專利名稱：棉花纖維發(fā)育相關(guān)的GhLIM5基因克隆鑒定及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及棉花基因。具體是一個(gè)棉纖維快速伸長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的LIM家族基因GhLIM5的克隆與功能鑒定。
背景技術(shù)：
我國(guó)是世界上最大的棉花生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)，也是最大的紡織品、服裝生產(chǎn)國(guó)和出口國(guó)，因此，其棉纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)不僅直接關(guān)系到廣大農(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入和大量紡織工人的就業(yè)與收入，還關(guān)系到我國(guó)紡織工業(yè)及對(duì)外貿(mào)易的持續(xù)、健康的發(fā)展。我國(guó)是世界五大產(chǎn)棉國(guó)之一，不論皮棉產(chǎn)量還是單產(chǎn)量都高居世界榜首。然而，隨著紡織工業(yè)的日益發(fā)展，對(duì)原料的要求已經(jīng)越來(lái)越高。新的紡織技術(shù)需要纖維更長(zhǎng)、強(qiáng)度更高并且更加齊整的棉纖維。 而我國(guó)目前國(guó)產(chǎn)原棉的長(zhǎng)度類(lèi)型單一，其長(zhǎng)度和強(qiáng)度都無(wú)法達(dá)到紡織細(xì)紗的要求，只能高度依賴進(jìn)口 ；而對(duì)適用于紡織低支紗的要求的原棉，由于產(chǎn)量和售價(jià)低，棉農(nóng)多不愿種植。因此，我國(guó)每年需進(jìn)口優(yōu)質(zhì)皮棉100多萬(wàn)噸，造成國(guó)產(chǎn)原棉積壓。由此可見(jiàn)纖維品質(zhì)問(wèn)題已成為制約我國(guó)棉花產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的主要障礙之一。如何提高棉花纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)始終是棉花遺傳改良的最終目標(biāo)，而常規(guī)育種手段，很難同時(shí)做到品質(zhì)和產(chǎn)量同時(shí)提高，因此逐步運(yùn)用遺傳工程將優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，特別是纖維品質(zhì)和產(chǎn)量相關(guān)的優(yōu)良性狀引入棉花主栽品種，不僅可提高棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，降低生產(chǎn)成本，而且可減輕對(duì)環(huán)境的不利影響。而此工作的開(kāi)展則依賴于棉花纖維發(fā)育相關(guān)基因的識(shí)別與分離。通過(guò)克隆棉花纖維發(fā)育的關(guān)鍵功能基因，分析基因的表達(dá)調(diào)控及表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能，闡明纖維發(fā)育的分子機(jī)制，為培育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的棉花品種提供理論依據(jù)和基因兀件。LIM結(jié)構(gòu)域蛋白家族是廣泛存在于各種生物中的一類(lèi)蛋白質(zhì)，其命名來(lái)源于三個(gè)最早克隆到的LM結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)LIN11，ISLl和MEC3的首字母。這些蛋白中通常含有一個(gè)或多個(gè) UM 結(jié)構(gòu)域，每個(gè) UM 結(jié)構(gòu)域都有[C-X2-C-X16 _23-H-X2-C]-X2-[C-X2-C-X16_21C-X2_3-(C/D/H)]保守結(jié)構(gòu)。這一結(jié)構(gòu)域中有兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，之間是很短的氨基酸殘基序列。動(dòng)物基因組編碼大量的UM結(jié)構(gòu)域蛋白，他們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上都有很大的差異。相比之下，植物中僅發(fā)現(xiàn)少量的LIM結(jié)構(gòu)域蛋白，他們屬于半胱氨酸富含類(lèi)的蛋白質(zhì)亞家族。在之前的研究中，一些植物和脊椎動(dòng)物的LIM結(jié)構(gòu)域蛋白被證實(shí)具有結(jié)合肌動(dòng)蛋白的能力。植物L(fēng)IM結(jié)構(gòu)域蛋白都屬于一類(lèi)相對(duì)較小的蛋白質(zhì)群，他們通常由兩個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域和一個(gè)較長(zhǎng)的UM間隔區(qū)域(約40-50個(gè)氨基酸殘基)所組成。先前的研究表明煙草WUMl在BY-2細(xì)胞中具有穩(wěn)定和成束肌動(dòng)蛋白纖維絲的功能。