專利名稱：含有人源原癌基因c-Ha-ras的轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制作癌癥轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的方法；該動(dòng)物模型在多種癌 癥的癌變機(jī)理研究、致癌物或抑癌物的篩選研究、藥物的臨床前安全 性評(píng)價(jià)研究中的用途；以及由該模型動(dòng)物衍生出來的細(xì)胞、組織、器 官及胚胎及其在上述領(lǐng)域中的用途。
背景技術(shù)：
自80年代初首例轉(zhuǎn)基因小鼠誕生以來，已經(jīng)建立和發(fā)展了較多的 基因?qū)敕椒ǎ@微注射、反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移、胚胎干 細(xì)胞技術(shù)、核移植技術(shù)、基因敲除(敲入)技術(shù)與RNA干涉，以及精子 載體等，并由此也產(chǎn)生了眾多專利(美國專利US6576811B1，2003)。
其中，因?yàn)槠浞€(wěn)定性和成功率較高，顯微注射方法成為轉(zhuǎn)基因的最 為常用的方法之一。它是將含有重組DNA的溶液直接注射進(jìn)入胚胎 中，在多數(shù)情況下，是將DNA注射到雄性前核中。在精制用于顯微注 射的DNA溶液時(shí)， 一般采用酶切、回收目的DNA片段，凝力交DNA 純化等步驟獲得純凈的DNA樣品。合適的顯微注射針和持定針是把 DNA成功注射入0.5天的胚胎雄性前核的關(guān)鍵。胚胎的質(zhì)量也是轉(zhuǎn)基 因成功的關(guān)鍵，良好的胚胎形狀規(guī)則，飽滿。
把經(jīng)顯微注射的胚胎移植到假孕母鼠受體是一項(xiàng)技術(shù)性強(qiáng)但很直 接的一項(xiàng)外科技術(shù)，它的全套操作必須做到無菌，快速和靈巧。待假 孕鼠懷孕生仔后，通過剪取幼仔尾尖或者通過打孔器取得部分耳闊， 獲取2 4周齡的可能的轉(zhuǎn)基因首建鼠的組織樣品，用于提取DNA， 通過PCR或者Southern雜交技術(shù)確定目的基因的整合情況。
小鼠在6 8周齡性成熟時(shí)可以用于交配建系。出生的轉(zhuǎn)基因后代 也通過PCR或Southern雜交方法鑒定，留存含有轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物，進(jìn)一 步繁殖擴(kuò)大，以便實(shí)現(xiàn)①通過幾代的繁育來觀察轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和遺傳 性；②擴(kuò)大群體數(shù)量為試驗(yàn)研究提供更多的小鼠；以及③產(chǎn)生純合轉(zhuǎn)進(jìn)行比較。
疾病動(dòng)物模型的建立是轉(zhuǎn)基因研究的重要領(lǐng)域，其中癌癥動(dòng)物模型 的建立尤為受到重視。這是因?yàn)?，癌癥是威脅當(dāng)今人類生命的第二大
疾病。據(jù)WHO報(bào)道，2005年全球有5800萬人因病死亡，二其中有 13%為罹患癌癥死亡。世界各國不斷投入大量的資金和人力用于癌癥發(fā) 生機(jī)理研究和治療性藥物的研制(Wynn, 2007; Clin InvesU 17:524-529; Galanski and Keppler， 2007， Anticancer Agents Med Chem, 7: 55-73)。但 是，無論是在基礎(chǔ)研究領(lǐng)域還是在藥物研發(fā)領(lǐng)域，都會(huì)遇到因缺乏合 適的評(píng)價(jià)手段和研究平臺(tái)而導(dǎo)致工作停滯不前的被動(dòng)局面，為適應(yīng)這 一需求，各種通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段對(duì)受體動(dòng)物基因組進(jìn)行改造的遺 傳修飾動(dòng)物模型(Genetic Modified Animal model)應(yīng)運(yùn)而生(Barone M etal， 2006， Mol Med， 12:115-23; Choedon et al, 2006， World J Gastroenterol, 12: 2517-2522)。癌癥轉(zhuǎn)基因小鼠模型的出現(xiàn)有力的推動(dòng) 了癌癥研究的發(fā)展，它是在分子水平和整體水平開展有關(guān)癌發(fā)生、發(fā) 展、轉(zhuǎn)移(Tanakaeta1，2006， AnnN Y Acad Sci. 2006, 1086:1-10)和防 治石開究(Galanski and Keppler, 2007， Anticancer Agents Med Chem, 7: 55-73)的良好活體材料，也是癌相關(guān)藥物研制、新藥安全性評(píng)價(jià)的優(yōu) 良平臺(tái)(Mitsummori，2003， J Toxicol Sci. 28: 371-383)。從中獲得的信 息和數(shù)據(jù)、以及這些數(shù)據(jù)與人體的相關(guān)性是其它離體手段難以取代的。
