5分鐘，去上清。接著加入 1毫升玻璃化冷凍液I ，再800g離心5分鐘，去上清。然后加入0. 5毫升玻璃 化冷凍液II，混勻。之后，用移液器吸取2微升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一平皿的空白 處。顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標(biāo)記線處，立即將顯微玻璃管投入液氮 中儲(chǔ)存；如此反復(fù)進(jìn)行冷凍操作，細(xì)胞進(jìn)入玻璃化冷凍液II的時(shí)間控制在1分 鐘內(nèi)，超過1分鐘，剩余細(xì)胞不再作冷凍處理；再消化l孔細(xì)胞，重復(fù)前面步 驟，直至將所有孔內(nèi)細(xì)胞冷凍保存；
(3) 、解凍首先在一平皿中放置2毫升解凍液。然后從液氮中取出1支 顯微玻璃管，將顯微玻璃管劃線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利 用指頭的溫度驅(qū)使細(xì)胞進(jìn)入到解凍液中，停留3分鐘。之后，用口吸管將細(xì)胞 轉(zhuǎn)移到裝有2毫升基礎(chǔ)液的另一平皿中，停留3分鐘。最后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到進(jìn)行 核移植實(shí)驗(yàn)的平皿中即可。
試驗(yàn)中冷凍牛輸卵管上皮細(xì)胞l 0 0管，解凍后成活率在81%-87%，染色體 核型正常率在90%。 實(shí)施例3:
冷凍山羊輸卵管上皮細(xì)胞的玻璃化冷凍保存步驟如下
(1) 、配置液體
基礎(chǔ)液在100ml細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM液)中添加25ml胎牛血清(V/V)和 lml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic);
玻璃化冷凍液I :在100ml基礎(chǔ)液中添加3ml乙二醇(V/V)和3ml 二甲 基亞砜(V/V);
玻璃化冷凍液II:在100 ml基礎(chǔ)液中添加30 ml乙二醇(V/V)、 30ml份 二甲基亞砜(V/V)和0.25摩爾海藻糖；
解凍液在100 ml基礎(chǔ)液中添加0. 3摩爾蔗糖；
(2) 、冷凍用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合程度為80%時(shí)先消化1孔 細(xì)胞，用1.5毫升離心管收集細(xì)胞懸液，900g離心7分鐘，去上清。接著加入 1毫升玻璃化冷凍液I ，再900g離心7分鐘，去上清。然后加入0. 5毫升玻璃 化冷凍液II,混勻。之后，用移液器吸取2微升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一平皿的空白 處。顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標(biāo)記線處，立即將顯微玻璃管投入液氮 中儲(chǔ)存；如此反復(fù)進(jìn)行冷凍操作，細(xì)胞進(jìn)入玻璃化冷凍液II的時(shí)間控制在1分 鐘內(nèi)，超過1分鐘，剩余細(xì)胞不再作冷凍處理；再消化l孔細(xì)胞，重復(fù)前面步 驟，直至將所有孔內(nèi)細(xì)胞冷凍保存；
(3) 、解凍首先在一平皿中放置2毫升解凍液。然后從液氮中取出1支 顯微玻璃管，將顯微玻璃管劃線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利 用指頭的溫度驅(qū)使細(xì)胞進(jìn)入到解凍液中，停留4分鐘。之后，用口吸管將細(xì)胞 轉(zhuǎn)移到裝有2毫升基礎(chǔ)液的另一平皿中，停留4分鐘。最后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到進(jìn)行
核移植實(shí)驗(yàn)的平皿中即可。
試驗(yàn)中冷凍山羊輸卵管上皮細(xì)胞120管，解凍后成活率在83%-89%，染色 體核型正常率在87%。
實(shí)施例4:
冷凍豬耳成纖維細(xì)胞的玻璃化冷凍保存步驟如下
(1)、配置液體
基礎(chǔ)液在100ml細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM液)中添加20ml胎牛血清(V/V)和 1. 5ml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic);
玻璃化冷凍液I :在100ml基礎(chǔ)液中添加2ml乙二醇(V/V)和4ml 二甲 基亞砜(V/V);
玻璃化冷凍液II:在100 ml基礎(chǔ)液中添加30 ml乙二醇(V/V)、 35ml份 二甲基亞砜(V/V)和0.3摩爾海藻糖；
解凍液在100 ml基礎(chǔ)液中添加0. 23摩爾蔗糖；