使用相關(guān)的化學(xué)藥物處理后，綠色熒光蛋白標(biāo)記的WUMl被證實(shí)聚集在煙草BY-2細(xì)胞質(zhì)骨架上。高速和低速共沉淀實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)UMl能夠結(jié)合到肌動(dòng)蛋白纖絲上并使其成束。因此有人推測(cè)植物L(fēng)IM結(jié)構(gòu)域蛋白使微絲成束的模型。根據(jù)表達(dá)組織的差異，植物L(fēng)IM結(jié)構(gòu)域蛋白曾被分為兩類(lèi)花粉中特異性表達(dá)的pLIM和具有組織廣泛性表達(dá)的wLIM。然而這種分類(lèi)方法隨著研究的深入其局限性日益明顯。目前，新的分類(lèi)方法是根據(jù)生物信息學(xué)的分析將該家族的蛋白質(zhì)分為四大類(lèi)aUMl，^LIMl, YUM2和SUM2。盡管植物的UM結(jié)構(gòu)域蛋白在其結(jié)構(gòu)上高度保守，但他們?cè)谥参锇l(fā)育過(guò)程中的功能卻有差異。Kawaoka等人指出煙草Ntliml是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)苯丙烷類(lèi)化合物合成相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)也證實(shí)該蛋白質(zhì)能夠結(jié)合到相關(guān)基因啟動(dòng)子的保守區(qū)域(CCAC(A/C)AN(A/C)N(C/T) (A/C))。當(dāng)Ntliml沉默后，幾個(gè)關(guān)鍵的苯丙烷通路相關(guān)基因的表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)。而Wang等人的研究則發(fā)現(xiàn)，百合中的一個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域蛋白一Liliml屬于肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白家族,能夠使肌動(dòng)蛋白絲成束，調(diào)控肌 動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)以及保護(hù)百合花細(xì)胞中微絲的解聚。最近，一個(gè)研究小組也證實(shí)擬南芥的6個(gè)LIM結(jié)構(gòu)域蛋白屬于兩個(gè)不同的植物L(fēng)IM蛋白家族，他們對(duì)于肌動(dòng)蛋白絲的成束及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的解聚是至關(guān)重要的。并且，這兩個(gè)小組的研究都表明百合Liliml和擬南芥AtPUM2C均受到pH值和低鈣離子濃度的調(diào)節(jié)。在低pH值和低濃度鈣離子濃度時(shí)他們更易與微絲相互作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)新的棉纖維快速伸長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)特異表達(dá)的ZJ#基因(AZTMJ)，分析揭示該基因功能，探索其對(duì)纖維發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制，進(jìn)而應(yīng)用該基因改良棉纖維品質(zhì)，創(chuàng)造棉花優(yōu)良品種。在本研究中，申請(qǐng)人從棉花纖維cDNA文庫(kù)中分離出I個(gè)棉花纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)的GhLIM5蛋白基因，利用定量RT-PCR技術(shù)，驗(yàn)證該基因的表達(dá)譜，顯示該基因是纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因。GhLIM5 cDNA包含570 bp的開(kāi)放閱讀框架，編碼一個(gè)189氨基酸的蛋白，其分子量為20. 73KD，等電點(diǎn)(pi)為8.84。GhLIM5蛋白含有兩個(gè)保守的LIM結(jié)構(gòu)域，與擬南芥UM蛋白具有較高的同源性。已有研究表明擬南芥的6個(gè)UM結(jié)構(gòu)域蛋白對(duì)于肌動(dòng)蛋白絲的成束及肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的解聚是至關(guān)重要的，暗示著GMJM5也可能在棉纖維發(fā)育過(guò)程中參與肌動(dòng)蛋白絲動(dòng)態(tài)變化的調(diào)節(jié)。利用定量RT-PCR技術(shù)對(duì)該基因在棉花不同組織和棉纖維不同發(fā)育階段的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，結(jié)果表明必ZTMJ基因在棉纖維快速伸長(zhǎng)期高量表達(dá)，而在棉花其它組織中表達(dá)較弱。亞細(xì)胞定位分析顯示，該蛋白在整個(gè)細(xì)胞中呈現(xiàn)由絲狀物組合而成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明GMJM5定位在棉花細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架(F-actin)上。