對(duì)于致癌性評(píng)價(jià)而言，傳統(tǒng)的致癌性實(shí)驗(yàn)多采用大小鼠進(jìn)行，時(shí)間 長(需2年)、費(fèi)用高、結(jié)果針對(duì)性差。鑒于此，ICH等國際機(jī)構(gòu)倡用 導(dǎo)新的手段來評(píng)價(jià)藥物的致癌性，轉(zhuǎn)基因癌癥動(dòng)物模型是理想替代手 段。因此，建立優(yōu)秀的癌癥動(dòng)物模型十分必要。
rasH2轉(zhuǎn)基因小鼠和大鼠(美國專利US6576811 Bl)就是此類癌癥 轉(zhuǎn)基因模型之一。該小鼠模型最先由日本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心研究所于1989 年建立(Katsukietal， 1989)，導(dǎo)入的是人的正常全長ras基因(c-//"-my) (Sekiya et al, 1985)。 c-//a-ras是ras原癌基因家族的一員，編碼由189 個(gè)氨基酸組成的p21蛋白。p21蛋白是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)中的重要信 號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，對(duì)細(xì)胞的增殖和分化起著調(diào)節(jié)作用(Douglas R, 1993)。 r似基因第12、 13、 61位編碼子突變可引起p21蛋白構(gòu)象改變，導(dǎo)致 發(fā)生多種癌癥(Mitsummori,2003)。 rasH2癌癥模型在致癌性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方面有著十分重要的用途。根據(jù)2003年國際生命科學(xué)研究所(ILSI)， 環(huán)境與健康科學(xué)研究所(HESI)和國際毒理項(xiàng)目(NTP)等多家國際 機(jī)構(gòu)對(duì)幾十種已知遺傳毒性致癌物的聯(lián)合測(cè)試，發(fā)現(xiàn)該模型能夠準(zhǔn)確 的區(qū)分致癌物和非致癌物，反應(yīng)靈敏，結(jié)果可靠，實(shí)驗(yàn)周期僅需26周， 是符合ICH新藥短期致癌性檢測(cè)指導(dǎo)原則的最佳替代模型(替代傳統(tǒng) 2年期大小鼠致癌性實(shí)驗(yàn))。
在誘導(dǎo)致癌的機(jī)理研究方面業(yè)己做了大量的工作，加深了人們對(duì) 致癌機(jī)理的認(rèn)識(shí)(Mitsummori, 2003)。起初人們認(rèn)為，轉(zhuǎn)入多拷貝人 原癌基因后，為化學(xué)致癌物將原癌基因轉(zhuǎn)化為癌基因提供了更多耙點(diǎn)
(Saitoh etal, 1990， Oncogene, 5: 1195-1200)，致使該模型對(duì)致癌物更 為敏感。轉(zhuǎn)基因點(diǎn)突變活化也是一個(gè)原因，如前胃和皮膚乳頭瘤的產(chǎn) 生(Ando et al， 1992， Cancer Res, 52: 978-982; Mori et al， 2000, Toxicol. Pathol. 13: 165-172);但對(duì)肝腫瘤而言，與點(diǎn)突變的相關(guān)性不甚明確
(Hayashi et al， 1998， Toxicol. Pathol. 26: 556-561 )。后來的研究顯示， 過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物與癌變信號(hào)通路中其它的癌基因和抑癌基因相互 作用可能是該模型對(duì)致癌物敏感的深層原因(Tamaoki， 2001， Toxicol Pathol. 29 suppl: 81-89)。在致癌物誘導(dǎo)下，鼠內(nèi)源ros基因表達(dá)上調(diào)， cfo"， 0m7， rect ge/so//"等癌相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平改變的事實(shí)(Okamura M,etal,2007， Cancer Lett. 245: 321-330)為這一假設(shè)提供了部分證據(jù)。 盡管如此，由于該模型的基因來源于一個(gè)腫瘤病人(SekiyaTetal， 1984; 1985)，原本已經(jīng)發(fā)生突變。為了獲得正常的轉(zhuǎn)基因，不得不經(jīng) 過多步分子生物學(xué)操作，校正突變位點(diǎn)。另一方面，該模型的轉(zhuǎn)基因 較大，在5-端有較長的"冗余"序列。這些不足會(huì)給基因操作增加難 度，而且不利于重復(fù)。
