一種植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明提供了一種受水楊酸和稻瘟病菌的雙誘導(dǎo)的植物維管束發(fā)育基因 sm-Nvas，該基因用于水稻抗稻瘟病和白葉枯病分子育種，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物維管束系統(tǒng)包含木質(zhì)部和韌皮部，都由原形成層細(xì)胞發(fā)育而來(lái)。原形成層細(xì) 胞具有強(qiáng)大的功能，形成的木質(zhì)部和韌皮部存在于各種特化的組織器官中，比如葉、莖和根 等。維管束在植物體內(nèi)形成束狀，連接植物的各個(gè)部位，為植物提供水、養(yǎng)分及植物生長(zhǎng)所 必要的其它物質(zhì)。在植物的分生組織細(xì)胞中，韌皮部、原形成層、木質(zhì)部細(xì)胞系在早期就特 定發(fā)育和分化，這一系列事件的發(fā)生通常需要特異基因直接或間接的作用。
[0003] VASCULAR-RELATEDNAC-DOMAIN(VND)的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子VND6 和VND7 分別促進(jìn)后 生木質(zhì)部和初生木質(zhì)部的分化。產(chǎn)生于韌皮部的II)IF(CLE41/CLE44)在抑制木質(zhì)部分化的 同時(shí)還增加原形成層細(xì)胞的增殖。PXY/TDR對(duì)于維持形成層細(xì)胞的分裂和木質(zhì)部、韌皮部 的空間排布是必需的。TDIF作為信號(hào)分子與其受體PXY/TDR介導(dǎo)韌皮部和木質(zhì)部之間的 信號(hào)傳遞，兩者相互作用能夠維持形成層干細(xì)胞的活力，并調(diào)控其向木質(zhì)部的分化。W0X4 在原形成層和形成層中優(yōu)先表達(dá)，在TDR/TDIF的作用下表達(dá)量上調(diào)。遺傳分析顯示W(wǎng)0X4 基因在促進(jìn)原形成層和形成層的增殖是必需的，但對(duì)于原形成層分化為木質(zhì)部卻不是必需 的。利用功能缺失突變體的實(shí)驗(yàn)證實(shí)在二次生長(zhǎng)過(guò)程中TDIF-TDR-W0X4對(duì)維管束分生組織 的維持起著關(guān)鍵作用。植物GTs對(duì)糖的修飾作用與木質(zhì)部和韌皮部的發(fā)育和形成具有密切 的關(guān)聯(lián)性。Persson等在擬南芥突變株中發(fā)現(xiàn)隨著擬南芥細(xì)胞壁中木聚糖的含量下降，將引 起莖維管束和維管束間纖維細(xì)胞壁的不平坦而引起木質(zhì)部坍塌，進(jìn)而影響木質(zhì)部的功能發(fā) 揮。在白楊樹中，木聚糖和甘露糖對(duì)次級(jí)壁的產(chǎn)生是必須的，而次生木質(zhì)部的發(fā)育與次級(jí)壁 又相關(guān)聯(lián)，說(shuō)明在木質(zhì)部發(fā)育過(guò)程中需要相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶來(lái)實(shí)現(xiàn)。在稻科植物中，木聚糖 在a-(l，2)-或a-(l，3)-與阿拉伯糖相連，GT61家族蛋白對(duì)阿拉伯糖基木聚糖生物合 成起著重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas，將該基因?qū)胫林仓曛?，均?dǎo) 致轉(zhuǎn)基因植株矮化、莖和葉脈增粗、葉脈增多等表型特征，該基因的核苷酸序列如SEQID NO: 1所示，由1392個(gè)堿基組成。該基因所編碼的多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNO: 2所 示，由463個(gè)氨基酸組成。
[0005] 在抗性鑒定中發(fā)現(xiàn)，該基因在水稻中具有增強(qiáng)稻瘟病抗性等特征。因此該植物維 管束發(fā)育基因sm-Nvas能夠應(yīng)用于培育抗稻瘟病的水稻品種中，具體包括以下步驟：
[0006] (1)、根據(jù)植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas，構(gòu)建超量表達(dá)載體；
[0007] (2)、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻品種，利用甲基茉莉酸和水 楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)目的基因；
[0008] (3)、該品種對(duì)稻瘟病菌表現(xiàn)出抗菌性。
[0009] 在抗性鑒定中發(fā)現(xiàn)，該基因在擬南芥和油菜等農(nóng)作物中具有菌核病抗性，因此該 植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas能夠應(yīng)用于培育抗菌核病的農(nóng)作物品種中，具體包括以下步 驟：
[0010] (1)、根據(jù)權(quán)利要求1所提供的植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas，構(gòu)建超量表達(dá)載體；
[0011] (2)、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)作物品種，利用甲基茉莉酸和 水楊酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)目的基因；
[0012] (3)、以上品種對(duì)菌核病均表現(xiàn)出抗菌性。
[0013] 本發(fā)明在前期工作中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)植株矮化、莖桿增粗、葉脈增多等特征的煙草突 變體。以該突變體為材料克隆了一個(gè)新的受茉莉酸甲酯（MeJA)及水楊酸（SA)雙重誘導(dǎo)的 UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶家族的新成員，細(xì)胞學(xué)觀察和組織特異性研宄結(jié)果揭示該基因的生物學(xué)功 能與煙草的維管束發(fā)育相關(guān)。在sm-Nvas超表達(dá)的煙草（W38)和擬南芥（Col-0)轉(zhuǎn)基因植 株中，均導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株矮化、莖和葉脈增粗、葉脈增多等表型特征。
【附圖說(shuō)明】
[0014] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例中所提供的轉(zhuǎn)sm-Nvas基因的擬南芥植株菌核病抗性對(duì)照 圖；
[0015] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例中所提供的轉(zhuǎn)sm-Nvas基因擬南芥植株的基因表達(dá)圖；
