專利名稱：：一株植物內(nèi)生真菌及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一株植物內(nèi)生真菌及其應用，特別涉及一株從珊狀臂形草葉片中分離獲得的植物內(nèi)生真菌及其在抑制植物病原真菌、寄生線蟲以及產(chǎn)生揮發(fā)性天然氣體化合物中的應用。
背景技術：
：植物內(nèi)生真菌是指整個生活周期或生活史的大部分階段生活在植物體內(nèi)的一些真菌，它們和宿主植物之間為互利共生關系。內(nèi)生真菌由宿主植物為其提供生存空間和養(yǎng)分，其生物量較少，但是它對宿主植物的生存起著重要作用，能夠促進宿主植物的生長，增強其抗病性、抗蟲性、抗旱性以及生長競爭能力等。有些內(nèi)生真菌能夠和宿主根組織一起形成菌根，幫助宿主植物吸收水分和營養(yǎng)，促進植物的生長并提高宿主的抗旱性。有的內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生拮抗性物質(zhì)或者誘導宿主植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，幫助宿主植物抵抗病原物的侵染，增強了宿主的抗病抗蟲性。有些內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生或促使宿主產(chǎn)生一些毒性堿類化合物、脂肪酸及酚萜類化合物、揮發(fā)性天然氣體化合物、或者促使宿主的形態(tài)及生理發(fā)生變化，因而增強宿主植物的抗逆性。利用從錫蘭肉桂小枝中分離獲得的一種內(nèi)生真菌^f"^^/wa/6^及其有關種類所產(chǎn)生的揮發(fā)性天然氣體化合物，2002年，美國AgreQuest公司獨家推出世界上第一種能夠提高植物抗真菌病害能力的真菌熏蒸劑。Lewis1924年在未本科植物葉片內(nèi)首先發(fā)現(xiàn)存在著內(nèi)生真菌，此后這方面的研究工作一直很少，直到最近20年內(nèi)生真菌的研究才開始比較活躍。關于禾草類植物內(nèi)生真菌，目前研究和利用最廣泛的當屬高羊茅和黑麥草等溫帶禾本科牧草內(nèi)生真菌以及近年來國外研究較多的臂形草等熱帶禾本科牧草內(nèi)生真菌，這些內(nèi)生真菌主要屬爿cremom'wm、A^^p/wt^m和五//c/z/W等，對多種植物病原真菌具有生長抑制活性。它們具有較強的宿主專一性，只對宿主植物及取食或感染宿主植物的生物起作用，可通過人工接種導入未感染宿主植物或近緣植物中并可通過宿主種子進行傳播。臂形草(份fc/^^平)又名旗草，為多年生熱帶禾本科牧草，原產(chǎn)非洲。它具有生長快、詞用價值高、耐干旱、耐貧瘠和鹽堿等優(yōu)點，現(xiàn)已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)優(yōu)良的放牧型和水土保持型牧草。我國曾從哥倫比亞國際熱帶農(nóng)業(yè)中心(CIAT)引進栽培，正在推廣種植，已育成的主要品種多達數(shù)十種，推廣面積達近百萬畝。國外有研究從臂形草葉片或葉鞘中分離出內(nèi)生真菌，大部分屬于^cremom'Mm，如Jcrewom'ww/wp//c"&w，其中就有在體內(nèi)體外對病原菌起抑殺作用的，如對臂形草葉斑病(Z>ec/w/era^.)和葉枯病(7/^octom'aw/am')有防治作用的病原菌，但報道其抑菌譜不廣。目前關于內(nèi)生真菌的研究多集中在分離、鑒定、人工接種及提高植物抗性等方面，而將其有目的地用于生物防治方面并不多，主要是由于大部分只對部分植物病原真菌具有抑制作用，對病原物的抑制譜較窄。有些拮抗性真菌能夠產(chǎn)生對病原物有拮抗作用的揮發(fā)性天然氣體化合物，因而擴大了它的拮抗作用應用范圍。禾草類內(nèi)生真菌在產(chǎn)揮發(fā)性天然氣體化合物方面的研究在國內(nèi)外還未見報道，其對真菌生長抑制劑重鉻酸鉀的耐性研究也很少，同時內(nèi)生真菌對植物寄生線蟲的寄生作用也少有涉獵。植物內(nèi)生真菌是一類應用前景廣闊的資源微生物，近年來已成為生防菌劑研制開發(fā)的熱點，而利用拮抗性內(nèi)生真菌進行生物防治是生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的一個重要方面。篩選獲得具有抑制病原菌活性的內(nèi)生真菌是利用它進行植物病害防治的基礎工作，具有廣譜抗病蟲害作用的內(nèi)生菌在生物防治病蟲害、促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中具有極大的應用前景。如果內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生具有廣譜殺菌作用的揮發(fā)性活性天然氣體物質(zhì)，其應用前途將更為廣泛。