鑒于此，本申請(qǐng)人在實(shí)際工作中，構(gòu)建了含有人原癌基因c-Ha-ras 的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型。該模型的轉(zhuǎn)基因來自于正常人基因組，分離完成 后可直接用于轉(zhuǎn)基因。對(duì)轉(zhuǎn)基因進(jìn)行了優(yōu)化，比以前使用的轉(zhuǎn)基因在 5-端減少了 0.4kb。
更為重要的是，獲得的動(dòng)物模型具有獨(dú)到的表型。以前的轉(zhuǎn)基因 屬于誘導(dǎo)型模型，其外觀和體重與正常鼠幾乎無異
(http:〃www.rash2.com/-phenotype)， 一般只有在給予陽性致癌物時(shí)才
6誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤，自發(fā)瘤的幾率很低(<1.1%)，發(fā)生吋間晚(8 27周， 皮膚鱗狀細(xì)胞乳頭瘤，http:〃www.rash2.com/-background data)。而本 研究獲得的首建鼠出生后2周左右，即在背部自發(fā)產(chǎn)生可見瘤狀物， 生長速度快，并且由一處發(fā)展成多處。也就是說，與日本的rasH2模 型相比，本研究獲得的癌癥轉(zhuǎn)基因模型由誘導(dǎo)型變成了自發(fā)型，發(fā)生 的時(shí)間較之早，表明可以作為一個(gè)新的癌癥動(dòng)物模型，用于癌癥發(fā)生 機(jī)理研究。主要表現(xiàn)在本模型為自發(fā)型，而且發(fā)生時(shí)間比日本msH2 模型早，這暗示了本模型可能對(duì)于致癌物的反應(yīng)比rasH2更為敏感， 更適合用于癌癥發(fā)生機(jī)理方面的研究。鑒于人類癌癥發(fā)生的深層原因 是"人體本身與環(huán)境因素長期相互作用的結(jié)果"，而一般情況下，人 體接觸類似大劑量強(qiáng)致癌物的幾率很低，所以有理由相信，自發(fā)型模 型得出的有關(guān)癌癥機(jī)理的數(shù)據(jù)比誘發(fā)型更接近人體真實(shí)。此外，本模 型是轉(zhuǎn)基因現(xiàn)象學(xué)研究的良好材料。已有研究表明，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)強(qiáng) 烈的受到宿主染色體整合位點(diǎn)的影響，轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平的高低與拷貝 數(shù)的關(guān)系不甚明星，而與整合位點(diǎn)有關(guān)。本研究中獲得轉(zhuǎn)基因首建鼠 在早期即出現(xiàn)了瘤狀物，暗示了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平高或發(fā)生突變(奚 濤，2001，藥物生物技術(shù)，2001， 8: 301-305)。本模型與日本的模型 進(jìn)行比較研究，可回答插入位點(diǎn)與轉(zhuǎn)基因表達(dá)的關(guān)系等基本問題。因 此，在基礎(chǔ)研究方面，本模型也必將有著重要的用途。
腫瘤的自發(fā)性與宿主的遺傳背景有較大的關(guān)系。自發(fā)腫瘤對(duì)模型 動(dòng)物在安全評(píng)價(jià)中應(yīng)用是不利的，因?yàn)樽园l(fā)腫瘤會(huì)與有致癌性風(fēng)險(xiǎn)的 待試物誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤混淆。為了解決這一問題，可與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物C57 與另一個(gè)近交系如BALB/c雜交，使用產(chǎn)生的F1即可。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及含有人源原癌基因c-Ha-ras的轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法 及其用途。該動(dòng)物模型被人為的轉(zhuǎn)入了人源原癌基因c-Ha-ras。該基因 來自人體正常組織，轉(zhuǎn)基因含有該基因的調(diào)控序列、全部外顯子和內(nèi) 含子，以充分保證所表達(dá)蛋白的完整性。實(shí)施該發(fā)明的途徑主要有顯 微注射法，是本發(fā)明的實(shí)施方案之一。首先從人體組織中分離基因， 經(jīng)過多級(jí)純化精制獲得轉(zhuǎn)基因，經(jīng)顯微注射方法注入鼠胚胎中，然后移植到假孕鼠體內(nèi)；經(jīng)過分子生物學(xué)方法檢測(cè)，獲得含有轉(zhuǎn)基因的陽 性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物；進(jìn)一步交配建系，獲得轉(zhuǎn)基因動(dòng)物種群。在此基礎(chǔ)上， 可以進(jìn)一步獲得該動(dòng)物模型的細(xì)胞、器官及胚胎。
