專利名稱：：一種改良棉花纖維品質(zhì)的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種改良棉花纖維品質(zhì)的培育方法。技術(shù)背景棉花是世界上最重要的天然纖維作物，在人類的衣食活動中具有無可替代的地位。隨著紡紗技術(shù)的不斷改進和人們生活水平的提高，對棉花纖維品質(zhì)尤其是纖維強度提出了更高的要求(劉進元等，2000，植物學(xué)報，42:951-955)。如何在提高棉花產(chǎn)量的同時，盡快改良纖維品質(zhì)成了棉花育種者集中關(guān)注的問題。由于纖維品質(zhì)與產(chǎn)量在遺傳上呈現(xiàn)負相關(guān)，單純依靠常規(guī)育種技術(shù)在較短時間內(nèi)大幅度同步改良棉花纖維品質(zhì)與產(chǎn)量相當(dāng)困難(張?zhí)煺?，棉花學(xué)報，2000，12:321-326)?；蚬こ痰陌l(fā)展為打破這類不良連鎖提供了機遇，為實現(xiàn)優(yōu)良目的基因的定向轉(zhuǎn)移提供了途徑，同時還具有后代易于穩(wěn)定，育種周期短等優(yōu)點，可望實現(xiàn)棉花纖維品質(zhì)與產(chǎn)量的同步改良。自1987年Umbeck等人首次報道采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將//^1I基因和6M堪因?qū)腙懙孛奁贩N珂字312、310中，獲得了世界上第一株轉(zhuǎn)基因棉花。之后，棉花基因工程的研究和開發(fā)的進展十分迅速。目前，已成功培育出了抗蟲(Perlaketal.，PlantJ.2001,27(6):489-501)、抗除草劑(Fillattietal.，ProcBelwideCttonProdConf.1989,17-19)、彩色棉(LiX，etal.，PlantCellR印，2004,22:691-697.)、低酚棉(Sunilkumaretal.，PNAS,2006,103:18054-18059)和轉(zhuǎn)聚羥基丁酸(PHB)合成酶基因(JohnandKeller,ProcNatlAcadSciUSA.1996a,93:12768-12773)等轉(zhuǎn)基因品種。這些轉(zhuǎn)基因棉花在降低生產(chǎn)成本和保護環(huán)境方面起到了很重要的作用，并不同程度地滿足了人們對彩色棉和纖維絕熱等自然特性的要求；同時也表明外源基因在棉花中高效表達是可行的。目前，在抗蟲、抗除草、抗病、抗逆境等棉花育種方面已經(jīng)取得了重大進展，但在優(yōu)質(zhì)棉的研究和育種工作方面進展緩慢，相關(guān)的分子生物學(xué)和基因工程研究則剛剛起步。因此，纖維產(chǎn)量和品質(zhì)改良的基因工程研究成為國內(nèi)外棉花研究的熱點與難點。利用基因工程改良纖維品質(zhì)有兩條基本途徑一是分離鑒定出與纖維品質(zhì)密切相關(guān)的基因，將其導(dǎo)入棉花，增加或抑制某些與棉花纖維品質(zhì)相關(guān)的蛋白質(zhì)或酶的表達水平，從而改良纖維的品質(zhì)；二是從其他物種中選擇有潛力的目的基因，將其導(dǎo)入棉花，以提高纖維的品質(zhì)。由于棉花纖維生長發(fā)育的分子機理仍然很不清楚，尚未克隆到與棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)直接相關(guān)的目的基因。因此，通過在棉花纖維中表達合適的外源基因，是目前通過基因工程改良棉花纖維產(chǎn)量和品質(zhì)的主要途徑(JohnandKeller,ProcNatlAcadSciUSA.1996，93:12768-12773)。棉花纖維強度是對紗線質(zhì)量及其制成品特性影響較大的性狀，我國生產(chǎn)的原棉纖維品質(zhì)差的重要原因就是纖維強度偏低。因此，纖維強度的改良是提高我國原棉品質(zhì)的主攻方向。有"生物鋼"之美譽的蜘蛛牽引絲是由蜘蛛主壺腹腺產(chǎn)生的以纖維狀蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的微纖絲，它將高張強度和高彈性奇妙地結(jié)合于一身，是自然界力學(xué)性能最優(yōu)良的天然蛋白質(zhì)纖維(0saki,IntJBiolMacromol,1999,24:283-287)。在眾多的蜘蛛絲中，蜘蛛的牽引絲(spiderdragline)尤其令人注目，它在強度、彈性、斷裂能等物理性能上比尼龍-6、凱夫拉II(KevlarII，用來制造防彈衣的材料)都要高出許多(Goslineetal.，JExpBiol.1999，23:3295-3303)。因此，蜘蛛牽引絲在紡織、醫(yī)療、軍事、航天、航海、建筑等領(lǐng)域具有及其廣泛的應(yīng)用前景。蛋白質(zhì)氨基酸序列分析揭示出牽引絲至少存在兩種高度重復(fù)的蛋白組分，每種蛋白的重復(fù)單元都顯示出富含丙氨酸區(qū)域和富含甘氨酸區(qū)域交替的模塊結(jié)構(gòu)特征。富含丙氨酸區(qū)域主要折疊成e-sheet,進而可聚合成微晶體，賦予牽引絲高強度；而富含甘氨酸區(qū)域的GPGXX基序可形成e-turn，串聯(lián)的e-turn又進一步形成了e-spiral結(jié)構(gòu)，這種彈簧樣的螺旋結(jié)構(gòu)可能賦予牽引絲以彈性(Beeketal，PNAS，2002，99:10266-10271)。牽引絲至少就是以這樣兩種蛋白質(zhì)組分[蜘蛛絲蛋白I(SpidroinI，MaSP-I)和蜘蛛絲蛋白II(SpidroinII，MaSP-II)]為核心形成的一種具有等級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)纖維，兩者的結(jié)合構(gòu)成了纖維所具有的獨特性能。牽引絲的部分cDNA已被克隆和鑒定，和許多纖維蛋白一樣，拖絲的2種蛋白質(zhì)中都含有高度重復(fù)的結(jié)構(gòu)單元，MaSP-I的重復(fù)單元含有2個e片層和l個a螺旋結(jié)構(gòu)，而MaSP-II含有1個P片層和2個P轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(XuandLewis,ProcNatlAcadSciUSA.1990，87:7120-7124)。目前，利用克隆或合成的蛛絲蛋白基因不僅能夠在大腸桿菌(Princeetal.，Biochem.1995，(34):10879-10885)和酵母(FahnestockandBedzyk，ApplMicrobiolBiotech.1997，47:33-39)中表達，而且能夠在動物細胞系(Lazarisetal.，Science.2002,295(5554):472-476)、煙草和馬鈴薯(Schelleretal.，NatBiotech.2001,19:573-577)以及擬南芥(Yangetal.，TransgenicResearch2005，14:313-324)中表達。盡管這些研究都是為了生產(chǎn)蛛絲蛋白，而不是為了改變轉(zhuǎn)基因生物的特定性狀，但這些研究為蛛絲蛋白在其它生物中的高效表達奠定了基礎(chǔ)。其中，微生物和動物細胞中蜘蛛牽引絲蛋白的表達與分子量呈負相關(guān)，而以植物作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)牽引絲蛋白，不僅相對廉價、易于規(guī)模化，且轉(zhuǎn)基因植株能高效而穩(wěn)定地表達牽引絲蛋白，即使表達高分子量牽引絲蛋白時，所表達蛋白的加工定位、熱穩(wěn)定性、表達量以及一致性均未受影響(Schelleretal.，NatBiotech.2001,19:573-577)，這表明植物是適合用來表達牽引絲蛋白的生物反應(yīng)器。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法是雙子葉植物最理想的轉(zhuǎn)化方法，目前獲得的轉(zhuǎn)化成功事例中80%是采用此系統(tǒng)。與其他基因轉(zhuǎn)化方法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有許多優(yōu)點轉(zhuǎn)化成功率高，效果好；轉(zhuǎn)化的外源基因多數(shù)為單拷貝，遺傳穩(wěn)定性好，有利于轉(zhuǎn)基因后代的純合選育；轉(zhuǎn)化機理研究得較為清楚，方法最成熟，操作簡單、實驗設(shè)備便宜等等。這些優(yōu)點使其成為棉花遺傳轉(zhuǎn)化的首選轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。文獻顯示大多數(shù)的棉花轉(zhuǎn)化試驗采用此系統(tǒng)。利用基因工程等生物技術(shù)來改良棉花纖維品質(zhì)特性已成為棉花纖維品質(zhì)育種的一個重要途徑(John和Keller,ProcNatlAcadSciUSA.1996,93:12768-12773)。目前在轉(zhuǎn)基因植物的研究中，外源基因在染色體上的整合是隨機的，還做不到定點整合。外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中整合的拷貝數(shù)可以是單拷貝，也可以是多拷貝，或多拷貝整合(包括同一位點的正向串連重復(fù)或反向重復(fù)，或不同染色體上的多拷貝整合)。但不管整合的方式如何，只要能得到整合，就完成了外源基因?qū)χ参锏挠行мD(zhuǎn)化。棉花E6啟動子主要在棉花開花后5-28d的纖維中表達(JohnandCrow，ProcNatlAcadSciUSA.1992,89:5769-5773)，這一時期是初生壁形成期和次生壁合成期，此時E6啟動子指導(dǎo)外源基因在這一時期表達(John和Keller,ProcNatlAcadSciUSA.1996，93:12768-12773)。如果外源基因產(chǎn)物能對棉花纖維的品質(zhì)有改良作用，那么在這一時期的高表達將會對棉花纖維的質(zhì)量產(chǎn)生影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白，該蛋白是根據(jù)棉花的密碼子偏好優(yōu)化了的蛛絲蛋白，該蛋白可以提高棉花的纖維品質(zhì)。本發(fā)明所提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2自氨基末端第1至793位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2自氨基末端第1至793位氨基酸殘基所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。