[0016] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例中所提供的轉(zhuǎn)sm-Nvas基因水稻稻瘟病抗性對(duì)照?qǐng)D。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)具體的說(shuō)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍 并不局限于以下實(shí)施例。
[0018] 本發(fā)明實(shí)施例中所用的技術(shù)，除非特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的常規(guī) 技術(shù)；所用的儀器設(shè)備、試劑等，除非特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的研宄和技術(shù)人員可以通過(guò)公 共途徑獲得。
[0019] 1、煙草突變體的獲得及鑒定
[0020] 采用的煙草突變體表現(xiàn)出植株矮化、莖桿增粗、葉脈增多等表型；對(duì)突變體和野生 型葉脈和莖進(jìn)行石蠟切片，細(xì)胞學(xué)觀察均顯示維管束列數(shù)和管狀分子數(shù)明顯增多，維管束 長(zhǎng)度和薄壁細(xì)胞長(zhǎng)度有所縮短，推測(cè)該表型的產(chǎn)生與維管束發(fā)育有關(guān)。
[0021] 2、植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas的克隆
[0022] 通過(guò)差異展示技術(shù)從煙草突變體中分離了一個(gè)RNA表達(dá)水平明顯高于野生型 (W38)植株的cDNA序列，利用RACE技術(shù)獲取了基因的全長(zhǎng)cDNA，利用全長(zhǎng)cDNA為探針篩 選基因組文庫(kù)，獲取了序列為1392個(gè)核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，此基因即為植物維 管束發(fā)育基因sm-Nvas，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)該基因編碼463個(gè)氨基酸，其氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
[0023] 3、植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas的遺傳轉(zhuǎn)化
[0024] (1)轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)基配方
[0025] 1)鐵鹽（Fe2EDTA)貯存液（100X)的配制
[0026] 準(zhǔn)備800ml雙蒸水并加熱至70°C，加入乙二銨四乙酸二鈉（Na2EDTA? 2H20)3. 73 克，充分溶解后在70°C水浴中保持2小時(shí)，定容至1000ml，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027] 2)維生素貯存液（100X)配制
[0028]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. -種由權(quán)利要求1所述的植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas編碼的多肽片段，其特征在 于：該多肽片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3. 權(quán)利要求1所述的植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas在培育抗稻瘟病的水稻品種中的應(yīng) 用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟： (1) 、根據(jù)權(quán)利要求1所提供的植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas，構(gòu)建超量表達(dá)載體； (2) 、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入水稻品種，利用甲基茉莉酸和水楊酸 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)目的基因； (3) 、該品種對(duì)稻瘟病菌表現(xiàn)出抗菌性。
5. 權(quán)利要求1所述的植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas在培育抗菌核病的農(nóng)作物品種中的 應(yīng)用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于包括以下步驟： (1) 、根據(jù)權(quán)利要求1所提供的植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas，構(gòu)建超量表達(dá)載體； (2) 、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)作物品種，利用甲基茉莉酸和水楊 酸誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在植物細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)目的基因； (3) 、以上品種對(duì)菌核病均表現(xiàn)出抗菌性。
【專利摘要】本發(fā)明公開了植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas的核苷酸序列、菌核病和稻瘟病抗性特征及其抗病性在作物育種的應(yīng)用。該方法包括下列步驟，首先煙草突變體的獲得及鑒定；其次是植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas的克隆；第三是植物維管束發(fā)育基因sm-Nvas的遺傳轉(zhuǎn)化(受體包括水稻、擬南芥等)；第四是轉(zhuǎn)基因植株抗病性的鑒定(水稻：稻瘟病；擬南芥及油菜：菌核病)；第五是該基因抗病性在作物育種的應(yīng)用。本發(fā)明所涉及核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；擬南芥菌核病抗性特征如附圖1所示；水稻稻瘟病抗性特征如附圖3所示。
【IPC分類】C07K14-415, C12N15-29, A01H5-00, C12N15-84
【公開號(hào)】CN104531723
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510051757
【發(fā)明人】劉學(xué)群, 譚艷平, 王春臺(tái), 徐鑫, 盧衛(wèi)
【申請(qǐng)人】中南民族大學(xué)
【公開日】2015年4月22日
【申請(qǐng)日】2015年1月31日