本發(fā)明所述的人原癌基因c-Ha-ras，其序列如SEQ1DN0: 1所示。 所述的人原癌基因c-Ha-ras含有4個(gè)編碼外顯子、啟動(dòng)子區(qū)域及多聚 腺苷酸加尾信號(hào)序列polyA。其中所述的啟動(dòng)子是嚙齒類絨毛蛋白啟動(dòng) 子、巨細(xì)胞病毒CMV的啟動(dòng)子；所述的加尾序列是SV40、 BGH的 polyA信號(hào)序列。
本發(fā)明還包括含有所述的人原癌基因c-Ha-ras的宿主細(xì)胞，以及 由所述的宿主細(xì)胞形成的組織，器官。
本發(fā)明涉及所述的宿主細(xì)胞、組織或器官在致癌物篩選或評(píng)價(jià)、 抑癌物的篩選、藥物的安全性評(píng)價(jià)中的用途；在毒理學(xué)中的用途和在 免疫毒理學(xué)中的用途。
本發(fā)明涉及制備基因組中含有所述的人原癌基因c-Ha-ras的嚙齒
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(1) 分離獲得人原癌基因c-Ha-ras基因；
(2) 通過超排卵、交配、受精卵篩選分離步驟獲得嚙齒類受精卵；
(3) 通過顯微注射方法將c-Ha-ms基因注入受精卵中，獲得含有人 原癌基因c-Ha-ras的嚙齒類受精卵；
本發(fā)明還涉及制備基因組中含有所述的人原癌基因c-Ha-ras的嚙 齒類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，步驟為
(1) 制作輸精管結(jié)扎雄鼠，然后讓其與正常的發(fā)情期雌鼠交配，獲 得假孕鼠；
(2) 將如權(quán)利要求9所述的受精卵直接移植或者在C02培養(yǎng)箱中 過夜培養(yǎng)至2細(xì)胞時(shí)移植入假孕鼠的輸卵管內(nèi)；
(3) 讓假孕鼠生仔，待離乳后通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因 陽性子代，即首建鼠；
(4) 在首建鼠性成熟后進(jìn)行交配建系，獲得該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
本發(fā)明的有益效果在于本申請(qǐng)人對(duì)人原癌基因c-Ha-ras進(jìn)行了優(yōu) 化，使其比現(xiàn)有技術(shù)中的轉(zhuǎn)基因在5-端減少了0.4kb。更為重要的是，提供本發(fā)明的方法獲得的動(dòng)物模型具有獨(dú)到的表型，所獲得的首建鼠 出生后2周左右，即在背部自發(fā)產(chǎn)生可見瘤狀物，生長速度快，并且 由一處發(fā)展成多處。即本發(fā)明獲得的癌癥轉(zhuǎn)基因模型為自發(fā)型，發(fā)生 的時(shí)間較早，表明可以作為一個(gè)新的癌癥動(dòng)物模型，用于癌癥發(fā)生機(jī) 理研究。
此外，本模型是轉(zhuǎn)基因現(xiàn)象學(xué)研究的良好材料。己有研究表明， 轉(zhuǎn)基因的表達(dá)強(qiáng)烈的受到宿主染色體整合位點(diǎn)的影響，轉(zhuǎn)基因表達(dá)水 平的高低與拷貝數(shù)的關(guān)系不甚明星，而與整合位點(diǎn)有關(guān)。本研究中獲 得轉(zhuǎn)基因首建鼠在早期即出現(xiàn)了瘤狀物，暗示了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平高
或發(fā)生突變(奚濤，2001，藥物生物技術(shù)，2001， 8: 301-305)。本模
型與日本的模型進(jìn)行比較研究，可回答插入位點(diǎn)與轉(zhuǎn)基因表達(dá)的關(guān)系 等基本問題。因此，在基礎(chǔ)研究方面，本模型也必將有著重要的用途。 腫瘤的自發(fā)性與宿主的遺傳背景有較大的關(guān)系。自發(fā)腫瘤對(duì)模型 動(dòng)物在安全評(píng)價(jià)中應(yīng)用是不利的，因?yàn)樽园l(fā)腫瘤會(huì)與有致癌性風(fēng)險(xiǎn)的 待試物誘導(dǎo)產(chǎn)生的腫瘤混淆。為了解決這一問題，可與轉(zhuǎn)基因動(dòng)物C57 與另一個(gè)近交系如BALB/c雜交，使用產(chǎn)生的F1即可。


圖1顯示本發(fā)明所用c-Ha-ms基因的結(jié)構(gòu)示意圖及與現(xiàn)有技術(shù)中 (美國專利US6576811B1)公開的基因的長度對(duì)比。本發(fā)明所用轉(zhuǎn)基 因長度為6.5 kb (圖l-A)，含有4個(gè)外顯子，依次為Exl， Ex2， Ex3 和Ex4，以實(shí)心方框表示；現(xiàn)有技術(shù)公開的轉(zhuǎn)基因?yàn)?.9kb (圖l-B)， 在5'端側(cè)翼區(qū)比本發(fā)明所述的c-Ha-ras基因多出0.4kb。圖中表明了與 全基因拼接相關(guān)的酶切位點(diǎn)。