上述蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述蛋白的編碼基因可為如下l)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端第1至2379位核苷酸所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與l)限定的DNA序列具有9(W以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。含有上述任一所述基因的重組表達載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。其中，所述重組表達載體可以是通過將序列表中序列1自5'末端第1至2379位核苷酸所示的DNA序列插入表達載體pPZPlll的多克隆位點得到的。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育纖維品質(zhì)得到提高或改良的棉花的方法。本發(fā)明所提供的培育纖維品質(zhì)提高的棉花的方法，是將上述任一種重組表達載體導(dǎo)入棉花細胞中，培育得到纖維品質(zhì)提高的棉花。其中，所述纖維品質(zhì)具體可以為纖維強度。本發(fā)明按照棉花密碼子偏愛性規(guī)律，根據(jù)發(fā)表的蛛絲蛋白基因ife57^/和ife573-T7的序列特征，合成了蛛絲蛋白S/Y/7基因，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將棉纖維特異性啟動子E6驅(qū)動的優(yōu)化了的蛛絲蛋白基因?qū)腙懙孛藜矫?4基因組中，使其在棉花中特異表達。實驗表明，轉(zhuǎn)入本發(fā)明優(yōu)化蛋白編碼基因的棉花T。代單拷貝株系纖維斷裂比強度分別比兩個未轉(zhuǎn)化的陰性對照棉花提高了12.18%和9.75%，T2代非純合株系的纖維強度比未轉(zhuǎn)化的棉花提高了7.12—13.69%;純合株系CTC-H8的棉花纖維強度比未轉(zhuǎn)化的棉花提高了11.06%，相對結(jié)晶度提高了15.37%。與未轉(zhuǎn)化的棉花相比，轉(zhuǎn)基因后代棉花纖維強度得到了顯著提高，而且轉(zhuǎn)基因纖維強度的增加與相對結(jié)晶度的增加具有較好的一致性。因此，本發(fā)明首次使蛛絲蛋白在棉花中表達，并且提高了棉花纖維的強度，改善了棉花纖維的品質(zhì)，為棉花優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)和改良棉花纖維品質(zhì)的育種提供了新的種質(zhì)材料。因此，本發(fā)明具有重要的經(jīng)濟應(yīng)用價值。圖1為重組載體pPZPlll-E6-20SPI-II-CSP-6HIS-Tnos的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為轉(zhuǎn)入蛛絲蛋白基因的棉花植株再生的過程。圖3為部分轉(zhuǎn)5PJJ/基因的T。植株P(guān)CR檢測結(jié)果。圖4為部分轉(zhuǎn)57YJ/基因T。植株Southern雜交分析結(jié)果。圖5為重組蛛絲蛋白5SPIII的表達。圖6為重組蛛絲蛋白5SPIII的純化。圖7為5SPIII抗血清效價測定。圖8為不同轉(zhuǎn)基因株系與野生型的RT-PCR和Westernblot結(jié)果。圖9為轉(zhuǎn)5^///基因的T。代棉花纖維與對照纖維長度比較。圖10為轉(zhuǎn)5F丄/T基因的棉花純合株系CTC-H8的RT-PCR和Westernblot分析。圖11為轉(zhuǎn)5P/7/基因的棉花純合株系與對照纖維長度比較。圖12為轉(zhuǎn)57Y/7基因棉花純合株系和對照纖維素的紅外光譜圖。圖13為轉(zhuǎn)5"尸///基因棉花純合株系和對照的免疫電鏡結(jié)果。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。(一)實驗中用到的培養(yǎng)基的組成如下(1)LB培養(yǎng)基1%胰化蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%NaCl,pH7.0，固體培養(yǎng)基加1.5%普通瓊脂。(2)YEP培養(yǎng)基1%胰化蛋白胨，1%酵母提取物，0.5%NaCl。固體培養(yǎng)基加1.5%普通瓊脂。(3)棉花組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基:<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>胚性愈傷篩選培養(yǎng)基MSB(l/2NH4+)+KN031.9g/L+IBA0.5mg/L+KT0.25mg/L+Glucose30g/L+Gelrite2.5g/L+Cef200mg/L+Kan50mg/LpH5.8液體懸浮培養(yǎng)基MSB(l/2NH4+)+KN031.9g/L+KT0.1mg/L+Glucose15g/L+Sugar10g/L+Cef200mg/L+Kan50mg/LpH5.8體胚成熟培養(yǎng)基MSB(l/2NH4+)+KN031.9g/L+KT0.1mg/L+Glucose15g/L+Sugar10g/L+Gelrite2.5g/L+Cef200mg/L+Kan50mg/LpH5.8體胚伸長培養(yǎng)基MSB(l/2NH4+)+KN031.9g/L+Glucose15g/L+Sugar10g/L+Gelrite2.5g/L+Cef200mg/L+Kan50mg/LpH5.8成苗培養(yǎng)基SHSH+Sugar20g/L+Gelrite2.8g/L+Ac0.5g/LpH6.4MS:Murashige&Skoog，1962,PhysiolPlant15:473—479.;B5:GatnborgExperimentalCellResearch,1968，50(1):151-158;Gelrite:Sigma,StLouis,M0，USA;SH:Schenk&Hildebrandt，Can.J.Bot.1972,50,1999-2004。(二)主要溶液配方1、Southern檢測DNA提取緩沖液:100慮Tris-HCl(pH8.0)，20mMEDTA(p朋.0)，1.5MNaCl，2%CTAB，4°/?？扇芫垡蚁┻量┷?PVP)和2%e-巰基乙醇(日-ME)使用前加入。TE:10mMTris-HClpH8.0，lmMEDTA。1XTAE電泳緩沖液:40mMTris-乙酸，lmMEDTA。Southern轉(zhuǎn)膜變性液0.4MNaOH，l.OMNaCl。Southern轉(zhuǎn)膜中和液:0.5MTris-CI(PH7.2)，l.OMNaCl。20XSSC:3MNaCl，0.3M擰檬酸鈉。50XDenhardt's:1%聚糖體400(Ficoll400)，1%PVP，1%牛血清蛋白(BSA)。預(yù)雜交液6XSSC，0.5%SDS，5XDenhardt,0.1mg/ml鮭精DNA。洗膜液I:2XSSC，0.1%SDS。洗膜液II:0.5XSSC，0.1%SDS。洗膜液III:0,1XSSC,0.1%SDS。顯影液0.22%米吐爾，0.88%對苯二酚，0.4%溴化鉀，7.2%無水亞硫酸鈉，4.8%無水碳酸鈉，按順序加入溶解。停影液0.3°/。冰醋酸。定影液24%硫代硫酸鈉，1.5%無水亞硫酸鈉，1.34%冰醋酸，1.5%鋁鉀粉，按順序加入溶解。2、Western檢測中所使用的溶液(1)蛋白提取液100raMTris-HClpH8.65，2%SDS，30%sucrose和2%P-ME使用前加入。(2)蛋白質(zhì)印跡免疫分析緩沖液、試劑A液丙烯酰胺儲存液丙烯酰胺87.6g，亞甲雙丙烯酰胺2.4g，加無菌水至300ml，過濾后儲于棕色瓶，4'C避光保存。B液:分離膠緩沖液1.5mol/LTris-HCl(pH8.8):Tris堿18.15g，加滅菌水60ml，用lmol/LHCl調(diào)pH8.8，定容至100ml。過濾后4。C保存。C液:濃縮膠緩沖液O.5mol/LTris-HC1(pH6.8):Tris堿6.0g，加滅菌水60ml，用1mol/LHCL調(diào)pH6.8，定容至100ml。過濾后4。C保存。(注B和C這兩種緩沖液必須使用Tris堿制備，再用HCl調(diào)節(jié)pH值，而不用Tris.Cl。)D液10%(w/v)SDS:十二垸基硫酸鈉IOg，加滅菌水100ml，室溫保存。TEMED原溶液N，N，N，N'四甲基乙二胺催化過硫酸銨形成自由基而加速兩種丙稀酰胺的聚合。過硫酸銨溶液(APS):10%(w/v)，去離子水臨用前配制。上樣緩沖液5X80ml:0.5mol/LTris緩沖液(pH6.8)10ml，甘油8ml，10%SDS16ml，巰基乙醇4ml，0.05%(w/v)溴酚藍2ml，滅菌水40ml。Tris-甘氨酸電泳緩沖液5X500ml:Tris堿7.5g，甘氨酸36g，SDS2.5g，用蒸餾水溶解至500ml。臨用前稀釋5倍。轉(zhuǎn)移緩沖母液(不含甲醇)10X500ml:Tris堿15.15g，甘氨酸72g，用蒸餾水溶解后定容至500ml(自然pH)。4'C保存，臨用前稀釋10倍。轉(zhuǎn)移緩沖液(25mmol/LTris，192mmol/L甘氨酸，20%甲醇)IX1000ml:轉(zhuǎn)移緩沖母液(10X)，100ml;無水甲醇200ml;用蒸餾水定容至1000ml，4'C保存。TBS緩沖液(20畫1/LTris-HC1(pH7.5)，500醒ol/LNaCl)0.5mol/LTris-HCl(pH7.5)，40ml;NaCl:8.18g;用蒸餾水溶解后定容至1000ml。封閉緩沖液TBS緩沖液IOOml，脫脂奶粉5g。一抗雜交液TBS緩沖液20ml,第一抗體2.5ul。二抗雜交液TBS緩沖液20ml，第二抗體1.0yl。TTBS緩沖液TBS緩沖液500ml，Tween20250ul。