專利名稱：一種植物葉片維管束特異性表達(dá)的啟動(dòng)子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種植物維管束特異性表達(dá)的啟動(dòng) 子，含有該啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體，以及該啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)化子，本發(fā)明還涉及上述啟 動(dòng)子在植物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用。
技術(shù)背景啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因5'端上游區(qū)域，能被RNA聚合酶識(shí)別并與之結(jié)合，從 而起始轉(zhuǎn)錄基因的一段DNA序列。啟動(dòng)子是基因表達(dá)所必需的，決定了外源基因表 達(dá)的空間、時(shí)間、以及表達(dá)量等，是生物轉(zhuǎn)基因工程中至關(guān)重要的因素，也是關(guān)系 到生物轉(zhuǎn)基因安全的一個(gè)重要因素，最早廣泛使用的生物轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子是一些組成 型啟動(dòng)子，如來源于CaMV的35S啟動(dòng)子、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒T-DNA區(qū)域的胭脂 堿合成酶基因啟動(dòng)子Nos，章魚堿合成酶基因啟動(dòng)子Ocs，組成型啟動(dòng)子的特點(diǎn)是在 所有的組織中都啟動(dòng)基因表達(dá)，具有持續(xù)性，不表現(xiàn)時(shí)空特異性，難以達(dá)到定向改 造植物性狀的目的，往往產(chǎn)生一些不需要的結(jié)果，甚至負(fù)面的效果，另外組成型啟 動(dòng)子在時(shí)空上的持續(xù)表達(dá)，也造成植物生長(zhǎng)資源的浪費(fèi)。在生物轉(zhuǎn)基因安全方面， 這些組成型啟動(dòng)子的高表達(dá)量、強(qiáng)啟動(dòng)效應(yīng)、對(duì)生物種類和組織的不加選擇，以及 其來源如病毒的不安全性，使采用該類啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因生物容易成為基因漂移、外 源基因泛濫表達(dá)的源頭，使人們非常擔(dān)心轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題，因此，在基因 工程中，定向、安全地改良植物某些形狀的先決條件是提供基因時(shí)空特異性表達(dá)的 啟動(dòng)子，構(gòu)建高效表達(dá)的表達(dá)載體，使靶標(biāo)基因精確地在目的組織內(nèi)按需表達(dá)。維管束是植物重要的功能組織，是輸送養(yǎng)分、水分、決定抗逆能力的重要組織， 如果能獲得調(diào)控基因在維管束中特異表達(dá)的啟動(dòng)子，使各種外源抗病基因、抗倒伏 基因都只在維管束中表達(dá)，而不在種子中表達(dá)，使植株獲得抗性的同時(shí)，生產(chǎn)出來 的糧食也沒有安全隱患，因此分離克隆到這樣的啟動(dòng)子，對(duì)于植物轉(zhuǎn)基因工程獲得 抗性品種具有十分重要的意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種驅(qū)動(dòng)外源基因在植物葉片維管束組織特異性表達(dá)的啟 動(dòng)子，以及獲得含有該啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)化子。一種植物葉片維管束特異性啟動(dòng)子Op，其核苷酸序列如SEQ ID 1所示。 一種植物表達(dá)載體，其特征是含有上述植物葉片維管束特異性啟動(dòng)子Op。 所述植物表達(dá)載體是pCAM-Op。 一種轉(zhuǎn)化子，其特征是含有上述植物葉片維管束啟動(dòng)子0p或植物表達(dá)載體 pCAM-0p及宿主。所述轉(zhuǎn)化子為細(xì)胞系，愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。 所述宿主為根癌農(nóng)桿菌。所述植物葉片維管束特異性啟動(dòng)子Op在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。 所述轉(zhuǎn)基因植物為水稻。所述應(yīng)用是將植物葉片維管束特異性啟動(dòng)子0p插入靶標(biāo)基因前轉(zhuǎn)化植物，使靶 標(biāo)基因在植物葉片維管束中特異性表達(dá)。所述的應(yīng)用是指抗病育種與抗逆性育種。本發(fā)明提供的啟動(dòng)子位于表達(dá)載體中的靶標(biāo)基因前，其結(jié)構(gòu)包括翻譯起始密碼 子在內(nèi)的bp的DNA序列(SEQIDNOl， +1位置處為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；leaderintron序列 以下劃線標(biāo)注)，該DNA片段含有大量的順式調(diào)控元件、并在位于翻譯密碼子前具有 一段leaderintron序列，將本啟動(dòng)子連接到表達(dá)載體中的耙標(biāo)基因前，可驅(qū)動(dòng)靶標(biāo)基 因在葉片維管束組織中的特異表達(dá)，可以提高外源基因在植物葉片維管束中表達(dá)量， 增加轉(zhuǎn)基因的效果，減輕外源基因由于過量表達(dá)而對(duì)作物農(nóng)藝性狀的影響。在植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301中，將GUS報(bào)告基因前的啟動(dòng)子缺失，并 將本發(fā)明的水稻<%S77^基因啟動(dòng)子Op連接到GUS報(bào)告基因前，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo) 的遺傳轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行水稻的轉(zhuǎn)化。