圖2顯示轉(zhuǎn)基因c-Ha-ms的全序列。畫線部分為4個(gè)外顯子區(qū)域。 圖3顯示轉(zhuǎn)基因c-Ha-ms的分離策略。從正常人血液中分離基因 組DNA，然后采用PCR方法分別擴(kuò)增5，端1991bp、中段的1853bp， 以及3'端的3180bp。擴(kuò)增的1853bp片段5'端含有Kpnl位點(diǎn)，而在3' 端，添加EcoRI位點(diǎn)。擴(kuò)增片段用Kpnl+EcoRI雙切，獲得1400 bp的 片段，插入同樣雙切的pUC19載體中，獲得第一個(gè)中間載體pUC19-1400。然后將擴(kuò)增的1991bp片段用HindlII+Kpnl，獲得具有兩 個(gè)粘端的l卯0bp片段，插入上述中間載體pUC19-1400，獲得第二個(gè) 中間載體pUC19-3300。將擴(kuò)增獲得3180 bp的片段測(cè)序后，用EcoRI 再次切下，并將pUC19-3300用EcoRI線性化，并將3180片段插入， 獲得含有全長轉(zhuǎn)基因c-Ha-ms載體pUC19-6500。由于3180bp片段兩 端均為EcoRI位點(diǎn)，需要對(duì)插入的方向進(jìn)行鑒定，以獲得插入方向正 確的載體。
圖4顯示首建鼠在出生2周內(nèi)即在背部發(fā)生多處瘤狀物(箭頭所 示)。首先出現(xiàn)的前背部，圓形，較堅(jiān)硬，約2x3mm大小，生長速度 快，6周左右最大者達(dá)lxl cm，并且由一處發(fā)展成多處。這一特性在 以前同類模型中未見描述。
圖5顯示首建鼠的自發(fā)腫瘤。在出生后一年左右，有兩只首建鼠 在頸部出現(xiàn)顯著腫瘤， 一只在后背部出現(xiàn)顯著腫瘤。圖4-A，在頸部出 現(xiàn)明顯的腫瘤；圖4-B，在肺部發(fā)現(xiàn)多處腫瘤，箭頭所示其中較大者圖。 4-C，從小鼠身體分離下來腫瘤，箭頭所示在大的腫瘤內(nèi)部含有多個(gè)小 型腫瘤；圖4-D，顯示分離下來的長有腫瘤的肺葉。即使在這些轉(zhuǎn)基因 陽性小鼠發(fā)生明顯腫瘤時(shí)Z而其同窩轉(zhuǎn)基因陰性小鼠表型正常。
圖6顯示轉(zhuǎn)基因的突變檢測(cè)。從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物首建鼠、包括其子代 的尾尖組織提取DNA，通過高保真PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因的部分片段。該片 段長1853bp，包含c-Ha-ras基因的4個(gè)外顯子，也既是包含了易發(fā)生 突變的部位，即12， 13和61位氨基酸編碼子。將PCR擴(kuò)增所得片段 經(jīng)T-A克隆后測(cè)序，并通過DNAssist軟件進(jìn)行序列比對(duì)。圖中Sequence 0為原始序列，以此為基準(zhǔn)，圖6-A中，第96-98堿基、99-101堿基分 別編碼12、 13氨基酸；圖6-B中，第510-512堿基編碼第61位氨基酸。 可見，這3個(gè)敏感位點(diǎn)均未發(fā)生突變。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:人源原癌基因c-Ha-ras DNA的分離 1.人源原癌基因c-Ha-ras DNA的結(jié)構(gòu)
本發(fā)明涉及基因組中整合了含有人源原癌基因c-Ha-ras DNA的嚙齒類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制作方法。本發(fā)明所用轉(zhuǎn)基因(Tmnsgene)為c-Ha-ras 基因，全長6.5kb，含有4個(gè)外顯子，含有該基因本身的啟動(dòng)子、調(diào)控 序列和polyA信號(hào)序列。它來自于正常人血液組織，比前文獻(xiàn)報(bào)道所 用轉(zhuǎn)基因短0.4kb (圖l)，其全長序列見圖2。 2.人源原癌基因c-Ha-rasDNA的分離
在之前的文獻(xiàn)報(bào)道中，轉(zhuǎn)基因c-Ha-ras DNA獲得采用構(gòu)建文庫的方 式進(jìn)行(SekiyaTetal, 1984; 1985)，分離基因的起始DNA來自 一名惡 性黑色瘤日本病人。由于該原癌基因的12、 13和61位氨基酸易發(fā)生 突變，突變后往往導(dǎo)致該基因的活化，并進(jìn)一步誘發(fā)癌變。而來自腫 瘤組織的DNA往往已經(jīng)發(fā)生突變，這對(duì)進(jìn)一步顯微注射不利。在以前 的文獻(xiàn)報(bào)道中，多采用分子生物學(xué)方法進(jìn)行改造，獲得完整的未發(fā)生 突變的轉(zhuǎn)基因，增加較多的工作量。