3、免疫電鏡檢測中所使用的溶液電鏡樣品固定液4%多聚甲醛+0.5%戊二醛(pH7.2，0.1MPBS的配制);封閉液(BL):1%BSA(pH7.2，0.1M的PBS配制);一抗含0.05%Tween20的BL稀釋(1:50)抗體(對照用正常的相應(yīng)動物血清代替)；二抗含O.05%Tween20的BL稀釋(1:40)膠體金標(biāo)記羊抗兔IgG(10nm，北京三博遠志生物技術(shù)有限責(zé)任公司)實施例1、轉(zhuǎn)入優(yōu)化的蛛絲蛋白編碼基因S/YJ/的棉花植株的構(gòu)建與驗證一、優(yōu)化蛛絲蛋白及其編碼基因的構(gòu)建1、優(yōu)化的蛛絲蛋白編碼基因的重復(fù)區(qū)域(57Y-//)的構(gòu)建(1)根據(jù)發(fā)表的蛛絲蛋白基因的序列特征和棉花所偏愛的密碼字，設(shè)計合成了四條寡核苷酸(由上海生物工程有限公司合成)SP1(80nt):AGATCTCAAGGTGCTGGAAGAGGTGGGTTGGGTGGACAGGGCGCAGGTGCAGCTGC-CGCTGCTGCAGCTGAAGGTGCTGG;SP2(49nt):GGATCCAAGCCCACCATAGCCACCCTGTCCAGCACCTCCAGCTGCAGCA;SP3(80nt):AGATCTGCTGCAGCTGCAGCCGCTGCAGCTGGTCCTGGAGGTTACGGACCAGGTCA-GCAAGGACCTGGTGGATATGGTCC;SP4(59nt):GGATCCAGGACCTGAAGGACCTTGCTGTCCTGGACCATATCCACCAGGTCCTTGCT-GAC。(2)上述SP1和SP2，SP3和SP4寡核苷酸分別經(jīng)72'C退火、ExTaq(Takara)延伸，得到的兩條片斷兩端引入了II(AGATCT)和vfeMlI(GGATCC)酶切位點。將這兩條片段分別連接到pGEM-T-vector(Promega公司)的II和及^I位點間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5d菌株，按照常規(guī)方法篩選陽性克隆，鑒定質(zhì)粒及插入片段，最終獲得了分別含有單拷貝重組蛛絲蛋白基因重復(fù)單位(SPI或SPII)的重組質(zhì)粒，分別記作pGEM-1SPI和pGEM-lSPII。(3)利用％HI和5"scl分別雙酶切pGEM-lSPI和pGEM-lSPII，回收小片段，記作1SPI和1SPII;另一組用&WI和5"acI雙酶切，回收大片段，用DNA連接酶分別將獲得的兩種小片段與大片段連接，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌菌株，篩選陽性克隆，提取其中的陽性質(zhì)粒，將獲得的含有雙拷貝蛛絲蛋白基因的重復(fù)單位的重組質(zhì)粒分別記作PGEM-2SPI和pGEM-2SPI1。(4)利用^s/fil和5"acl兩種限制性內(nèi)切酶雙切pGEM-2SPI1,將切下的大片段和(3)中獲得的1SPII片段連接，再轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌菌株，篩選陽性克隆，鑒定質(zhì)粒及插入片段，獲得了含有3個拷貝的重組蛛絲蛋白基因的重復(fù)單位(SPII)的重組質(zhì)粒，記作pGEM-3SPI1。(5)利用5s/zHI酶切pGEM-2SPI，形成開環(huán)，用堿性磷酸酶處理，去磷酸基團；用5sfl和《§711雙酶切pGEM-3SPI1，獲得約0.3kb的片段。將獲得的兩種片段連接，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌菌株，篩選陽性克隆，鑒定質(zhì)粒及插入片段，獲得了含有雜合5個拷貝的蛛絲蛋白基因重復(fù)單位(SPI及SPII)的重組質(zhì)粒，記作pGEM-5SPI-II;(6)利用5^11和5"scl雙酶切pGEM-5SPI-II的小片段與和5"acl雙酶切pGEM-5SPI-II的大片段相連，獲得pGEM-lOSPI-II。同樣，利用和5"acl雙切pGEM-lOSPI-II小片段與用5aMH和5"scl雙酶切pGEM-10SPI-II的大片段相連，最終獲得了含有SPI和SPII雜合的20個拷貝的重組蛛絲蛋白基因重復(fù)單位的質(zhì)粒，記作pGEM-20SPI-I1。2、重組蛛絲蛋白編碼基因的非重復(fù)區(qū)域(CSP)的構(gòu)建根據(jù)發(fā)表的蛛絲蛋白MaSPII羧基端(C-末端)氨基酸序列，按照棉花密碼子偏愛性規(guī)律，設(shè)計并構(gòu)建了重組蛛絲蛋白編碼基因的非重復(fù)區(qū)域(CSP)，其核苷酸序列如序列表中序列1自5'末端第2086至2379位核苷酸所示。具體做法如下(1)根據(jù)這段序列特征設(shè)計了4條寡核苷酸(由上海生物工程有限公司合成)，序列如下CSP-P1(88nt):AGATCTCGTCTTGCTTCTCCTGATTCAGGAGCTAGAGTTGCATCAGCTGT-TTCTAACCTTGTATCCAGTGGTCCAACATCATCTGCTG;CSP-P2(87nt):TCTAGAAAGACCAGGATTAGATGCACCAATCTGAGACACAGCGTTAGAAA-TAACAGATGAGAGTGCAGCAGATGATGTTGGACCACT;9CSP-P3(85nt):TCTAGATGTGATGTTCTTATTCAGGCTCTTCTCGAAATCGTTTCTGCTTG-CGTTACAATTCTTTCTTCATCCAGCATTGGTCAGG;CSP-P4(89nt):GGATCCGAATGCACTCAAAACGGATTGCCCGACAACTTGGGCAAACTGTG-AGGCCGCTCCATAATTAACCTGACCAATGCTGGATGAAG(2)上述CSP-P1與CSP-P2，CSP-P3與CSP-P4寡核苷酸經(jīng)94。C變性、72。C退火，ExTaq(Takara)延伸，得到的產(chǎn)物分別連接到pGEM-T-vector(Promega)上，轉(zhuǎn)化DH5a大腸桿菌菌株，篩選陽性克隆，鑒定質(zhì)粒及插入片段，最終分別獲得了含有不同CSP片段的質(zhì)粒，其中由CSP-P1與CSP-P2寡核苷酸的配對及延伸所得片段插入的質(zhì)粒記作pGEM-CSP1，而CSP-P3與CSP-P4寡核苷酸的配對及延伸所得片段插入的質(zhì)粒記作pGEM-CSP2。(3)利用SWII與雙酶切pGEM-CSP1、必al與雙酶切pGEM-CSP2鑒定插入片段的大小與方向；用^711與J6al雙酶切pGEM-CSPl、J6al與及mHI雙酶切pGEM-CSP2驗證其插入片段的正確性。(4)利用Z6al與雙酶切pGEM-CSP1與pGEM-CSP2，其中pGEM-CSPl回收載體大片段，pGEM-CSP2回收約170bp小片段，將大片段與小片段相連，連接產(chǎn)物記作pGEM-CSP，《wii與^aMn酶切驗證其正確性，并送生工測序鑒定其正確性。最終獲得了含有設(shè)計長度的單拷貝的蛛絲蛋白基因非重復(fù)序列(CSP)的質(zhì)粒，記作pGEM-CSP。3、完整的重組蛛絲蛋白編碼基因的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶fe/dn和&cI雙酶切pGEM-20SPI-II，回收大片段(57Y-JT)，將其與用5WI1和feci雙酶切pGEM-CSP切下的CSP片段相連，獲得pGEM-20SPI-II-CSP(20SPI-II+CSP)并進行酶切和測序驗證。其中，優(yōu)化的、完整的重組蛛絲蛋白編碼基因的核苷酸序列如序列表中序列1自5'末端第1至2379位核苷酸所示，編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列2自氨基末端末端第1至793位氨基酸殘基所示。該基因命名為重組蛛絲蛋白編碼基因6P/了J，相應(yīng)蛋白質(zhì)命名為重組蛛絲蛋白SPIII。二、含有重組蛛絲蛋白編碼基因57Y/J的重組表達載體的構(gòu)建1、棉花纖維特異表達啟動子E6的克隆棉花E6基因是在纖維伸長發(fā)育過程中高豐度表達的基因，其啟動子是棉纖維特異性啟動子，并且在轉(zhuǎn)聚羥基丁酸(PHB)合成酶基因棉花的研究中得到成功應(yīng)用(JohnME,KellerG.ProcNatlAcadSciUSA.1996,93:12768-12773)。本實驗室根據(jù)已發(fā)表的海島棉的E6啟動子的序列，合成引物(E6-1:5'-AAGCTTAAATTATAGCATACCTCACGATGT-3'和E6-2:5'-GGATCCCATGGCTATGGTTGCTAA-TGCT-3'),并按常規(guī)PCR方法，從中國棉花栽培品種中棉所12中擴增出E6基因的啟動子序列(約600bp)，并在其兩端引入了HindIII和BamHI酶切位點，將PCR產(chǎn)物連接到pGEM-T-vector(Promega公司)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒進行鑒定，獲得的重組質(zhì)粒記作pGEM-E6。2、來源于雙元載體pBI121的終止子Tnos的分離Tnos是轉(zhuǎn)基因植物常用的終止子。利用Sacl和EcoRI兩個限制酶從本領(lǐng)域熟知的通用雙元載體pBI121切下Tnos終止子，并按照常規(guī)方法連接到pUC18上，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒并進行鑒定，獲得了含有Tnos序列(276bp)的重組質(zhì)粒，記作pUC-Tnos。3、含有E6啟動子、5TYJ/基因以及Tnos終止子的表達盒的構(gòu)建按照本領(lǐng)域熟知的通用方法，用HindIII和BamHI兩個限制酶酶切pGEM-E6，將切下的E6啟動子片段連接到載體pUC18的Hindm和BamHI位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒并進行鑒定，最終獲得了含有E6啟動子片段的重組質(zhì)粒，并記作pUC-E6。利用BamHI和SacI兩個限制性內(nèi)切酶雙切pUC-E6，回收大片段；再用5g丑I和feci兩種限制性內(nèi)切酶雙切pGEM-20SPI-II-CSP,回收約2.4kb的重組蛛絲蛋白基因片段(20SPI-II-CSP)。然后按通用方法將回收到的兩個片段連接起來，并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒并進行雙酶切鑒定，獲得了含有E6啟動子和重組蛛絲蛋白基因片段(20SPI-II-CSP)表達盒的重組質(zhì)粒，記作pUC-E6-20SPI-II-CSP。常規(guī)方法將Tnos終止子連接到pUC-E6-20SPI-II-CSP質(zhì)粒上的CSP區(qū)域的3'端。在連接前先采用PCR技術(shù)在Tnos的5，加上編碼6組氨酸標(biāo)簽的核苷酸序列，并在其5'上游引入了^M1I(GGATCC)酶切位點。