對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行組織化學(xué)染色后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn) 基因植株整體上的GUS基因表達(dá)水平相對(duì)較低，在葉片中僅在葉脈處顯藍(lán)色，證明 該啟動(dòng)子具有驅(qū)動(dòng)基因表達(dá)的啟動(dòng)活性，且該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在水稻葉片維 管束中特異表達(dá)。本發(fā)明啟動(dòng)子在植物基因工程中的應(yīng)用潛力很大，尤其在開發(fā)抗葉片維管束病 害的轉(zhuǎn)基因作物中優(yōu)勢(shì)更加明顯，可以通過驅(qū)動(dòng)抗病基因在維管束中的特異表達(dá)， 而提高植物對(duì)葉片維管束病害的抗性；同時(shí)維管束是無機(jī)鹽和有機(jī)物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 的輸導(dǎo)系統(tǒng)，并具有支持植物體的作用，因此，該啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因作物開發(fā)中，可 應(yīng)用于提高作物抗逆性品種培育研究，由于其微管束組織特異性表達(dá)的特性，用其代替35S等組成型啟動(dòng)子，可培育出理想的生物安全性高的轉(zhuǎn)基因植物品種。


圖1A: pCAMBIA1301示意圖；圖lB:利用啟動(dòng)子Op構(gòu)建驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)的載體pCAM-Op示意圖。 圖2:利用Op啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)情況的分析A. 無啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片；B. CaMV35S: :gus轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片；c.Op::gus轉(zhuǎn)基因植株葉片；D. 無啟動(dòng)子表達(dá)載體轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片維管束組織；E. CaMV35S: :gus轉(zhuǎn)基因水稻植株葉片維管束組織f. Op: :gus轉(zhuǎn)基因植株葉片維管束組織具體實(shí)施方式
現(xiàn)結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施例l:含有酶切位點(diǎn)的啟動(dòng)子Op的獲得步驟l、引物的設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI中提供的水稻品種日本晴(Oryza sativa L cv. Nipponbare)全基因組序 列，依據(jù)水稻O^77^基因的起始密碼子上游1380bp序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，并根據(jù)選 用的載體及耙標(biāo)基因的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物的酶切位點(diǎn)，在本實(shí)施例中以水稻雙元表達(dá) 載體pCAMBIA1301 (來自于CAMBIA，公開使用載體，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù) 研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分子植病組有保存，公眾可以從該實(shí)驗(yàn)室 得到)為例，靶標(biāo)基因?yàn)镚US基因，具體設(shè)計(jì)的引物為正向引物Opl 5'端帶Bgl II酶切位點(diǎn)，反向引物Op2的5'端帶EcoRl酶切位點(diǎn)，引物序列如下正向引物Opl(5'-CAGATCTACCATCTGCATGAAAACATATGGTACTTTGC-3') 柳I反向引物Op2 (5' -CGAATTCGTTGTGATTGGATCTGTGTACCTG-3')由上海生工生物技術(shù)公司合成。 步驟2.啟動(dòng)子Op的獲得以水稻品種日本晴總DNA為模板，利用Opl、 Op2擴(kuò)增啟動(dòng)子Op。試劑采用高保真酶，按常規(guī)PCR體系，擴(kuò)增程序采用如下95t預(yù)變性15min; 95。C變性40s，57。C退火40s， 72。C延伸lmin30s， 36個(gè)循環(huán)；最后72t:延伸5min?；厥誔CR擴(kuò)增的目的片段，目的片段長(zhǎng)度1380bp，連接到pMD18-T (購(gòu)于 TaKaRa公司，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分 子植病組有保存，公眾可以從該實(shí)驗(yàn)室得到)載體中，按照熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci (購(gòu)于TaKaRa公司)感受態(tài)細(xì)胞后，經(jīng)篩選獲得轉(zhuǎn)化子pMD18-T-Op，挑取單克隆 用和I進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的克隆即為所要獲得的啟動(dòng)子Op(圖1)。