由于文庫構(gòu)建是一個(gè)較復(fù)雜，較費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作。而PCR技術(shù)如 今已很成熟，故本發(fā)明采用PCR方法分段擴(kuò)增、T-A克隆測(cè)序，然后 拼接成完整基因的策略。根據(jù)序列特征，將基因分成前、中、后三段 進(jìn)行分離(圖3)。首先從正常人血液中分離基因組DNA，然后采用 PCR方法分別擴(kuò)增5'端長度為1991bp的片段，擴(kuò)增的引物對(duì)為 Pri .F6506 :gctaagcttggtcccggcggatcccagcctttc 禾口 Pri.R371 :gagaattccagcctctccctggtacctctcatgcc; 為了便于連接，在前端弓1 物Pri,F6506中添加了酶切位點(diǎn)HindIII;中段的1853bp的片段，擴(kuò)增 的引物對(duì)為Pri.F4886:gct^g^ggcaggtggggcaggagaccctgtag，在引物中 f忝力口 了 HindIII {立點(diǎn)，禾口 Pri.RN1735: gcg§^ctgcggtcagcagcctcccttgtgcc， 在引物中添加了EcoRI位點(diǎn)；以及3'端的3180bp片段，擴(kuò)增采用的引 物對(duì)為Pri.FN 1735: acg^etcctgacgcaggtgagggggactc，在引物中添加了 EcoRI，禾口 Pri.RXN(E): gctg^^aatgagggatccctggagggatgcctggtg，也在弓l 物中添加了EcoRI位點(diǎn)。擴(kuò)增的1853bp片段5'端含有Kpnl位點(diǎn)，而 在3，端，添加EcoRI位點(diǎn)。將該擴(kuò)增片段用Kpnl+EcoRI雙切，回收 1400bp的片段，插入同樣雙切的pUC19載體中，獲得第一個(gè)中間載體 pUC19-1400。然后將擴(kuò)增的1991bp片段用HindlII+Kpnl，插入用中間 載體pUC19-1400，獲得第二中間載體pUC19-3300。將擴(kuò)增獲得3180 bp 的片段經(jīng)T-A克隆測(cè)序后，用EcoRI再次切下，回收純化，并將pUC19-3300用EcoRI線性化，并將3180片段插入，獲得含有全長轉(zhuǎn) 基因c-Ha-ras載體pUC9-6500。由于380bp片段的兩端均為EcoRl 位點(diǎn)，所以需對(duì)插入的方向進(jìn)行鑒定，將插入方向正確的質(zhì)粒保存用 于轉(zhuǎn)基因的擴(kuò)增。
實(shí)施例2:人源原癌基因c-Ha-ras DNA的導(dǎo)入
如本領(lǐng)域人員所知，通過顯微注射(Microinjection )生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 的過程包括以下多個(gè)步驟(1)制備不育雄鼠和假孕母鼠；(2)超排卵； (3)收獲受精卵；(4)目的DNA的制備；(5)將目的DNA導(dǎo)入受精卵；
(6)受精卵的移植；(7)首建鼠Founder中目的DNA整合情況的檢 測(cè)；(8)通過雜交繁育轉(zhuǎn)基因小鼠品系。在本發(fā)明中，顯微注射方法 均根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行的，故不作更多的敘述。但是，本發(fā)明在實(shí)施過 程中，建立了一種適用的將DNA溶液注入顯微注射針的方法，此方法 可在2分鐘左右完成DNA溶液的填充，非常迅速。這一技術(shù)大大推進(jìn) 了顯微注射工作進(jìn)程(生物技術(shù)通訊，2007年04期)。
實(shí)施例3:轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的選擇
任何適當(dāng)?shù)膰X類動(dòng)物可作為受體動(dòng)物以用于生產(chǎn)本發(fā)明所述的 "轉(zhuǎn)基因動(dòng)物"。顯然，"轉(zhuǎn)基因動(dòng)物"還包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物所產(chǎn)生的新生兒、 年幼的子代、發(fā)育成熟的動(dòng)物及其胚胎；以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的子代的新 生兒、年幼的子代、發(fā)育成熟的動(dòng)物及其胚胎。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物及其子代 的例子包括小鼠、大鼠、豚鼠等等，優(yōu)選的嚙齒類動(dòng)物是小鼠，如C57 小鼠。這是引物C5.7為成熟的近交系，遺傳背景清楚，穩(wěn)定，而且其 受精卵適合做顯微注射，相對(duì)易于制作模型動(dòng)物。
實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的表型