具體是合成兩條引物(HT-1:5'-GGATCCCATCACCATCATCATCACTGAGAGCTCGAATTTCCCCG-3'和HT-2:5'-GAATTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3')，并按常規(guī)PCR方法，對Tnos片段進行PCR擴增，獲得含有6個組氨酸編碼序列和Tnos序列的片段(約300bp)，并在其兩端引入了BamHI和EcoRI酶切位點，連接到pUC18載體的BamHI和EcoRI的位點，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒并進行鑒定，獲得了正確的重組質(zhì)粒，記作pUC-6HIS-Tnos。接著采用BamHI和EcoRI兩種限制性內(nèi)切酶分別雙酶切pUC-E6-20SPI-II-CSP和pUC-6HIS-Tnos，回收pUOE6-20SPI-II-CSP的大片段以及從pUC-6HIS-Tnos上切出的6HIS-Tnos小片段，然后將這兩個片段連接起來，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒并進行鑒定，獲得的陽性重組質(zhì)粒記作pUC-E6-20SPI-II-CSP-6HIS-Tnos，該質(zhì)粒含有本實驗所需的完整的重組蛛絲蛋白編碼基因5P丄r/表達盒。4、重組蛛絲蛋白編碼基因57)///轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶歷/dl1與fcoRI雙酶切pUC-E6-20SPI-II-CSP-6HIS-Tnos，獲得約3.3kb片段；另外用歷'/wTII和fcoRI雙酶切開pPZP111，回收大片段與前者相連，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5a，獲得的克隆含有優(yōu)化的重組蛛絲蛋白基因表達盒的轉(zhuǎn)化載體，記作pPZP-E6-20SPI-II-CSP-6HIS-Tnos，并具有卡那霉素抗性。載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。三、重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建農(nóng)桿菌選用根癌農(nóng)桿菌(HroZa"arz'"歷t"歷e/acie/s)菌株AGL1。所用質(zhì)粒為pPZP-E6-20SPI-II-CSP-6HIS-Tnos，具有卡那霉素抗性。將載體pPZP-E6-20SPI-II-CSP-6HIS-Tnos導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL1:通過電擊轉(zhuǎn)化法將載體pPZP-E6-20SPI-II-CSP-6HIS-Tnos導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL1中。利用卡那霉素抗性篩選得到含有載體pPZP-E6-20SPI-II-CSP-6HIS-Tnos的重組農(nóng)桿菌，命名為重組農(nóng)桿菌AGL1/pPZP-E6-20SPI-II-CSP-6HIS-Tnos。四、棉花的遺傳轉(zhuǎn)化棉花轉(zhuǎn)化受體材料為陸地棉(6b^j77i娜/w'rwt鵬L.)冀棉14號。該品種同時用作嫁接轉(zhuǎn)基因苗的砧木。(一)棉花無菌苗及胚性愈傷組織的獲得棉花種子剝殼后用0.1%升汞(HgCl2)滅菌8-10min，無菌水沖洗5-6次后放在搖床上振蕩培養(yǎng)(110rpm)，待種子露白時接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，2S。C、黑暗條件下萌發(fā)5-7d，以獲得無菌棉花幼苗。選取生長健壯的無菌幼苗下胚軸，切成約0.5cni的小段備用。(二)重組菌的培養(yǎng)及接種菌液的制備將上述篩選得到的攜帶有重組蛛絲蛋白基因的植物表達載體的重組農(nóng)桿菌AGL1/pPZP-E6-20SPI-II-CSP-6HI-Tnos在含50mg/LKm和25mg/LCarb的YEP固體培養(yǎng)基上活化。挑農(nóng)桿菌單菌落接種于5ml含相同抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28°C、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。第二天按1:20的比例轉(zhuǎn)接到25ml含相同抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)3-5h，6000rpm離心2min后，菌體用液體MSB(含100uMAcetosyringene)培養(yǎng)基重懸，調(diào)整OD,值約為0.5備用。(三)浸染和共培養(yǎng)將切好的下胚軸放入調(diào)整好濃度的農(nóng)桿菌菌液中浸染10min，傾去菌液，用無菌吸水紙吸去下胚軸表面多余的菌液，接種移到共培養(yǎng)基上，于黑暗條件下24'C共培養(yǎng)2d。(四)轉(zhuǎn)化子的篩選共培養(yǎng)2d后將下胚軸轉(zhuǎn)移到愈傷篩選培養(yǎng)基上，進行脫菌和選擇培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為27±2°C、16h光照(2000Lx)。每3-4周繼代一次。1-2個月后，一些下胚軸表現(xiàn)出對卡那霉素抗性，兩端切口逐漸膨大(圖2A，B)，生長出抗性愈傷組織(圖2C，D)。選取松散的愈傷組織轉(zhuǎn)接到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每2-3周繼代一次。1-2個月即可生成胚性愈傷組織(圖2E)。挑選生長緩慢、疏松、淡黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織塊接入液體懸浮培養(yǎng)基中，在搖床上120rpm振蕩懸浮培養(yǎng)以獲得大量體胚(圖2F，G)。2周后用30目篩網(wǎng)過濾懸浮培養(yǎng)物，網(wǎng)下沉淀物轉(zhuǎn)接入體胚成熟培養(yǎng)基上培養(yǎng)。3-4周后，將萌發(fā)的成熟胚轉(zhuǎn)入體胚伸長誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，誘導(dǎo)體胚伸長、萌發(fā)(圖2H，I,J)。4-6周后，將長度大于0.5cm的萌發(fā)胚轉(zhuǎn)接到成苗培養(yǎng)基SH上培養(yǎng)，長出子葉及真葉后成為再生苗(圖2K，L)。待幼苗長到約3cm高(圖2L)時，即可移栽(圖2M)或嫁接(圖2N)，轉(zhuǎn)入花盆中栽培并作進一步的分子檢測，得到的檢測結(jié)果為陽性的、具有卡那抗性再生苗即為T。代轉(zhuǎn)化苗。(五)移栽和嫁接A移栽選擇生長健壯、根系生長良好的再生植株用于移植。具體方法將生根的植株在室溫下鍛煉l周，然后將根部的培養(yǎng)基洗凈，室溫下保濕，生成新根后移栽到營養(yǎng)缽中，用塑料膜將植株遮住保濕，置溫室內(nèi)培養(yǎng)l周后逐漸放風(fēng)取掉塑料膜。待長出新葉后移栽到大花盆中生長。B嫁接轉(zhuǎn)基因再生棉花一般都采用帶根移栽法，并要求再生棉株茁壯、根系發(fā)達。由于移栽棉花的緩苗期最少需要l個半月，再加上許多再生苗生長較弱，根系不發(fā)達或沒有根系，因此，使轉(zhuǎn)基因再生棉株的成活率成了棉花遺傳轉(zhuǎn)化中的一大難題。若采用嫁接法可以很好地解決這個問題。具體方法在土盆里先種植砧木棉花苗，待砧木苗長出4-6片真葉時，去掉頂尖，留下展開的葉片3-5片，先用手術(shù)刀片在莖中間劈開約2cm長的小口，再將轉(zhuǎn)基因棉株去掉根部，在莖稈兩邊用解剖刀削成楔型(長度1.7-1.8cm)，貝占在砧木苗上，用Parafilm把嫁接口全部纏實，然后用塑料膜把嫁接棉花全株封閉，10d后逐漸放風(fēng)取掉塑料膜即可。嫁接苗成活后移栽到大花盆中生長。五、T。代轉(zhuǎn)基因棉花植株的分子生物學(xué)檢測(一)PCR檢測利用重組蛛絲蛋白基因非重復(fù)區(qū)(CSP，約300bp)設(shè)計引物，引物序列如下CSP1:GATTCAGGAGCTAGAGTTGCATCAGC;CSP2:CCGACAACTTGGGCAAACTGTGAGG。隨機選取對Kan呈抗性反應(yīng)的陽性植株幼嫩葉片，提取DNA。以提取的基因組DNA為模板，用上述引物CSP1/CSP2進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為10XPCRbuffer2.5^1(含25mMMgCh)，d,(2.5mM)0.25^1，引物(10pmol/VL)各0.5^1，模板DNAO.5^1，Tag酶(5U/pL)0.25nl，加ddH20至總體積25pi(PCR試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品)。PCR反應(yīng)程序為94。C預(yù)變性5min后，94°C30s，60°C30s，72°C30s進行30個循環(huán)，72。C延伸10min。以未成功轉(zhuǎn)化棉花植株的基因組DNA為陰性對照，以含有重組蛛絲蛋白基因的質(zhì)粒pPZP-E6-20SPI-II-CSP-6HIS-Tnos為陽性對照。結(jié)果如圖3所示。泳道l為Marker(DL2000)，泳道2為陽性對照，泳道3-12為轉(zhuǎn)S尸i7/基因T。植株，泳道13為未成功轉(zhuǎn)化的冀棉14，泳道14為中棉35野生型。轉(zhuǎn)基因植株都擴增出了一條與陽性對照一致的帶，片段大小與重組蛛絲蛋白基因中設(shè)計的非重復(fù)序列CSP大小相似，而未成功轉(zhuǎn)化的對照植株中則沒有擴增出特異性條帶。初步確定蛛絲蛋白基因5"尸///已經(jīng)整合進棉花植株基因組中。(二)Southern雜交對PCR檢測呈陽性的棉花幼苗進一步進行Southern雜交鑒定。以未進行轉(zhuǎn)化的陸地棉冀棉14號植株和中棉35植株為陰性對照，以重組蛛絲蛋白基因的非重復(fù)序列CSP(即上述PCR檢測中獲得的重組蛛絲蛋白基因非重復(fù)區(qū)(CSP)PCR產(chǎn)物)作陽性對照。雜交所用探針也為從上述PCR檢測中獲得的重組蛛絲蛋白基因非重復(fù)區(qū)(CSP)PCR產(chǎn)物，采用TaKaRa公司的隨機引物標(biāo)記試劑盒用[a-32P]dCTP對上述DNA進行探針標(biāo)記。根據(jù)改良的CTAB法(Permingeatetal.,PlantMolBiolReptr.1998,16:1-6)對PCR檢測呈陽性的植株及陰性對照棉花植株進行總DNA的提取，然后用"rat(TaKaRa)對總DNA進行酶解并用于Southern雜交。