為了了解該蛋白是直接還是間接與F-actin發(fā)生聯(lián)系，申請(qǐng)人通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)得到可溶性GMJM5蛋白，在體外進(jìn)行高速共沉淀實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證GhLIM5蛋白能否與纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)直接相互作用。結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)能夠與纖維狀肌動(dòng)蛋白發(fā)生共沉淀，說(shuō)明GMJM5能與纖維狀肌動(dòng)蛋白發(fā)生相互作用。隨后，為進(jìn)一步了解該蛋白是否能促使纖維狀肌動(dòng)蛋白成束，申請(qǐng)人采用了體外低速共沉淀的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行分析。結(jié)果顯示GMJM5能與纖維狀肌動(dòng)蛋白發(fā)生共沉淀，并且隨著GMJM5濃度的增大，共沉淀的效果逐漸明顯。這些結(jié)果說(shuō)明GMJM5與纖維狀肌動(dòng)蛋白結(jié)合后能促使纖維狀肌動(dòng)蛋白發(fā)生成束反應(yīng)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
I.提供了一個(gè)新的棉纖維相關(guān)的基因(cDNA)序列。該基因在棉纖維快速伸長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)，表明該基因在棉纖維發(fā)育過(guò)程中起重要作用。2. GhLIM5定位在植物細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白纖絲上，表明該蛋白參與棉纖維肌動(dòng)蛋白動(dòng)態(tài)變化的調(diào)節(jié)。3.體外高速共沉淀實(shí)驗(yàn)分析顯示GMJM5能與纖維狀肌動(dòng)蛋白發(fā)生共沉淀反應(yīng)，說(shuō)明該蛋白直接能與纖維狀肌動(dòng)蛋白發(fā)生相互作用。4.體外低速共沉淀的實(shí)驗(yàn)分析顯示GMJM5能與纖維狀肌動(dòng)蛋白發(fā)生共沉淀，并且隨著GMJM5濃度的增大，共沉淀的效果逐漸明顯。這意味著GMJM5可能直接調(diào)控棉纖維發(fā)育過(guò)程中纖維狀肌動(dòng)蛋白的成束反應(yīng)。·本發(fā)明通過(guò)以下附圖和實(shí)施作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明的范圍。


圖I熒光定量RT-PCR分析GhUM5在棉花各組織的表達(dá)
圖中1-根；2_下胚軸；3-子葉；4-葉片；5-花瓣；6-花藥；7-胚珠；8_纖維。圖2.熒光定量RT-PCR分析GhLIM5在棉花纖維不同發(fā)育階段的表達(dá)
圖中1-開(kāi)花后3天纖維；2_開(kāi)花后6天纖維；3_開(kāi)花后9天纖維；4_開(kāi)花后15天纖維；5-開(kāi)花后18天纖維；6_開(kāi)花后20天纖維。圖3. GMJM5在棉花細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析
圖中綠色滅光顯不GhLIM5定位于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上，A圖暗視場(chǎng)；B圖明視場(chǎng)；C圖A圖與B圖拼合。圖4. GhLIM5與纖維狀肌動(dòng)蛋白高速共沉淀分析
圖中1_單獨(dú)用牛血清白蛋白進(jìn)行反應(yīng)；2-用牛血清白蛋白與纖維狀肌動(dòng)蛋白進(jìn)行反應(yīng)；3-單獨(dú)用GhLIM5蛋白進(jìn)行反應(yīng)；4-用GhLIM5蛋白與纖維狀肌動(dòng)蛋白進(jìn)行反應(yīng)；上清-指進(jìn)行高速離心后的上清液直接進(jìn)行電泳；沉淀-指離心后的沉淀溶于去離子水后進(jìn)行電泳；圖片左邊的箭頭指示不同蛋白成分所處位置。圖5. GhLIM5與纖維狀肌動(dòng)蛋白低速共沉淀分析
圖中+代表加入相應(yīng)成分，-代表未加入相應(yīng)成分；上清指進(jìn)行低速離心后的上清液直接進(jìn)行電泳；沉淀指離心后的沉淀溶于去離子水后進(jìn)行電泳；箭頭指示不同蛋白成分所處位置。
具體實(shí)施例方式一個(gè)棉花LIM家族新基因GhUM5的克隆鑒定和功能分析
I. GhLIM5 cDNA序列的分離鑒定
從棉纖維cDNA文庫(kù)中分離了 10，000多個(gè)棉花cDNA克隆，進(jìn)行DNA測(cè)序。通過(guò)生物信息學(xué)分析，獲得5個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA序列，其中一個(gè)命名為GhLIM5。定量RT-PCR分析GhLIM5基因的表達(dá)