實(shí)驗(yàn)例2:利用Op啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS報(bào)告基因在水稻中表達(dá)步驟1植物表達(dá)載體的構(gòu)建和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化將實(shí)施例1所得pMD18-T-Op用5g/ II和五co及I酶切，回收后與pCAMBIA1301 的￡g/ II和￡coi I酶切載體部分，用T4 ligase(購(gòu)于Takara生物公司)進(jìn)行連接，得到 啟動(dòng)子Op與gus基因融合的植物表達(dá)載體pCAM-Op (圖2)，利用凍融法將表達(dá)載 體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105 (中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研 究所植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分子植病組有保存，公眾可以從該實(shí)驗(yàn)室得 到)，提取陽性質(zhì)粒，用BglII、 EcoRl進(jìn)行酶切驗(yàn)證，正確的克隆待用。對(duì)照轉(zhuǎn)CaMV35S: :g^作為對(duì)照，利用凍融法將表達(dá)載體pCAMBIA1301轉(zhuǎn) 入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105，操作步驟、及驗(yàn)證同pCAM-Op 的轉(zhuǎn)化方法。步驟2、水稻的遺傳轉(zhuǎn)化水稻千種子去殼后，用70%酒精消毒3min，無菌水洗3-4次，再用2%次氯酸鈉 溶液消毒30min，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(N6maxl0x 100ml, N6minl00x 10ml, Fe2+EDTA 100x IOML、維生素lOOx IOML， 2、 4-D2.5ML，脯氨酸0.3g， CH0.6g，蔗糖30g， Phytagel 3g，加蒸鎦水至卯0ML，加少量氫氧化納調(diào)節(jié)pH至5.9，煮沸并定容至1000ml，分 裝并滅菌待用)上26"暗培養(yǎng)7天左右，將愈傷用鑷子小心取下放到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上 26'C暗培養(yǎng)4天左右備用。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選及轉(zhuǎn)基因植株再生 等參照Hiei Y(Hiei Y, Ohta S and Toshihiro K, et al. Efficient transformation of rice( Oryzae sativa L. ) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of boundaries of the T- DNA[J].The Plant Journal, 1994.6271 -6282.)等的方法。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化子篩選和轉(zhuǎn)基因植株再生等過程，獲得39株Op: :g^存基厲j凝P 12株CaMV35S: :g附轉(zhuǎn)基因水稻植株。步驟3.GUS組織化學(xué)染色參照J(rèn)efferson(Jefferson RA et al.GUS fUsion:卩-Glucuronidase as a sensitive and versatile genefusion marker in higher plant.EMBO J.,1987,6:3901-3卯7)等的方法，將需 要染色的組織抽真空，然后浸入染色液中，37'C下染色8小時(shí)。脫色時(shí)在37"C條件 下用95%乙醇處理，至陰性對(duì)照材料呈白色。通過GUS組織化學(xué)染色，檢測(cè)了啟動(dòng)子Op在水稻轉(zhuǎn)基因植株中對(duì)GUS的啟動(dòng) 活性。結(jié)果顯示，在Op::gus轉(zhuǎn)基因植株葉片中，葉脈部位檢測(cè)到GUS基因的活性， 說明該啟動(dòng)子具有驅(qū)動(dòng)GUS基因表達(dá)的活性，且能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在葉片微管束 處特異表達(dá)(圖2C)。對(duì)CaMV35S組成型啟動(dòng)子與本實(shí)驗(yàn)特異性啟動(dòng)子Op進(jìn)行比 較，發(fā)現(xiàn)不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因在轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)有所不同，其中CaMV35S::gus轉(zhuǎn)基因植株的整個(gè)葉片中g(shù)us均有高水平表達(dá)(圖2B)，與之相比Op: :gus轉(zhuǎn)基因植株中，Op驅(qū)動(dòng)的GUS基因在整個(gè)植株中表達(dá)水平相對(duì)較低，僅在葉脈組織 中表達(dá)高水平表達(dá)(圖2C)，進(jìn)一步在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在葉片中僅在微管束組織 表達(dá)(圖2F)，與CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因的表達(dá)水平(圖2E)具有顯著 差異。結(jié)果表明，特異性啟動(dòng)子Op能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因在水稻葉片維管束組織中特 異性高水平地表達(dá)。