Southern雜交步驟參考《分子克隆實驗指南》(SambrookandRussell,2001，ColdSpringHarbor)和TaKaRa試劑盒說明書進行。9個PCR檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因棉花株系的Southern雜交結(jié)果如圖4所示，其中泳道P為陽性對照,泳道0-8為不同的轉(zhuǎn)W77/基因T。植汰泳道cl和c2分別為未成功轉(zhuǎn)化的冀棉14和中棉35野生型。由圖可見所有PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因棉花植株均有陽性雜交信號，而未轉(zhuǎn)化的陸地棉冀棉14號植株和中棉35野生型均無雜交信號。特別是泳道1和4樣品有5條雜交帶，而其余泳道均顯示l條雜交帶。表明重組蛛絲蛋白基因57^//基因已成功整合到冀棉14基因組中，9個轉(zhuǎn)基因株系中，7個株系為單拷貝，2個株系為5個拷貝插入。(三)轉(zhuǎn)基因植株的RT-PCR檢測為了檢測重組蛛絲蛋白基因57Y/J在轉(zhuǎn)基因棉花纖維中的表達，對轉(zhuǎn)基因株系纖維中基因57YJ/的表達水平進行了RT-PCR分析。選取5個T。代不同轉(zhuǎn)基因棉花株系(0、1、3、4，5;其中0，3，5為單拷貝插入，l和4為5個拷貝插入)以及未進行轉(zhuǎn)化的陸地棉冀棉14號植株(陰性對照)作為目標(biāo)植株用于分析。分別取株系棉花開花當(dāng)天、開花后3、5、10、15、20、25、30d的棉花纖維(其中前3個樣品即當(dāng)天、3天和5天的樣品帶種子)樣品，采用改良的植物RNAout試劑盒(天澤基因工程有限公司，綿陽，中國)進行RNA的提取，然后進行RT-PCR分析。用于檢測57Yi7基因表達水平分析的上、下游引物分別為CSP1:GATTCAGGAGCTAGAGTTGCATCAGC;CSP2:CCGACAACTTGGGCAAACTGTGAGG。本實驗用棉花歷Wo/eJ基因(^歷's3)作內(nèi)標(biāo)(Zhuetal.，PlantPhysiol,2003,133:580-588)，根據(jù)發(fā)表序列設(shè)計的該基因的上、下游引物分別為HIS1:GAAGCCTCATCGATACCGTC和HIS2:CTACCACTACCATCATGGC。RT-PCR結(jié)果如圖8所示，其中圖A:表示不同棉花轉(zhuǎn)基因株系和野生型花后15d的纖維總RNA，圖B為M歷W基因RT-PCR的結(jié)果(29個循環(huán))，圖C為57YJ/基因RT-PCR的結(jié)果(34個循環(huán))。其中泳道1—5分別為不同棉花T。轉(zhuǎn)基因株系0、1、3、4、5，c為陰性對照)。結(jié)果表明在單拷貝株系0、3、5的轉(zhuǎn)基因棉花纖維中5F/7/基因的表達量較高，而在多拷貝株系1和4中僅有微弱的表達，而在相同時期未轉(zhuǎn)基因的野生型纖維中則沒有檢測到57Y/J基因表達。(四)轉(zhuǎn)基因植株的Westernblot檢測1、5SPI-II重組蛛絲蛋白原核表達與抗體制備(1)表達載體的構(gòu)建1)用％7II與AcI雙切pGEM-5SPI-II質(zhì)粒，并回收小片段；2)用5aMil與feci雙切pET-32a(+)質(zhì)粒，并回收大片段；3)將步驟l)與步驟2)的相應(yīng)片段進行連接，構(gòu)建成表達載體pET32-5SPI-I1。(2)重組蛋白的誘導(dǎo)表達與純化用熱激法將pET32-5SPI-II轉(zhuǎn)化到表達菌株大腸桿菌BL21中，并采用PCR與序列分析進行鑒定。用鑒定正確的菌株鋪板挑取克隆，在4ml含100mg/LAmp的LB培養(yǎng)基的螺口管中37'C培養(yǎng)8-10h，加入IPTG誘導(dǎo)，終濃度為1mM，誘導(dǎo)8h;取lml菌液，12，000Xg離心1min，棄去上清，然后加入ddH20和SDS-PAGE上樣緩沖液各100j^，沸水浴5min，12，000Xg離心3min，最后取20上清用于SDS-PAGE，檢測是否表達出目的蛋白。結(jié)果如圖5所示，泳道1為IPTG誘導(dǎo)前BL21細菌裂解總蛋白，泳道2為IPTG誘導(dǎo)后BL21細菌裂解總蛋白，而泳道M為蛋白Marker。結(jié)果表明目的蛋白的表達量較高，可以進行下一步的純化。將含有pET32-5SPI-II質(zhì)粒的陽性克隆在4ml100mg/LAmp的LB培養(yǎng)基的螺口管中37。C培養(yǎng)8-10h，然后取出2ml，分別轉(zhuǎn)接到500ml三角瓶中(100mlLB培養(yǎng)基/瓶)，37。C培養(yǎng)3-4h，待培養(yǎng)至OD,為0.6-0.8，加入IPTG誘導(dǎo)，終濃度為1.0mM，誘導(dǎo)8h;誘導(dǎo)結(jié)束后5000Xg離心25min收集菌體。將菌體重懸于50ml超聲裂解液(50mMNaH2P04，pH8.0，300mMNaCl，20mM咪唑)，加入溶菌酶至終濃度為1mg/ml，冰上放置30min。冰浴超聲裂解(功率300W，超聲3s，停3s，共100次)，4°C，12,000Xg離心20min，收集上清液。通過恒流泵將上清液緩慢泵入用裂解液平衡好的Ni-NTA層析柱中，用5-10倍體積洗滌液(50mMNaH2P04，pH8.0，1MNaCl，40raM咪唑，5mMp-巰基乙醇，0.2%Tween20，5%乙醇)洗柱，直至流出液的OD，接近于0。最后用10ml洗脫液(50mMNaH2P04，pH8.0，300mMNaCl，150mM咪唑)洗脫，每管收集1ml左右。所得洗脫液用考馬斯亮蘭試劑(考馬斯亮蘭G-250100mg溶于50ml95%乙醇，再加入120ml85%磷酸，用水稀釋至lL)檢測，合并蛋白含量較高的幾管，測定濃度后4'C保存?zhèn)溆谩＜兓Чㄟ^SDS-PAGE鑒定。結(jié)果如圖6所示，泳道1為IPTG誘導(dǎo)后BL21細菌上清液，泳道2為IPTG誘導(dǎo)后BL21細菌沉淀，泳道3為IPTG誘導(dǎo)后純化后的BL21細菌上清液，泳道4為純化后的5SPI-II蛋白。結(jié)果顯示表達產(chǎn)物5SPI-II重組蛛絲蛋白在可溶性總蛋白中所占比例約為15%。(3)多克隆抗體制備與檢測以純化重組的5SPI-II蛛絲蛋白作為抗原，與弗氏佐劑等體積混合作皮下多點注射免疫家兔，共進行六次。免疫結(jié)束后從兔頸動脈取血，8000Xg離心，上清即為抗血清。取免疫前的兔血作陰性對照。所有血清分裝成小份-2(TC凍存?？寡逍r用酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)測定，設(shè)置陰性血清對照和不加抗原的空白對照，實驗在96孔細胞培養(yǎng)板上進行。ELISA結(jié)果顯示，5SPI-II抗血清的效價超過了100，000，具有很強的免疫反應(yīng)活性(圖7)。2、轉(zhuǎn)基因株系及野生型對照總蛋白提取及測定為了檢測重組蛛絲蛋白SPIII在轉(zhuǎn)基因棉花纖維中的表達水平，對轉(zhuǎn)基因棉花植株的纖維樣品進行了Westernblot分析。與RT-PCR檢測時相同，選取5FJ/J轉(zhuǎn)基因棉花5個T。代不同轉(zhuǎn)基因株系0、1、3、4，5(其中0，3，5為單拷貝，l和4為5個拷貝插入)和未進行轉(zhuǎn)化的陸地棉冀棉14號植株進行Westernblot分析的樣品。同樣分別取上述各植株開花當(dāng)天、花后3、5、10、15、20、25、30d的棉花纖維(前3個樣品帶種子)樣品，按改良的苯酚抽提法(YuanYao，etal.Electrophoresis,2006，27:4559-4569)分別提取各樣品的總蛋白質(zhì)，并釆用Bradford法(Bradford,AnalBiochera.1976,72:248-254)測定其總蛋白含量。每個材料重復(fù)取樣三次，每個樣品重復(fù)三次。3、蛋白質(zhì)印跡免疫分析(WesternBlot)以純化的重組蛛絲蛋白(5個重復(fù))抗血清作為第一抗體，商品化的辣根過氧化物酶(冊P)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體作為第二抗體，按照《分子克隆實驗指南》(SambrookandRussell,2001)的方法進行蛋白質(zhì)的分子雜交，最后在辣根過氧化物酶的發(fā)光底物中顯現(xiàn)目標(biāo)蛋白條帶。Westernblot結(jié)果與RT-PCR類似，即在轉(zhuǎn)基因株系0、3、5的開花后15天的纖維中目標(biāo)蛋白雜交信號較強，而在多拷貝株系1和4纖維中有微弱的信號，對照中則沒有蛋白條帶出現(xiàn)(圖8D，0、1、3、4、5為不同棉花T。轉(zhuǎn)基因株系；c為陰性對照)。RT-PCR和Westernblot結(jié)果表明，外源蛛絲蛋白基因己成功地轉(zhuǎn)入冀棉14基因中，并能轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的mRNA，而多拷貝數(shù)的株系內(nèi)的表達量為何很低還需要進一步研究。(五)轉(zhuǎn)基因棉花T。代纖維品質(zhì)分析隨機抽取曬干的轉(zhuǎn)57^//基因棉花的含有種子的纖維，用針沿種子中縫將種子上的纖維分開，然后用梳子將纖維梳理平直并貼在絨布表面，用直尺測量纖維的長度，每個單株測定15個樣品，取平均數(shù)。統(tǒng)計各個株系的每個單株數(shù)據(jù)，取平均數(shù)作為株系的纖維長度。將轉(zhuǎn)基因株系棉纖維樣品及對照(不含有SPIII基因的轉(zhuǎn)化棉花植株)分單株收獲后送農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢測測試中心(安陽)，依據(jù)ASTMD5867-95《HVI900大容量纖維測試(HighVolumeInspenction,HVI)儀試驗方法》，采用HFT9000在溫度(20±2)。C，相對濕度(65±3)%的環(huán)境條件下，對上半部平均長度、整齊度指標(biāo)、比強度、伸長率、馬克隆值等5指標(biāo)進行測試。其中測T。代纖維品質(zhì)所用的對照材料為未轉(zhuǎn)化的再生苗，其它對照選用分離的不含577///轉(zhuǎn)基因植株作為陰性對照。SPIII轉(zhuǎn)基因棉花的生長狀況和冀棉14野生型的棉花沒有明顯的差異。對隨機抽取的57Y/J轉(zhuǎn)基因棉花T。代株系和對照成熟纖維的衣分和長度進行了測定，結(jié)果表明轉(zhuǎn)57Y77基因T。