本發(fā)明獲得的首建鼠具有新的表型。日本rasH2屬于誘導(dǎo)型模型， 其外觀和體重與正常鼠幾乎無異(http:〃www.rash2.com/-phenotype)， 一般只有在給予陽性致癌物時(shí)才誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤，自發(fā)瘤的幾率很低(< 1.1%)，發(fā)生時(shí)間晚(8 27周，皮膚鱗狀細(xì)胞乳頭瘤， http:ASvww.rash2.com/-backgrounddata)。而本研究獲得的首建鼠出生后2周左右，即在背部自發(fā)產(chǎn)生可見瘤狀物(圖4)，生長速度快，6 周左右最大者達(dá)1X1 cm，并且由一處發(fā)展成多處。也就是說，與曰本 的相比，本研究獲得的癌癥轉(zhuǎn)基因模型由誘導(dǎo)型變成了自發(fā)型，發(fā)生 的時(shí)間較之早。在該模型出生1年后，在頸部即出現(xiàn)明顯的瘤(圖5)， 生長極其迅速。解剖后，在肺部肉眼可見多處腫瘤(圖5-B， D)。
在有關(guān)rw基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型研究中，在出生后兩周即出現(xiàn) 瘤狀物的模型尚未見報(bào)道(奚濤等，2001)。經(jīng)繼續(xù)深入探索，有望實(shí) 現(xiàn)(1)獲得一個(gè)可用于藥物致癌性安全評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型。這是開展 本研究的初衷，即替代傳統(tǒng)的大小鼠，用于評(píng)價(jià)新藥的致癌性、篩選 抗癌藥物、檢測(cè)置入性醫(yī)療器械的致癌性等。用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型替代 傳統(tǒng)的大小鼠致癌性實(shí)驗(yàn)可以大大縮短時(shí)間(6個(gè)月w2年)、節(jié)省經(jīng) 費(fèi)，減少動(dòng)物的用量，符合國際上關(guān)于動(dòng)物福利的"優(yōu)化、替代、減少"3R 原則要求。因此，本動(dòng)物模型具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。(2)本模型 具有新的特性，可以作為一個(gè)新的癌癥動(dòng)物模型，用于癌癥發(fā)生機(jī)理 研究。主要表現(xiàn)在本模型為自發(fā)型，而且發(fā)生時(shí)間比日本rasH2模 型早，這暗示了本模型可能對(duì)于致癌物的反應(yīng)比rasH2更為敏感，更 適合用于癌癥發(fā)生機(jī)理方面的研究。鑒于人類癌癥發(fā)生的深層原因是 "人體本身與環(huán)境因素長期相互作用的結(jié)果"，而一般情況下，人體接
觸類似大劑量強(qiáng)致癌物的幾率很低，所以有理由相信，自發(fā)型模型得 出的有關(guān)癌癥機(jī)理的數(shù)據(jù)比誘發(fā)型更接近人體真實(shí)。(3)早期瘤狀物 的出現(xiàn)，意味著在用于致癌性實(shí)驗(yàn)時(shí)，比以前的同類模型更為敏感， 這是最為重要的。
實(shí)施例5:轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的交配與建系
采用如下方案交配建系對(duì)于雌性首建鼠則與正常雄鼠交配，選擇 周齡在10周，具有交配經(jīng)歷、身體健壯的C57小鼠與之交配。同居， 1周后開始檢查妊娠情況，如果發(fā)現(xiàn)懷孕即將雌鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，直至生產(chǎn)。 如果為雄性首建鼠，則選擇8周以上，健壯的雌鼠與之交配。每一只 首建鼠的后代單獨(dú)標(biāo)記，作為一個(gè)系對(duì)待。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因能在后代 中穩(wěn)定遺傳，每窩產(chǎn)仔數(shù)量與正常小鼠無異， 一般能成功喂養(yǎng)，少有 吃仔等母性不良現(xiàn)象。這些有利特性為下一步大規(guī)模繁殖建系打下了基礎(chǔ)。
實(shí)施例6:轉(zhuǎn)基因的突變檢測(cè)
從轉(zhuǎn)基因動(dòng)物首建鼠、包括其子代的尾尖組織提取DNA，通過高 保真PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)基因的部分片段。該片段長1853bp，包含c-Ha-ms基 因的4個(gè)外顯子，也既是包含了易發(fā)生突變的部位，即12， 13和61 位 氨 基 酸。 擴(kuò) 增 的 引 物 對(duì) 為 Pri.F4886:gct§§g￡^ggcaggtggggcaggagaccctgtag 禾口 Pri.RN1735 : gcgaattcctgcggtcagcagcctcccttgtgcc (EcoRI)。纟各PCR擴(kuò)增所得片段經(jīng) T-A克隆后測(cè)序，并通過DNAssist軟件進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果顯示這幾 個(gè)位點(diǎn)均未發(fā)生突變(圖6)。