(I)棉花組織的總 RNA 提取(按 Li XB, Cai L, Cheng NH, Liu Jff, 2002. Molecularcharacterization of the cotton GhTUBl gene that preferentially expressed infiber. Plant Physiol. 130:666-674 進(jìn)行)。(2)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR研究基因的表達(dá)(按照Li XBj Fan XPj Wang XL, CaiLj Yang WCj 2005. The Cotton ACTINl gene is functionally expressed in fibersand participates in fiber elongation. Plant Cell 17:859 - 875 進(jìn)行)。首先，將棉花不同組織(根、下胚軸、子葉、葉子、花瓣、花藥、開(kāi)花后O和10天胚珠、開(kāi)花后3天纖維、6天纖維、9天纖維、12天纖維、15天纖維、18天纖維、20天纖維等)的總RNA (2 y g/樣)用 M-MLV RNase H-Reverse Transcriptase (Promega)反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ;然后，以 cDNA 為模板，用基因特異的引物{GhLIM5 RTPl 和RTP2)和 Real-time PCR Master Mix
(T0Y0B0, Japan)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。棉花必現(xiàn)J7基因作為RT-PCR反應(yīng)的內(nèi)標(biāo)，目標(biāo)基因每一個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增都被SYBR-Green熒光檢測(cè)。每個(gè)基因的表達(dá)水平相對(duì)值按公式Y(jié)=10Act/3.57 x 100o/o 計(jì)算(其中 A Ct=CtGhUBIl-CtGhLIM5, 3. 57 是利用 GhUBIl 制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線y= - 0. 28x+9. 87中斜率的倒數(shù)，表示基因表達(dá)相差10倍的PCR循環(huán)數(shù))。重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。蛋白的亞細(xì)胞定位分析
將編碼區(qū)去終止密碼子后與eGFP融合(引物為GhLIM5 GUp和GhLIM5⑶n)，構(gòu)建pBI 121-GMJM5: eGFP植物表達(dá)載體，將該載體通過(guò)電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌中，再通過(guò)下胚軸浸染轉(zhuǎn)化棉花，篩選陽(yáng)性愈傷組織，置于共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光。蛋白與纖維狀肌動(dòng)蛋白在體外相互作用分析
構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-28a-GhUM5載體(引物為GhLIM5 EUp和GhLIM5 EDn)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，用IPTG誘導(dǎo)GMJM5蛋白表達(dá)并用鎳柱非變性純化該蛋白。然后，將純化的GMJM5蛋白與纖維狀肌動(dòng)蛋白在體外反應(yīng)一段時(shí)間后，經(jīng)高速離心后將上清液和沉淀分開(kāi)。使用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)上清液和沉淀中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。低速共沉淀與可視化實(shí)驗(yàn)證明GhLIM5蛋白促進(jìn)Actin的聚合。將不同濃度的GMJM5與纖維狀肌動(dòng)蛋白反應(yīng)一段時(shí)間后，經(jīng)低速離心后將上清液和沉淀分開(kāi)。使用SDS-PAGE凝膠電泳對(duì)上清液和沉淀中的蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。本項(xiàng)目所用引物見(jiàn)下表
表I基因特異性引物
權(quán)利要求
1.一個(gè)棉花GhLIM5基因，其特征在于該基因的cDNA序列如下ACTCCTTTTT ATACTCTCAT TTTACGTTTA TTTCTTCTTT CTTTCATAGA TCCAGGCCTT 60CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTATCAAAGT TAATATAGGC AAATATAAGA 120GAAGAAATCG AATTAAAGTT GATCCGTGAA ACTAGATAAA GAACAGTACG ATTTGTTTTG 180ACCAAAGCAC ATTCGAGCCA TGTCATTTAT TGGTACCCAA CAGAAATGCA AGGCTTGTGA 240GAAGACTGTT TATCCAGTTG AACTTTTGTC TGCAGATGGA GTTCCTTACC ATAAATCTTG 300CTTCAAGTGC AGTCATTGCA AAGGGACACT