代株系的成熟纖維的衣分和長度與對照相比沒有明顯的差異(圖9)。除衣分和長度外，還對強度和細度等指標(biāo)進行了測定。根據(jù)農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢測測試中心(安陽)的報告，依HVI系統(tǒng)的標(biāo)準，送檢的棉花纖維各指標(biāo)測定結(jié)果見表l。表l、5"尸77/轉(zhuǎn)基因棉花T。代纖維和對照的品質(zhì)比較<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>結(jié)果表明，與纖維強度相關(guān)的兩個指標(biāo)斷裂比強度和斷裂伸長率的結(jié)果表明，無論是在相同栽培條件下還是在不同條件下，^尸///轉(zhuǎn)基因T。代單拷貝株系T。0纖維斷裂比強度分別比兩對照提高12.18%和9.75%，伸長率分別比兩對照下降了18.84%和12.5%(表1)。16而57Y/J轉(zhuǎn)基因T。代多拷貝株系T。1和T。4纖維斷裂比強度和伸長率與對照相比沒有顯著差異(表l)。根據(jù)我國棉花分級標(biāo)準，按照斷裂比強度差異將棉花分為很差、差、中等、強、很強六級(GB1103-2007)。很差級取值在24.0cN/tex及以下；差取值范圍為24.0-25.9cN/tex;中等取值范圍為26.0-28.9cN/tex;強取值范圍為29.0-30.9;很強取值范圍為31.0和以上。轉(zhuǎn)57YJ/基因T。代單拷貝株系T。0棉纖維的斷裂比強度值為30.4cN/tex，屬于在強級范圍；而對照棉纖維斷裂比強度值27.1cN/tex，屬于中等級，說明轉(zhuǎn)57Y//基因植株纖維的強度得到了提高。六、轉(zhuǎn)基因植株后代的篩選與檢測1、轉(zhuǎn)基因植株后代遺傳分析外源基因在受體棉花基因組是否能夠穩(wěn)定遺傳，最可靠的證據(jù)是對該基因在后代中的表達進行跟蹤分析。根據(jù)Southern雜交結(jié)果，本研究選擇3個單拷貝(T。代編號為0，3，5)的轉(zhuǎn)57Y/J基因的T。代自交種子種植于溫室中，釆用卡那霉素抗性試驗和PCR檢測兩種方法對L植株后代進行分子檢測和遺傳分析。方法如下1)卡那霉素篩選將收獲的T。代棉花自交種子用溫水浸泡12-24h后，單粒播于營養(yǎng)缽里，待長出2-4片真葉后，用毛筆或脫脂棉將1%的卡那霉素溶液均勻地涂抹在新展開的第一片真葉的中部，7-9d后觀察葉面處理部位的顏色變化，分別統(tǒng)計各試驗組的抗性植株和非抗性植株。2)PCR檢測在卡那霉素篩選的基礎(chǔ)上，對卡那抗性的L代轉(zhuǎn)基因植株進行PCR檢測，分別統(tǒng)計各試驗組的陽性植株和非陽性植株。采用卡那霉素篩選并結(jié)合PCR檢測，可對轉(zhuǎn)基因后代分離狀況進行監(jiān)控，可以及時淘汰掉一部分非轉(zhuǎn)化體，減少移入大田的非轉(zhuǎn)化體的數(shù)量，從而節(jié)省試驗成本和試驗空間，而且提高篩選效率。3)性狀分離根據(jù)卡那霉素和PCR檢測的結(jié)果，對L代轉(zhuǎn)基因植株進行卡方測驗，以確定重組蛛絲蛋白基因5"尸777在轉(zhuǎn)基因棉花中的遺傳是否符合孟德爾遺傳規(guī)律。結(jié)果表明，單拷貝0株系的x^0.032,單拷貝3株系的x2=0.058，根據(jù)實得的x2值與自由度為l査x2表(試驗統(tǒng)計方法，蓋鈞鎰主編，中國農(nóng)業(yè)出版社，2006)，可以看出，實得的兩者x2均小于)c2(0.05)=3.84，即實驗觀察值與理論值間的差異不顯著。因此，單拷貝0和3株系后代符合孟德爾遺傳分離規(guī)律，呈正常的3:l遺傳分離。由此可見，外源重組蛛絲蛋白基因57Y/J確實在轉(zhuǎn)基因后代中遺傳。但是，單拷貝株系5由于L代樣本少而未能完成分析(表2)。表2、轉(zhuǎn)基因植株L代的遺傳分離<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(0和3)的13個L代自交種子于大田中播種，采用卡那霉素抗性試驗和PCR檢測兩種方法確定純合株系，最后得到2株純合株系，分別命名為CTC-H8和CTC-H2，并繁殖T2代純合株系以進一步進行轉(zhuǎn)基因棉花株系的品質(zhì)分析。2、轉(zhuǎn)基因棉花植株后代的表型變化將轉(zhuǎn)6TY/J基因植株與分離得到的陰性對照植株進行隔行對比栽培，對植株的外形進行觀察取證。結(jié)果表明在株高、葉片形態(tài)、大小、色澤、葉枝、果枝的生長情況、花器官的大小和形態(tài)等方面，轉(zhuǎn)5PiT/基因棉花與對照相比沒有明顯的差異。3、外源57)///基因在純合株系棉花纖維的表達特性E6啟動子具有驅(qū)動基因在纖維中特異性表達的特征，主要在開花后5-28d的纖維中表達，開花后15-22d時表達量最高。前面我們已經(jīng)對T。代轉(zhuǎn)基因棉花植株中5TY/J基因的表達水平在RNA和蛋白質(zhì)水平上進行了測定。在獲得純合株系后我們又同樣對純合株系中外源57Y77基因的表達水平進行了測定。取純合轉(zhuǎn)基因株系CTC-H8和CTC-H2開花當(dāng)天、花后第3、5、10、15、20、25、30d的纖維(前3個樣品含有種籽)，按照上述方法分別提取總RNA和總蛋白進行RT-PCR和Westernblot分析。結(jié)果如圖IO所示，其中圖版A為棉花胚珠和纖維的不同發(fā)育時期的總RNA電泳條帶圖，圖版B為6M/'W基因的RT-PCR擴增(29循環(huán))的電泳結(jié)果，圖版C為目標(biāo)基因基因RT-PCR擴增(34循環(huán))的電泳結(jié)果，圖版D為目標(biāo)樣品的Westernblot分析結(jié)果。這些結(jié)果清楚地表明，E6啟動子所驅(qū)動的57Y/J基因在純合轉(zhuǎn)基因株系CTC-H8花后5_30d的纖維中表達，并且表達高峰集中在花后20-25d的纖維中，開花后15d和10d的表達量相對不高，在開花后5d和30d的表達量相對較低。另一方面，在純合轉(zhuǎn)基因株系CTC-H2的開花當(dāng)天和花后3d表達較強，花后5d表達較弱。至于在CTC-H2純合株系中S/Y//基因的表達與E6啟動子的驅(qū)動特征不符，最可能的原因可能是插入位點的影響，但確切的原因有待進一步研究。4、轉(zhuǎn)S尸JT/基因棉花纖維品質(zhì)的測定(1)非純合株系纖維品質(zhì)測定對57Y7/轉(zhuǎn)基因非純合L代15單株(包括2個純合株系)分別收獲棉鈴，進行衣分和纖維長度的測定。以轉(zhuǎn)化的陸地棉冀棉14號植株分離的不含5"尸///基因的植株為陰性對照。衣分測定結(jié)果表明轉(zhuǎn)5F/J/基因棉花的衣分與對照相比沒有顯著差異。而采用上述方法對隨機抽取曬干的轉(zhuǎn)5"尸///基因植株含有種子的棉花纖維，用針沿種子中縫將種子上的纖維分開，然后用梳子將纖維梳理平直并貼在絨布表面，用直尺測量纖維的長度，每個單株測定15個樣品，取平均數(shù)。統(tǒng)計各個株系的每個單株數(shù)據(jù)，取平均數(shù)作為株系的纖維長度。結(jié)果表明不同轉(zhuǎn)57YJ/基因純合株系的成熟纖維長度與對照相比也沒有明顯的差巳升。除衣分和纖維長度外，還對T2代非純合轉(zhuǎn)基因株系和對照棉花纖維的強度和細度等指標(biāo)進行了測定。根據(jù)農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢測測試中心(安陽)的報告，依HVI系統(tǒng)的標(biāo)準，送檢的棉花纖維各指標(biāo)測定結(jié)果見表3。表3、57Y/J轉(zhuǎn)基因棉花T2代纖維和對照的品質(zhì)比較18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注括號內(nèi)的數(shù)值表示測得的結(jié)果與對照相比是增加還是減少。+:增加；-:減少從表3的結(jié)果可以看出，對照以及不同轉(zhuǎn)5"尸///基因株系之間的維整齊度指數(shù)平均提高了4.41%，而纖維長度則沒有顯著差異。在相同栽培條件下，不同時間收獲棉花纖維的兩個指標(biāo)斷裂比強度和斷裂伸長率，與對照相比有明顯的不同，即轉(zhuǎn)57Y/J基因株系的纖維強度比對照提高了7.12-13.69%;而伸長率卻下降了0.99-6.67%。且這兩個指標(biāo)的變化趨勢一致，即轉(zhuǎn)5尸///基因的棉花纖維強度得到了增強，而斷裂伸長率則下降了。在此基礎(chǔ)上，大部分轉(zhuǎn)基因的棉花纖維的馬克隆值也呈現(xiàn)下降趨勢，說明轉(zhuǎn)基因棉花纖維在纖維強度增強，斷裂伸長率下降的同時，纖維的細度進一步變細，是一種較為理想的結(jié)果。根據(jù)我國棉花分級標(biāo)準，按照斷裂比強度差異將棉花分為很差、差、中等、強、很強六級(GB1103-2007)。很差級取值在24.0cN/tex和以下；差級取值范圍為24.0-25.9cN/tex;中等取值范圍為26.0-28.9cN/tex;強取值范圍為29.0-30.9;很強取值范圍為31.0以上。轉(zhuǎn)基因棉纖維的斷裂比強度值主要在31.0-34.46cN/tex之間，屬于很強范圍；而對照棉纖維斷裂比強度值29.22cN/tex和30.43cN/tex，屬于強級?？梢娎w維強度是評級棉花纖維品質(zhì)的一個重要制備，而本發(fā)明選擇的重組蛛絲蛋白基因5Pi7/轉(zhuǎn)化棉花后，明顯提高了棉花纖維的強度，實現(xiàn)了本發(fā)明的宗旨。(2)純合株系纖維品質(zhì)測定同樣，對本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)57Y/J基因棉花的兩個純合株系CTC-H2和CYC-H8也進行一系列品質(zhì)分析。這些分析均以未獲得成功轉(zhuǎn)化的陸地棉冀棉14號植株為陰性對照。衣分測定結(jié)果表明轉(zhuǎn)5^///基因棉花純合株系的衣分與對照相比沒有顯著差異。隨機抽取曬干的轉(zhuǎn)5P/J/基因棉花純合株系CTC-H2和CTC-H8的棉花含有種子的棉花纖維，用針沿種子中縫將種子上的纖維分開，然后用梳子將纖維梳理平直并貼在絨布表面，用直尺測量纖維的長度，每個單株測定15個樣品，取平均數(shù)。統(tǒng)計各個株系的每個單株數(shù)據(jù)，取平均數(shù)作為株系的纖維長度。結(jié)果表明在2個轉(zhuǎn)5P/J/基因純合株系的成熟纖維的長度與對照相比也沒有明顯的差異(圖ll)。除衣分和纖維長度外，還對轉(zhuǎn)基因純合株系CTC-H2和CTC-H8棉花纖維的強度和細度等指標(biāo)進行了測定。