水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于哺乳動(dòng)物繁殖領(lǐng)域，尤其涉及一種水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激 活方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水牛是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織認(rèn)為最具開發(fā)潛力和開發(fā)價(jià)值的家畜之一。通過(guò)玻璃化冷 凍的方法將其具有遺傳價(jià)值的卵子進(jìn)行保存，可提高水牛卵子的使用價(jià)值。目前，水牛卵 母細(xì)胞的玻璃化冷凍進(jìn)程仍十分緩慢，很多研宄者把玻璃化冷凍的優(yōu)化都集中在冷凍程序 上，而忽略了激活條件是否也存在問(wèn)題。玻璃化冷凍除了凍融后超微結(jié)構(gòu)的改變等因素外， 激活條件也是一個(gè)重要的因素。
[0003] 卵母細(xì)胞激活是家畜顯微受精和細(xì)胞核移植的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，經(jīng)孤雌生殖而產(chǎn)生 的單倍體和純合雙倍體細(xì)胞系在各種遺傳學(xué)中都具有重要的價(jià)值，可用于間接評(píng)估研宄胚 胎發(fā)育初始機(jī)制。隨著這些研宄的不斷深入，利用孤雌激活得到的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)建立胚胎 干細(xì)胞系，挖掘優(yōu)良的遺傳資源，有助于闡明孤雌生殖與有性生殖的內(nèi)在聯(lián)系與差異。孤雌 生殖技術(shù)也是衡量體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞成熟的方法，尤其對(duì)評(píng)價(jià)動(dòng)物卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后 發(fā)育潛能的高低至關(guān)重要。Lan(文獻(xiàn)1)和Nasr-Esfahani(文獻(xiàn)2)通過(guò)系統(tǒng)地分析不同 的激活條件，表明離子霉素處理時(shí)間與濃度明顯影響到卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。同樣，2010 年，Nasr-Esfahani(文獻(xiàn)3)也發(fā)現(xiàn)6-DMAP的處理會(huì)影響到紡錘體軸的旋轉(zhuǎn)、原核的形成 和胚胎的發(fā)育。離子霉素是通過(guò)引發(fā)Ca2+內(nèi)流或鈣庫(kù)釋放而達(dá)到卵母細(xì)胞的激活；6-DMAP 則主要抑制成熟促進(jìn)因子（MaturationorM-PhasePromotingFactor,MPF)和/或細(xì)胞 靜止因子（CytostatieFactor，CSF)的活性和第二極體的排出，形成二倍體胚胎。2012年， Asgari(文獻(xiàn)4)研宄發(fā)現(xiàn)綿羊成熟卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍后，細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生一系列變化， 而這些變化在一定程度上具有輕微激活卵母細(xì)胞的特征，相比于新鮮卵母細(xì)胞的激活，其 激活閾值相對(duì)較低。
[0004] 目前，幾乎所有冷凍復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞在進(jìn)行這些操作時(shí)普遍采用與新鮮卵母細(xì) 胞一樣的激活程序。事實(shí)上，復(fù)蘇的卵母細(xì)胞與新鮮的卵母細(xì)胞相比，在某些方面可能沒(méi)有 處于同樣的水平，導(dǎo)致其孤雌激活條件與新鮮的卵母細(xì)胞有所不同，若采用與新鮮卵母細(xì) 胞同等的激活條件，將降低凍融后卵母細(xì)胞的激活率，同時(shí)也會(huì)降低卵母細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育 能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種專門針對(duì)冷凍復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞可提高其 激活率的水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，進(jìn)而提高凍融后卵母細(xì)胞的存活率和 發(fā)育潛能。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后 孤雌激活方法，先將凍融恢復(fù)后的卵母細(xì)胞置于3. 5ymol/L的離子霉素工作液激活處理 5min，再移入2mmol/L的含6-DMAP的工作液培養(yǎng)2-4h。
[0007] 上述水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，先將凍融恢復(fù)后的卵母細(xì)胞置于 3. 5ymol/L的離子霉素工作液激活處理5min，再移入2mmol/L的含6-DMAP的工作液培養(yǎng) 4h，然后經(jīng)培養(yǎng)液洗滌3次移入顆粒細(xì)胞單層微滴于39°C，5% 0)2和最大飽和濕度的培養(yǎng) 箱中共培養(yǎng)。
[0008] 共培養(yǎng)過(guò)程中，每隔2天半量更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后檢查分裂率，7-8天記錄囊胚 發(fā)育率。