AAAGTTGGCT AATTACTCCT CAATGGAAGG 360TGTTCTTTAC TGCAAGCCTC ATTTCGAGCA ACTCTTCAAG GAGACGGGTA ACTTCAACAA 420GAATTTCCAA TCGTCTGCAA AGGCAGCTGA GAAGTTAACT CCCGAGATGA CGAGATCACC 480AAGCAAAGCT GCCAGCATGT TTTCCGGGAC AGTCGAAAAA TGTGCTACTT GTGGCAAAAC 540TGCATATCCA CTTGAGAAGG TAACTGTAGA AGGACAGTCT TACCACAAAT CATGTTTCAA 600GTGCTCTCAT GGTGGCTGCT CTTTGAGTCC ATCAAATTAT GCAGCACTTG AAGGCATTTT 660GTACTGCAAA CATCACTTTT CCCAGCTCTT CAAGGAGAAA GGAAGCTACA ATCATCTTAT 720CAAATCCGCA TCAATCAAGC GTGCCGCTGC ATCCGTTCCT GAAGCTTGAA TACCTATTTC 780ATGTTTTTTG TTTATTCCCA TGTTTGCCGG TGTGTTTTTT TATTGATTTT TTGGATTTAT 840GCTCGGGAGG GGAACTGGAA AGAAAGAACT TGGGTTTCTT TCCGTTTTTT TGAGGCCTTG 900GTATTTGATT GATTTAAGTA GAAGTGAATG TTGTAACAGG ACTCTGTGCA AGATTTTTTA 960TGCAATCCAA ATTTGGCTCA TTTCGAATGA ATATTTTTAT AAATAATAAA AATGTTAGAT 1020ACACTACTTG GCAAT1035基因編碼區(qū)從起始密碼子ATG到終止密碼子TGA (200 - 769bp)。
2.如權(quán)利要求I是所述的棉花基因，其特征在于該基因編碼的蛋白質(zhì)序列如下Met Ser Phe lie Gly Thr Gln Gln Lys Cys Lys Ala Cys Glu Lys Thr Val Tyr Pro Val Glu 5101520Leu Leu Ser Ala Asp Gly Val Pro Tyr His Lys Ser Cys Phe Lys Cys Ser His Cys Lys Gly 25303540Thr Leu Lys Leu Ala Asn Tyr Ser Ser Met Glu Gly Val Leu Tyr Cys Lys Pro His Phe Glu 45505560Gln Leu Phe Lys Glu Thr Gly Asn Phe Asn Lys Asn Phe Gln Ser Ser Ala Lys Ala Ala Glu 65707580Lys Leu Thr Pro Glu Met Thr Arg Ser Pro Ser Lys Ala Ala Ser Met Phe Ser Gly Thr Val859095100105Glu Lys Cys Ala Thr Cys Gly Lys Thr Ala Tyr Pro Leu Glu Lys Val Thr Val Glu Gly Gln 110115120125Ser Tyr His Lys Ser Cys Phe Lys Cys Ser His Gly Gly Cys Ser Leu Ser Pro Ser Asn Tyr 130135140145Ala Ala Leu Glu Gly lie Leu Tyr Cys Lys His His Phe Ser Gln Leu Phe Lys Glu Lys Gly 150155160165Ser Tyr Asn His Leu lie Lys Ser Ala Ser lie Lys Arg Ala Ala Ala Ser Val Pro Glu Ala 170175180185189。
全文摘要
一種棉花纖維發(fā)育相關(guān)的GhLIM5基因克隆鑒定及應(yīng)用。公開(kāi)了棉纖維GhLIM5基因全長(zhǎng)序列。GhLIM5編碼了一個(gè)包含LIM結(jié)構(gòu)域的蛋白。該基因的mRNA在棉纖維細(xì)胞快速伸長(zhǎng)期中大量積累，亞細(xì)胞定位分析顯示GhLIM5蛋白結(jié)合在棉花細(xì)胞的肌動(dòng)蛋白纖絲上。體外高速和低速共沉淀實(shí)驗(yàn)表明，GhLIM5蛋白能與纖維狀肌動(dòng)蛋白發(fā)生共沉淀，GhLIM5能直接與纖維狀肌動(dòng)蛋白發(fā)生相互作用，并隨著GhLIM5蛋白濃度的增大，共沉淀的效果逐漸明顯，說(shuō)明GhLIM5與纖維狀肌動(dòng)蛋白結(jié)合后能促使纖維狀肌動(dòng)蛋白發(fā)生成束反應(yīng)，表明GhLIM5蛋白在棉花纖維發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。該基因可用于棉纖維品質(zhì)改良分子育種研究。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102747088SQ20121021444
公開(kāi)日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月27日
發(fā)明者姜佳, 李蘭, 李學(xué)寶, 李揚(yáng) 申請(qǐng)人:華中師范大學(xué)