根據(jù)農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢測測試中心(安陽)的報告，依HVI系統(tǒng)的標(biāo)準，送檢的棉花纖維各指標(biāo)測定結(jié)果見表4。從表4的結(jié)果可以看出，在相同栽培條件下，纖維強度和斷裂伸長率兩個指標(biāo)與對照相比存在差距，即2個轉(zhuǎn)57YJ/基因純合株系CTC-H2和CTC-H8的棉花纖維強度比對照分別提高了1.53%和11.06%;而伸長率則分別下降了1.67%和3.33%。表4、57Y」r/轉(zhuǎn)基因純合株系棉花纖維和對照的品質(zhì)比較(2007.11)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注括號內(nèi)的數(shù)值表示測得的結(jié)果與對照相比是增加還是減少。+:增加；減少(3)轉(zhuǎn)基因棉花純合株系纖維素相對結(jié)晶度的變化結(jié)晶度是描述棉纖維超微結(jié)構(gòu)的重要參數(shù)，它表示棉纖維結(jié)晶區(qū)占纖維素整體所占的比例。采用改良的O'connor等的方法(AnalChem.1957，29(7):998-1005)，將O.5-1.0g成熟棉纖維充分粉碎，并過20目孔徑篩后，取10mg與少量KBr共同研磨后，取IOmg壓片10min，用紅外光譜儀(美國Nicolet公司生產(chǎn)，60SXR)測量，分辨率4cm—'。取1372cnT'及2900cnT'波數(shù)附近的峰值作為吸收強度,根據(jù)Nelson和O，connor(JApplPolySci.19648(3):1311-1324)提出的公式Kl=al/a2，計算出相對的結(jié)晶度。式中K1為結(jié)晶度指數(shù)；al為1372cm—H普帶的吸收強度；a2為2900cm—H普帶的吸收強度。以分離出的不含57Y/遂因的陸地棉冀棉14號植株為陰性對照。與對照相比，轉(zhuǎn)57YJ堪因棉花純合株系CTC-H2和CTC-H8的不同波長的峰值發(fā)生了變化(圖12，其中1表示CTC-H8，2表示CTC-H2，3表示ck)，相對結(jié)晶度分別提高了5.82%和15.37%(表5)。表5、轉(zhuǎn)基因棉花純合株系和對照纖維素相對結(jié)晶度編號ala2相對結(jié)晶度(%)ck0.22030.357861.57H20.47330.702467.39H82.52893.287076.945、免疫電鏡分析取57YJ/轉(zhuǎn)基因純合株系CTC-H8和陰性對照(分離的不含57〕///基因的棉花植株)開花后20天纖維和成熟纖維進行檢測。一抗為純化重組5個重復(fù)的蛛絲蛋白抗血清，二抗為商品化的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白抗體。通過膠體金標(biāo)記物顯示免疫反應(yīng)以確定抗原的在轉(zhuǎn)5P/J/基因純合株系CTC-H8的纖維中是否存在。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花純合株系纖維次生壁可以清晰地看到表達產(chǎn)物所形成的金顆粒，纖維次生壁上均存在較多的金標(biāo)記,形成一個連續(xù)體系(圖13，A為陽性樣品，B為對照，比例尺=800nm);而陰性對照纖維次生壁上幾乎沒有金標(biāo)記，表明上述結(jié)果可靠。綜上表明本研究按照棉花密碼子偏愛性規(guī)律，根據(jù)發(fā)表的蛛絲蛋白基因MaSP-1和MaSP-II的序列特征，將兩者按相同比例合成蛛絲蛋白//基因，再接上一段蛛絲蛋白基因的非重復(fù)序列(CSP)，構(gòu)成重組的蛛絲蛋白基因57Y//。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將棉纖維特異性啟動子￡6調(diào)控的重組蛛絲蛋白基因5^///導(dǎo)入陸地棉冀棉14號。PCR、Southern、RT-PCR和Western檢測表明5P/J/基因已經(jīng)整合進棉花基因組，并且在棉纖維中正常表達。纖維檢測表明，T。代單拷貝株系T。0纖維斷裂比強度分別比對照提高12.18%和9.75%，伸長率分別比對照下降了18.84%和12.5%。而5P/JJ轉(zhuǎn)基因T。代多拷貝株系T。1和T。4纖維斷裂比強度和伸長率與對照相比沒有顯著差異(表2)。轉(zhuǎn)5P/J/基因L非純合株系的纖維強度比對照提高了5.07-13.69%;而伸長率下降了0.99-6.67%。純合株系CTC-H2和CTC-H8的棉花纖維強度比對照分別提高了1.53%和11.06%,相對結(jié)晶度分別提高了5.82%和15.37%;而伸長率則分別下降了1.67%和3.33%。與對照相比，轉(zhuǎn)基因后代棉花纖維強度都有一定程度的提高，而伸長率則普遍下降。這表明，根據(jù)MaSP-I和MaSP-I的部分氨基酸序列，重組的蛛絲蛋白5TY/J基因表現(xiàn)出可以提高棉花纖維強度的結(jié)果。棉纖維拉伸斷裂是化學(xué)鍵斷裂與分子間滑脫綜合作用的結(jié)果，晶區(qū)作為纖維素大分子間的物理交聯(lián)點，具有阻止大分子鏈間相對滑移、改善力學(xué)性能的作用，因而結(jié)晶度愈高對提高纖維抗拉伸強度愈有益(Benedictetal.，CropSci.1994,34:147-151)。結(jié)合纖維強度和相對結(jié)晶度結(jié)果，可以看出，轉(zhuǎn)基因纖維強度的增加與相對結(jié)晶度的增加具有較好的一致性。說明轉(zhuǎn)基因纖維長度的增加是因為由于外源基因5PJJ/導(dǎo)入的表達增加引起的。序列表〈160〉2〈210〉1<211>2400<212>醒〈220〉〈223>〈400〉1atgggatctcgctgctgcaggga卿ggtggctggacaggcctggaggttccttcaggtcccaggtcagctctgctgcagcctggtggat,ggtgggtgg織gggtgc鄉(xiāng)gcgcaggggcttggatC3gC33gg3Cgcagctgcagggatatggtcgcagctggtccsgcaaggtcggcgcaggtgcttggatctcgctgctgcaggcagccgctgggtccaggacggtcctggagggtccttcagggaccaggtcggatctcaaggctgcagctg卿ggtgggt犯ggtgctggctggaggtgcggttgggtgggtggctatggacggaccaggctggatctgcaaggacctggctgcagccgcatggtccaggtgggtggacagctatggtgggtgcagctgcctgctgcagcctggtggataccgctgcagccaggacagcactggaggttacttcaggtcccagctgccgc卿gtgctggctggaggtgccagctggtccagcaaggtccgttacggaccgtcctggatcagcaaggaccgtgctggaaggaggtgctggtgggtggacaa卿ggtgggtggacagggtac鄉(xiāng)gcgcatgggcttggatcagcaaggatgcagctgcatggatatggttgcagctggtacagcaaggtgggcgcaggtgcttggatctcgctgctgcatgcagccgcttggtccaggatggtcctggaaggtccttcacggaccaggttggatctcaatgctgcagcta卿g.gtgggtggacagggttgg鄉(xiāng)ttacttcaggtcctaggtcagcaatgctgcagcttggtgg3t3taggtgggttgacagggtggcgggcgcaggtttgggtggacggctatggtgggtgcagctgtctgctgcagcctggtggatgccgctgcagccaggacagccctggaggttccttcaggtcgcagctgccgc卿gtgctggctggaggtggcagctggtccagcaaggtcggttacggacggtcctggatcagcaaggacggtgctggaagg郷tgctgttgggtggacggctatggtgggaccaggtcggatctgctgggacctggtggcagccgctgggtccaggacggtgg織ggtatggtgggcgcagctgccgagggcgceiggtgcagctgcc60ggcttggatctcaaggtgct120ccgctgctgcagctggaggt180ctgcagccgctgcagctggt240atggtccaggacagcaaggt300ctggtcctgg鄉(xiāng)ttacggei360aaggtccttcaggtcctgga420acggaccaggtcagcaagga480ctggatctcaaggtgctgga540ctgctgcagctggaggtgct600ga卿ggtgggttgggtgga660ctggacagggtggctatggt720ctggaggttacggaccaggt780cttcaggtcctggatctgct840caggtcagcaaggacctggt■ctgctgceigctgcagccgct960ctggtggatatggtccagga1020gaggtgggttgggtgg織g1080gacagggtggctatggtggg1140agggcgcaggtgcagctgcc1200ggcttggatctgctgcagct1260agcaaggacctggtggatat1320cagctgcagccgctgcagct1380gatatggtccaggacagcaa1440cagctggtcctggaggttsc1500agcaaggtccttcaggtcct1560gcgcaggtgcagctgccgct1620ttggatctcaaggtgctgga1680ctgctgcagctggaggtgct1740gg織gggtggg鄉(xiāng)ttacgtcaggtcctgggtcagcaaggctgcagctgggtggatatggattcaggagtctgctgcacggtctttctaacaattctttcaagttgtcggctatggtgggaccaggtcagatctgctgcgacctggtggcagccgctgcgtccaggacactagagttgctctcatctgtgatgtgatgtcttcatccagggcaatccgtgcttggatctgcaaggacctagctgcagccatatggtccaagctggtcctgcaaggtcctatcagctgtttatttctaactcttattcagcattggtcagtttgagtgcagctgcagctgggtggatatggctgcagctgggacagcaagggaggttacgtcaggtcctgtctaaccttggctgtgtctcgctcttctcggttaattatgttcggatccccagccgctgcgtccaggacagtcctggagggtccttcagggaccaggtcagatctcgtcttatccagtgg卿ttggtgcaaatcgtttcgagcggcctcatcaccatcaagctggtcctgcaaggtcctttacggaccatcctggatctgcaaggaccttgcttctccttccaacatcaatctaatccttgcttgcgttacagtttgcctcatcactga18001860192019802040210021602220228023402400〈210〉2〈211〉799〈212〉Pro〈220〉〈223><400〉2Met1GlyGlyGlyGly65ProGlyAlaTyrGlyAlaGlyAla50TyrGlyGinAlaGly130SerAlaLeu35GlyGlyGlyGinGly115ProGinGlyAlaGly5AlaAlaAlaAla20GlySerGinGlyAlaAlaAlaAla55GlyLeuGlySer70TyrGlyProGly85GlyProSerGly100ProGlyGlyTyrGlyGinGinGly135ArgAlaAla40AlaAlaGinProGly120ProGlyGly25GlyAlaAlaGinGly105ProSerGly10GlyArgAlaAlaGly90SerGlyGlyLeuAlaGlyGlyAla75ProAlaGinProGlyGlyGlyGly60AlaGlyAlaGinGly140GlyGinLeu45AlaAlaGlyAlaGly125SerGinGly30GlyGlyAlaTyrAla110ProAlaGly15GlyGlyGinAlaGly95AlaGlyAlaAlaTyrGinGlyGly80ProAlaGlyAlaAlaAla145ProGlyGinGlyAlaAhGlySer210AlaAla225GlyLeuTyrGlyGlyProProGly290GlyGin305AlaAlaTyrGlyGlyArgAlaAla370GlyAla385AlaAlaSerAlaGlyGinAlaGlyAlaAla195GinAlaGlyProSer275GlyGinGlyProGly355GlyGlyAlaAlaGin435AlaTyrGly180AlaGlyAlaSerGly260GlyTyrGlyProGly340GlyGlyArgAlaAla420GlyAlaGly165ArgAlaAlaAlaAla245GinProGlyProGly325GinLeuAlaGlyGly405AlaProGly150ProGlyGlyGlyAla230AlaGinGlyProSer310GlyGinGlyGlyGly390GlyAlaGlyProGlyGlyGlyArg215AlaAlaGlySerGly295GlyTyrGlyGlyGin375LeuAlaAlaGlyGlyGinLeuAla200GlyGlyAlaProAla280GinProGly■ProGin360GlyGlyGlyAlaTyr440GlyGinGly185GlyGlyGlyAlaGly265AlaGinGlyProSer345GlyGlyGlyGinAla425GlyTyrGly170GlyGinLeuAlaAla250GlyAlaGlySerGly330GlyAlaTyrGinGly410GlyProGly155ProGinGlyGlyGly235AlaTyrAlaProAla315GinProGlyGlyGly395GlyProGlyProSerGlyGlyGly220GinAlaGlyAlaGly300AlaGinGlyAlaGly380AlaTyrGlyGinGlyGlyAlaTyr205GinGlyGlyProAla285GlyAlaGlySerAla365LeuGlyGlyGlyGin445GinProGly190GlyGlyGlyProGly270AlaTyrAlaProGin350AlaGlyAlaGlyTyr430GlyGinGly175AlaGlyAlaTyrGly255GinAlaGlyAlaGly335GlyAlaSerAlaLeu415GlyProGly160SerAlaLeuGlyGly240GlyGinGlyProAla320GlyAlaAlaGinAla400GlyProSerGlyTyr465GlyProGlyGlyGly545ArgAlaAlaGlySer625GlyGlyTyrGlyArg705SerAlaPro450GlyProGlyGinLeu530AlaGlyGlyAlaPro610AlaGinProGlyPro690ValAlaSerGlyProSerGlyGin515GlyGlyGlyGlyAla595Gly,AlaGinGlyPro675SerAlaAlaAsnSerGlyGlyTyr500GlyGlyGinLeuAla580AlaGlyAlaGlySer660GlyGlySerLeuProAlaGinPro485GlyProGinGlyGly565GlyAlaTyrAlaPro645AlaGinProAlaSer725GlyAlaGin470GlyProSerGlyGly550GlyGinAlaGlyAla630GlyAlaGinGlyVal710SerLeuAla455GlySerGlyGlyAla535TyrGinGlyGlyPro615AlaGlyAlaGlySer695SerValSerAlaProAlaGinPro520GlyGlyGlyGlyPro600GlyAlaTyrAlaPro680ArgAsnlieArgAlaGlyAlaGin505GlyAlaGlyAlaTyr585GlyGinAlaGlyAla665GlyLeuLeuSerCysAlaGlyAla490GlySerAlaLeuGly570GlyGlyGinGlyPro650AlaGlyAlaValAsn730AspAlaTyr475AlaProGinAlaGly555AlaGlyTyrGlyPro635GlyAlaTyrSerSer715AlaValAla460GlyAlaGlyGlyAla540SerAlaLeuGlyPro620GlyGinAlaGlyPro700SerValLeuGlyProAlaGlyAla525AlaGinAlaGlyPro605SerGlyGinGlyPro685AspGlySerlieProGlyGlyGlyAlaGinGin480Tyr510GlyAlaGlyAlaSer590GlyGlyTyrGlyPro670GlySerProGinGinAlaGly495GlyProArgGlyAlaGlyAlaGly560AlaAla575AlaAlaGinGinProGlyGlyPro640ProSer655GlyGlyGinGinGlyAlaThrSer720lieGly735AlaLeu740745750LeuGlulie755ValSerAlaCysVal760ThrlieLeuSerSer765SerSerlieGlyGin770ValAsnTyrGlyAla775AlaSerGinPheAla780GinValValGlyGinSerValLeuSerAlaPheGlySerHisHisHisHisHisHis78579079權(quán)利要求1、一種蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2自氨基末端第1至793位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2自氨基末端第1至793位氨基酸殘基所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。2、權(quán)利要求l所述蛋白的編碼基因。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述編碼基因為如下l)或2)或3)的基因1)其核苷酸序列是序列表中序列1自5'末端第1至2379位核苷酸所示的DNA分子；2)在嚴格條件下與l)限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白的DNA分子；3)與l)限定的DNA序列具有9(^以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。4、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組菌。5、含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達盒。6、含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。7、含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為將序列表中序列1自5'末端第1至2379位核苷酸所示的DNA序列插入表達載體pPZPlll的多克隆位點得到的。9、一種培育纖維品質(zhì)提高的棉花的方法，是將權(quán)利要求7或8所述的重組表達載體導(dǎo)入棉花細胞中，培育得到纖維品質(zhì)提高的棉花。10、根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述纖維品質(zhì)為纖維強度。全文摘要本發(fā)明公開了一種培育纖維品質(zhì)提高的棉花的方法。本發(fā)明方法中所用的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白質(zhì)(a)由序列表中序列2自氨基末端第1至793位氨基酸殘基所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2自氨基末端第1至793位氨基酸殘基所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明首次使蛛絲蛋白在棉花中表達，從而明顯提高了棉纖維強度，改善了棉花的纖維品質(zhì)，為棉花生產(chǎn)和育種提供了新的種質(zhì)材料。因此，本發(fā)明具有重要的經(jīng)濟利用價值。文檔編號C12N1/19GK101328212SQ200810116308公開日2008年12月24日申請日期2008年7月8日優(yōu)先權(quán)日2008年7月8日發(fā)明者喬志新,磊候,劉進元,吳藹民,張恒木,秦永華,炎裴申請人:清華大學(xué)