實(shí)施例7:轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生命周期
癌癥轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的生命周期較短， 一般在6個(gè)月以上時(shí)出現(xiàn)自 發(fā)腫瘤的幾率上升，易死亡。本發(fā)明中，首建鼠的生命周期達(dá)到一年 左右，且一般狀態(tài)正常。序列表 <110>中國藥品生物制品檢定所
<120>含有人源原癌基因c-Ha-ras的轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法及其用途
〈160〉 1
<170> Patentln version 3. 4
〈210〉 1
<211〉 6506
<212> DNA
<213〉 人
<400> 1
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權(quán)利要求
1. 人原癌基因c-Ha-ras，其序列如SEQ ID NO1所示。
2. 如權(quán)利要求l所述的人原癌基因c-Ha-ras，其含有4個(gè)編碼外顯子、 啟動(dòng)子區(qū)域及多聚腺苷酸加尾信號(hào)序列polyA。
3. 如權(quán)利要求2所述的人原癌基因c-Ha-ras，其中所述的啟動(dòng)子是嚙 齒類絨毛蛋白啟動(dòng)子或巨細(xì)胞病毒CMV的啟動(dòng)子；所述的加尾序列是 SV40或BGH的polyA信號(hào)序列。
4. 含有如權(quán)利要求1所述的人原癌基因c-Ha-ras的宿主細(xì)胞。
5. 由如權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞形成的組織，器官。
6. 如權(quán)利要求4或5所述的宿主細(xì)胞、組織或器官在致癌物篩選或評(píng) 價(jià)、抑癌物的篩選、藥物的安全性評(píng)價(jià)中的用途。
7. 如權(quán)利要求4或5所述的宿主細(xì)胞、組織或器官在毒理學(xué)中的用途。
8. 如權(quán)利要求4或5所述的宿主細(xì)胞、組織或器官在免疫毒理學(xué)中的 用途。
9. 制備基因組中含有如權(quán)利要求1所述的人原癌基因c-Ha-ras的嚙齒 類受精卵的方法，步驟為(1) 分離獲得人原癌基因c-Ha-ras基因；(2) 通過超排卵、交配、受精卵篩選分離步驟獲得嚙齒類受精卵；(3) 通過顯微注射方法將c-Ha-ras基因注入受精卵中，獲得含有人 原癌基因c-Ha-ras的嚙齒類受精卵。
10. 制備基因組中含有如權(quán)利要求1所述的人原癌基因c-Ha-ras的嚙 齒類轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，步驟為(1) 制作輸精管結(jié)扎雄鼠，然后讓其與正常的發(fā)情期雌鼠交配，獲 得假孕鼠；(2) 將如權(quán)利要求9所述的受精卵直接移植或者在C02培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)至2細(xì)胞時(shí)移植入假孕鼠的輸卵管內(nèi)；(3) 讓假孕鼠生仔，待離乳后通過分子生物學(xué)方法檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因 陽性子代，即首建鼠；(4) 在首建鼠性成熟后進(jìn)行交配建系，獲得該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在基因組中整合有人原癌基因c-Ha-ras DNA的轉(zhuǎn)基因小鼠的制作方法。轉(zhuǎn)入DNA含有人c-Ha-ras基因的4個(gè)編碼外顯子、內(nèi)含子及調(diào)控序列。調(diào)節(jié)序列優(yōu)先選自c-Ha-ras基因本身的啟動(dòng)子區(qū)域和polyA加尾信號(hào)序列。利用該方法制作的轉(zhuǎn)基因小鼠、子代、胚胎、器官和/或衍生的細(xì)胞可用于多種癌癥的癌變機(jī)理研究、致癌物或抑癌物的篩選研究、藥物的臨床前安全性評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101532018SQ20081010166
公開日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2008年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月11日
發(fā)明者岳秉飛, 琴 左, 波 李, 王軍志, 胡培麗, 范昌發(fā) 申請(qǐng)人:中國藥品生物制品檢定所