(2) 、冷凍用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合程度為90%時(shí)先消化1孔 細(xì)胞，用1.5毫升離心管收集細(xì)胞懸液，1000g離心5分鐘，去上清。接著加 入1毫升玻璃化冷凍液I ，再1000g離心5分鐘，去上清。然后加入0. 5毫升 玻璃化冷凍液II，混勻。之后，用移液器吸取2微升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一平皿的 空白處。顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標(biāo)記線處，立即將顯微玻璃管投入 液氮中儲(chǔ)存；如此反復(fù)進(jìn)行冷凍操作，細(xì)胞進(jìn)入玻璃化冷凍液II的時(shí)間控制在 l分鐘內(nèi)，超過1分鐘，剩余細(xì)胞不再作冷凍處理；再消化l孔細(xì)胞，重復(fù)前 面步驟，直至將所有孔內(nèi)細(xì)胞冷凍保存；
(3) 、解凍首先在一平皿中放置2毫升解凍液。然后從液氮中取出1支
顯微玻璃管，將顯微玻璃管劃線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利 用指頭的溫度驅(qū)使細(xì)胞進(jìn)入到解凍液中，停留3分鐘。之后，用口吸管將細(xì)胞 轉(zhuǎn)移到裝有2毫升基礎(chǔ)液的另一平皿中，停留5分鐘。最后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到進(jìn)行 核移植實(shí)驗(yàn)的平皿中即可。
試驗(yàn)中冷凍豬耳成纖維細(xì)胞90管，解凍后成活率在68%-75%，染色體核型 正常率在85%。
權(quán)利要求
1、用于家畜克隆的小量體細(xì)胞的玻璃化冷凍保存方法，其特征在于該方法的具體步驟如下(一)、液體配制基礎(chǔ)液在100ml細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM液)中添加20ml-30ml胎牛血清(V/V)和0.5ml-1.5ml抗菌素液(Antibiotic-Antimycotic)；玻璃化冷凍液I在100ml基礎(chǔ)液中添加2ml-4ml乙二醇(V/V)和2ml-4ml二甲基亞砜(V/V)；玻璃化冷凍液II在100ml基礎(chǔ)液中添加30ml-35ml乙二醇(V/V)、30ml-35ml份二甲基亞砜(V/V)和0.2-0.3摩爾海藻糖；解凍液在100ml基礎(chǔ)液中添加0.25-0.35摩爾蔗糖；(二)、玻璃化冷凍用6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞匯合程度為80％-90％時(shí)先消化1孔細(xì)胞，用1.5毫升離心管收集細(xì)胞懸液，800g-1000g離心5-8分鐘，去上清；接著加入1ml玻璃化冷凍液I，再800g-1000g離心5-8分鐘，去上清；然后加入0.5ml玻璃化冷凍液II，混勻；之后，用移液器吸取2微升細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到一平皿的空白處；一支顯微玻璃管插入其中，吸入液體至標(biāo)記線處，立即將顯微玻璃管投入液氮中儲(chǔ)存；如此反復(fù)進(jìn)行冷凍操作，細(xì)胞進(jìn)入玻璃化冷凍液II的時(shí)間控制在1分鐘內(nèi)，超過1分鐘，剩余細(xì)胞不再作冷凍處理；再消化1孔細(xì)胞，重復(fù)前面步驟，直至將所有孔內(nèi)細(xì)胞冷凍保存；(三)、解凍首先在一平皿中放置2ml解凍液，接著從液氮中取出1支顯微玻璃管，將顯微玻璃管標(biāo)記線的一端插入解凍液中，用食指堵住另一端，利用手指的溫度驅(qū)使細(xì)胞進(jìn)入到解凍液中，停留3-5分鐘；之后，用口吸管將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有2ml基礎(chǔ)液的另一平皿中，停留3-5分鐘；最后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到進(jìn)行核移植實(shí)驗(yàn)的平皿中即可。
2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于家畜克隆的小量體細(xì)胞的玻璃化冷凍保存 方法，其特征在于所述的顯微玻璃管其外徑為1毫米，內(nèi)徑為0.75毫米，長 為IO厘米。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于家畜克隆的小量體細(xì)胞的玻璃化冷凍保存方法，屬于玻璃化冷凍保存領(lǐng)域。該方法的操作步驟如下(一)液體配制；(二)玻璃化冷凍；(三)解凍。本發(fā)明的用于家畜克隆的小量體細(xì)胞的玻璃化冷凍保存方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有成本花費(fèi)低，方法簡單，不需昂貴儀器，而且冷凍保存效果好、解凍后成活率高的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/06GK101338299SQ20081013880
公開日2009年1月7日 申請(qǐng)日期2008年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月29日
發(fā)明者萬發(fā)春, 劉曉牧, 吳乃科, 宋恩亮, 偉 游, 譚秀文 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所