SEQIDNol :-720 GAATTCGTTGTGATTGGATCTGTGTACCTGTTTTGAGTTTTACAGAGAAATCTTATGTTT-661AGCATGGCTAAAGTTCAGCCGTGTTTCTTTCTCTCCTCTCTAGCAAGGACATTTCTAATT-601GGTTCATCACTTGTGTTCTAGGATGTGAAAATTCTAATTGAAGCAATACTTGAATGATGC-541TCACCTGCATGTGTTGTAGGTTGTGAAAAATTTCTAATTGAATCATTGCTTCATGTTGGC-481AATTCATTGCATAATCGTGGTCATTCATTGATTGCATAACGATGTACTCCCTCCGTTCCT-421CCGTTCTATAATATAAAGGATTTTACTTGCACTATTTGACTACTCGTCTTATTTAAAAAT-361TTTAGAATAATTATTTATTTTTTAACTTACTTTATTATCCAAAGTACTTTAAGCACAACT-301TTTCATTTTTTATATTTGCACAAATTTTTTAAACAAGACGAGTGGTCAAACAGTACGAGC-241AGAACCCGAACCCGGTATCGCGGGCGCGTGCATCCGGTGGCGGCCGTGCGCCCACAAGAA-181AAAAACTCAAAATCTCTTATATTATGGGATGGAGAGAGGAAGTATTTTTTCCTCTGAATT-121TATCATTTTTTCCAAAGCATTCATTCAGTTACACAAGCGGGTGTGAAAGAGGTGAGCCCG-61TCGGACGGCCAGGATCGATCCCGCGGTTGTTAAAACCCTAACACCGAGTAAAGAAAA( 3+ 1AGTCGCAGTGGTTGGCCTCGCGAGCCCTATCTCCTCCTTCCTAATCCCCTTTCCCCTCCC61CCTCTCCATTCCCCTCGCCGCCGCCGCCGCCACCGCCGCCGCCGCGGCGCGCCGCCCTCC121TCCTCCTCCCATCCAAGGTGAGACGGCGACATCTCCGGCGTCTCCTTCTCCCCTGCAGCA181CTTACTTGTGATAGATAGTAGGCGCTATGCTTTTACTCGCACTGCATCAGTACTGGTTCC241CGCTTGCAGCAGCTTTTGTTTGGATTGAGGGTTTTTATCCCCTCTTTTTTATTATCAATT301GATTACGTAGTGGTTCAATAGATAGTGGGCAGGGATAGTGTTTGTGATTTCCCCCTTTTT361TTTTCTGAACTTTCTGATTGCACGATTGGGGTTTTAGCACGCGCGGTTAGGTTCCATGGC421TAGATTTGCTCCGTATGAAAGCAGCGAGGGTGTTTGCGAGGTTTGATTCAAGTGTTCTAT481TACTGGGTCGTGTTGTTTAGATGGATTGAGGGTGTTAGTTTAGGAGAAGTTGTCCTCTAG541ATTTGCGAAATCGTAGTAGAGCTGCTCCTCTGATGCTGTTTGACTTGAGTGTCTAAGAGT601AATCTGACCTTTCCTTTTTCCGTTATGGCTTTACTAAAGCAAAGTACATATGTTTTCATG660SEQIDNo2:5'-CAGATCTACCATCTGCATGAAAACATATGGTACTTTGC-3' SEQIDNo3::'-CGAATTCGTTGTGATTGGATCTGTGTACCTG-:
權(quán)利要求
1. 一種植物維管束特異性啟動(dòng)子Op，其核苷酸序列如SEQ ID№1所示。
2. —種植物表達(dá)載體，其特征是含有權(quán)利要求l所述的植物葉片維管束特異性啟動(dòng)子Op。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物表達(dá)載體，所述植物表達(dá)載體是pCAM-Op。
4. 一種轉(zhuǎn)化子，其特征是包含權(quán)利要求l所述的植物葉片維管束特異性啟動(dòng)子Op或 者權(quán)利要求3所述的的植物表達(dá)載體pCAM-Op及宿主。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子為細(xì)胞系，愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)化子，所述宿主為根癌農(nóng)桿菌。
7. 權(quán)利要求1所述植物葉片維管束特異性啟動(dòng)子在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，所述轉(zhuǎn)基因植物為水稻。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是將植物葉片維管束特異性啟動(dòng)子Op插入耙 標(biāo)基因前轉(zhuǎn)化植物，使靶標(biāo)基因在植物葉片維管束中特異性表達(dá)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，是指抗病育種或逆性育種。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種植物葉片維管束特異性表達(dá)的啟動(dòng)子，含有該啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化子，本發(fā)明還涉及上述啟動(dòng)子在植物轉(zhuǎn)基因工程中的應(yīng)用。一種植物葉片維管束特異性啟動(dòng)子，其核苷酸序列如SEQ ID №1所示。發(fā)明人將含有該啟動(dòng)子DNA序列和GUS基因的植物表達(dá)載體經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得轉(zhuǎn)基因植株，經(jīng)染色鑒定，GUS基因僅僅在水稻葉片微管束中特異表達(dá)，因此推測(cè)本發(fā)明提供的啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)外源抗逆基因在植物葉片微管束中特異表達(dá)，可應(yīng)用于定向培育安全性高的轉(zhuǎn)基因植物新品種。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101265472SQ20081010605
公開日2008年9月17日 申請(qǐng)日期2008年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月8日
發(fā)明者何晨陽, 吳茂森, 柏亞男 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所