[0009] 目前水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活歷經(jīng)三步驟：卵母細(xì)胞的采集與成熟； 對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行冷凍_解凍；將凍融后的卵母細(xì)胞進(jìn)行激活。傳統(tǒng)方法進(jìn)行孤雌激活時(shí)，沒(méi) 有考慮到復(fù)蘇的卵母細(xì)胞與新鮮的卵母細(xì)胞可能存在一定水平的不同，未對(duì)激活條件進(jìn)行 針對(duì)性研宄，而往往直接采用與新鮮卵母細(xì)胞同等的激活條件，因而降低了凍融后卵母細(xì) 胞的激活率，同時(shí)也會(huì)降低卵母細(xì)胞的后續(xù)發(fā)育能力。為此，發(fā)明人對(duì)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行了深入 研宄，深度優(yōu)化了水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，從而建立了本發(fā)明的方法。該 法采用優(yōu)化的離子霉素（ionomycin)聯(lián)合6-DMAP(6-二甲基氨基嘌呤）的激活處理方式， 改良了已有水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法。實(shí)驗(yàn)證明，孤雌激活條件對(duì)冷凍復(fù) 蘇水牛卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能存在一定影響。應(yīng)用本發(fā)明專門針對(duì)冷凍復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞的 孤雌激活方法，可提高其激活率，進(jìn)而提高凍融后卵母細(xì)胞的存活率和發(fā)育潛能。
【附圖說(shuō)明】
[0010] 圖1是研宄和應(yīng)用本發(fā)明水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 一、試驗(yàn)材料
[0012] 水牛卵巢由南寧屠宰場(chǎng)提供。試驗(yàn)所用的試劑除TCM-199購(gòu)自Gibco公司外，其 他試劑如無(wú)特殊說(shuō)明均購(gòu)自Sigma化學(xué)公司。主要儀器設(shè)備有體視顯微鏡、0)2培養(yǎng)箱、4°C 冰箱、液氮罐。
[0013] 二、試驗(yàn)方法
[0014] (1)卵母細(xì)胞的收集與體外成熟
[0015] 卵母細(xì)胞的收集與體外成熟的操作方法參考Zhuang(文獻(xiàn)5)。從屠宰場(chǎng)獲得卵 巢后，剪去周邊多余的組織，再用注射器抽取卵巢表面直徑為2-6_卵泡中的卵母細(xì)胞，在 39°C，5%C02和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外成熟培養(yǎng)22-24h。成熟培養(yǎng)后，挑選排 出第一極體、胞質(zhì)均勻、飽滿的成熟卵母細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0016] (2)卵母細(xì)胞的冷凍
[0017] 將步驟（1)成熟培養(yǎng)后的細(xì)胞，挑選排出第一極體、胞質(zhì)均勻、飽滿的成熟卵母 細(xì)胞進(jìn)行冷凍。玻璃化冷凍水牛卵母細(xì)胞的操作方法參考（文獻(xiàn)6)。冷凍時(shí)將室溫調(diào)至 22-24°C。首先將成熟卵母細(xì)胞先移入含有20 %FBS的冷凍基礎(chǔ)液（TCM199-Ifepes緩沖液） 中5!^11，隨后移入冷凍平衡液〇111199-11印68+20%?85+10%二甲基亞砜+10%乙二醇）中 lmin，觀察卵母細(xì)胞大體滲透充分后，移入冷凍液（TCM199-Ifepes+20%FBS+20%二甲基亞 砜+20%乙二醇+0.5M蔗糖）中，30s內(nèi)轉(zhuǎn)移到冷凍管內(nèi)，迅速投入液氮。每次操作卵母細(xì) 胞數(shù)為5個(gè)，所帶液體體積〈1yL。
[0018] (3)卵母細(xì)胞的解凍
[0019] 步驟⑵的卵母細(xì)胞在液氮保存l-2d，隨即解凍。將解凍液（TCM199-Ifepes+20% FBS+0. 5M蔗糖）提前2h于培養(yǎng)箱預(yù)熱。解凍過(guò)程均在37°C的加熱板上進(jìn)行，將冷凍管從 液氮中取出，將含有卵母細(xì)胞端的冷凍管迅速浸入解凍液中使卵母細(xì)胞排到解凍液。在解 凍液平衡5min，將其移入含有20%FBS的冷凍基礎(chǔ)液中5min，最后移入含有20%FBS的冷 凍基礎(chǔ)液，在39°C，5%C02和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中復(fù)蘇1-1.5h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
[0020] (4)孤雌激活
[0021] 將步驟（3)凍融恢復(fù)后的卵母細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案置于離子霉素工作液激活處 理，再移入含6-DMAP的工作液培養(yǎng)，最后經(jīng)培養(yǎng)液洗滌3次移入顆粒細(xì)胞單層微滴于39°C， 5%C02和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)，對(duì)照組直接進(jìn)行常規(guī)激活（即5ymol/L離子 霉素激活5min，結(jié)合2mmol/L6-DMAP處理4h)。每隔2天半量更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后檢 查分裂率，7-8天記錄囊胚發(fā)育率。
[0022] (5)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
[0023] 試驗(yàn)1離子霉素作用濃度對(duì)水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活效果的影響
[0024] 將凍融恢復(fù)后的卵母細(xì)胞隨機(jī)分為4組進(jìn)行以下處理：
[0025] I組：5 u mol/L 5min ionomycin+2mmo1 /T, 4h 6-DMAP ;
[0026] II組：3. 5 umol/L 5min ionomycin+2mmo1 /T, 4h 6-DMAP ;
[0027] III組：2 umol/L 5min ionomycin+2mmo1 /T, 4h 6-DMAP ;
[0028] IV組：1 y mol/L 5min i onomycin+2mmo1 /T, 4h 6-DMAP ;
[0029] 對(duì)照組為新鮮的成熟卵母細(xì)胞。
[0030] 最后移入制備好的顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)，觀察后續(xù)發(fā)育能力。
[0031] 試驗(yàn)26-DMAP濃度和處理時(shí)間對(duì)水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活效果的影 響
[0032] 從試驗(yàn)1中選取離子霉素的最佳處理濃度進(jìn)行試驗(yàn)2。將凍融恢復(fù)后的卵母細(xì)胞 隨機(jī)分為4組進(jìn)行以下處理：
[0033]I組：ionomycin處理+2mmo1 /T, 4h 6-DMAP；
[0034]II組：ionomycin處理+2mmo1 /T, 2h 6-DMAP ;
[0035]III組：ionomycin處理+1mmo1 /T, 4h 6-DMAP ;
[0036]IV組：ionomycin處理+1mmo1 /T, 2h 6-DMAP ;
[0037] 對(duì)照組為新鮮的成熟卵母細(xì)胞。
[0038] 激活后移入制備好的顆粒細(xì)胞單層共培養(yǎng)，觀察后續(xù)發(fā)育能力。
[0039] 三、試驗(yàn)結(jié)果
[0040]1.離子霉素作用濃度對(duì)水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活效果的影響[0041] 水牛成熟卵母細(xì)胞經(jīng)玻璃化冷凍并解凍復(fù)蘇，使用不同濃度的離子霉素進(jìn)行孤雌 激活，如表1所示，其卵裂率、4-細(xì)胞率、8細(xì)胞率和囊胚率比對(duì)照組均有所下降（P〈0. 01)。 在四個(gè)處理組中，當(dāng)離子霉素濃度為3. 5ymol/L時(shí)，其卵裂率（57. 0±1. 1) %、8細(xì)胞率 (31. 1 ±2. 1) %和囊胚率（11. 2±0. 9) %均顯著高于其它處理組（除I組的4-細(xì)胞率外）
[0042] (P〈0. 05)。結(jié)果表明，水牛成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍-解凍復(fù)蘇后，使用 3. 5ymol/L的離子霉素激活5min，可提高卵母細(xì)胞凍融后孤雌激活率。
[0043] 表1不同濃度的離子霉素對(duì)水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活效果的影響
[0044]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，其特征在于：先將凍融恢復(fù)后的卵 母細(xì)胞置于3. 5 ymol/L的離子霉素工作液激活處理5min，再移入2mmol/L的含6-DMAP的 工作液培養(yǎng)2-4h。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，其特征在于： 先將凍融恢復(fù)后的卵母細(xì)胞置于3. 5 ymol/L的離子霉素工作液激活處理5min，再移入 2mmol/L的含6-DMAP的工作液培養(yǎng)4h，然后經(jīng)培養(yǎng)液洗滌3次移入顆粒細(xì)胞單層微滴于 39°C，5% C02和最大飽和濕度的培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，其特征在于共培 養(yǎng)過(guò)程中，每隔2天半量更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h后檢查分裂率，7-8天記錄囊胚發(fā)育率。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法，該法采用優(yōu)化的離子霉素聯(lián)合6-DMAP的激活處理方式，改良優(yōu)化了已有水牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后孤雌激活方法。實(shí)驗(yàn)證明，孤雌激活條件對(duì)冷凍復(fù)蘇水牛卵母細(xì)胞的發(fā)育潛能存在一定影響。應(yīng)用本發(fā)明專門針對(duì)冷凍復(fù)蘇后的卵母細(xì)胞的孤雌激活方法，可提高其激活率，進(jìn)而提高凍融后卵母細(xì)胞的存活率和發(fā)育潛能。
【IPC分類】C12N5-075
【公開號(hào)】CN104593322
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510013826
【發(fā)明人】盧克煥, 王彩玲, 張華智, 陸陽(yáng)清, 楊小淦, 許惠艷
【申請(qǐng)人】廣西大學(xué)
【公開日】2015年5月6日
【申請(qǐng)日】2015年1月12日