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一株具有廣譜抑制病原真菌活性、具有寄生線蟲以及能夠產(chǎn)生揮發(fā)性天然氣體化合物的植物內(nèi)生真菌及其應用。本發(fā)明所提供的植物內(nèi)生真菌為直立枝頂孢Ucremom'wmWW"Mm)HND5CGMCCNo.2192。所述直立枝頂孢"cremwz/wmWWc&m)HND5是從珊狀臂形草葉片中分離獲得的臂形草內(nèi)生菌，已于2007年09月30日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市海淀區(qū)中關村北一條13號)，保藏號為CGMCCNo.2192。所述直立枝頂孢(Arewo"/wwWn'"wm)HND5CGMCCNo.2192的基本培養(yǎng)形態(tài)特征為在PDA平板上，28"C培養(yǎng)9天后菌落直徑為3.3cm。菌絲纖細，具分枝，剛性，成網(wǎng)狀，無隔，無色或淺淡綠色，直或彎曲，不平整，直徑為1.21.81,;分生孢子梗不分枝或偶爾分支，直立單生或偶爾多生，無隔，頂端成頭狀，分生孢子頭圓形或梭形，大小為1.644.1pmx1.754.9?；裙ｍ敹舜?，粗x長1.461.97|xmx15.8225.95分生孢子無隔，單孢，短圓桶狀、橢圓狀、紡錘狀，桿狀或球狀，大小為1.231.62pmx1.932.88pm。該菌株的rDNA-ITS序列如序列表中序列1所示，即18S，ITS1，5.8S，ITS2和28S區(qū)域部分序歹U，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與不同^cremo"/wm屬菌株的rDNA-ITS區(qū)序列相似性為8994%。以上述直立枝頂孢"cremom'wmWn'"wm)HND5CGMCCNo.2192為活性成分的生物菌劑也屬于本發(fā)明的保護范圍。在需要的時候，該菌劑中還可包含菌劑制備中常用的載體和輔料。本發(fā)明的直立枝頂孢(v4cremom'wmWn'"wm)HND5CGMCCNo.2192是一株從珊狀臂形草葉片中分離獲得的具有廣譜抑制病原真菌活性、具有寄生線蟲以及能夠產(chǎn)生揮發(fā)性天然氣體化合物的內(nèi)生真菌，可用作載體應用于臂形草生產(chǎn)以及作為真菌基因改良和育種材料。實驗證明，本發(fā)明的直立枝頂孢(^remom'Mm欲/c^m)HND5CGMCCNo.2192具有廣譜體外抑制病原真菌活性的能力，對芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、橡膠炭疽病菌、橡膠棒孢霉落葉病菌、木瓜棒孢霉病菌、竹子枯萎病菌、水稻稻瘟病菌、水稻胡麻斑病菌、甘蔗赤腐病菌、臂形草葉斑病菌具有很強的拮抗作用，其菌液和產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體均可以抑制這些病原菌的侵入和生長，可用于這些病原菌引起的植物病害的防治。直立枝頂孢"cremom'MmWWc^m)HND5CGMCCNo.2192具有寄生植物寄生線蟲能力，其發(fā)酵菌液具有毒殺寄生線蟲的作用，可以用于防治植物線蟲病害。本發(fā)明的珊狀臂形草內(nèi)生真菌菌株直立枝頂孢(Ucremo"/wwWW"wm)HND5CGMCCNo.2192具有產(chǎn)生揮發(fā)性天然氣體化合物的能力，試驗表明該揮發(fā)性氣體對植物病原真菌具有很好的抑制作用，有利于規(guī)?；a(chǎn)揮發(fā)性天然氣體化合物，同樣可以在防治植物病害方面發(fā)揮重要作用?？傊?，該菌株可以在生物防治植物病害、臂形草生產(chǎn)以及作為真菌改良及育種材料方面得到廣泛應用。圖1為在不同培養(yǎng)基平板上HND5菌株的生長狀態(tài)(附加兩種典型平板特征)；圖中，A為胡蘿卜培養(yǎng)基，B為燕麥培養(yǎng)基，C為NA培養(yǎng)基，D為PDA培養(yǎng)基，E為玉米粉培養(yǎng)基，F(xiàn)為MM培養(yǎng)基，G為典型PDA平板特征I,H為典型PDA平板特征II,I為PDA平板背面特征I，J為PDA平板背面特征II，K為PDA平板背面特征III。圖2為HND5菌株顯微形態(tài)；圖2中A為產(chǎn)孢器形態(tài)I;圖2中B為產(chǎn)孢器形態(tài)II;圖2中C為產(chǎn)孢器形態(tài)III;圖2中D為產(chǎn)孢器形態(tài)IV(箭頭示)；圖2中E為菌環(huán)形態(tài)I;圖2中F為菌環(huán)形態(tài)II;圖2中G為分生孢子形態(tài)；圖2中H為分生孢子萌發(fā)形態(tài)I;圖2中I為分生孢子萌發(fā)形態(tài)II;圖2中J為分生孢子頭掃描電子顯微鏡圖I(單生分生孢子梗，放大3200倍)；圖2中K為分生孢子頭掃描電子顯微鏡圖II(單生分生孢子梗三瓶梗?；?，放大2000倍)。圖3為在PDA平板上HND5菌株對植物病原真菌的抑制作用；圖3中I為HND5與芒果炭疽病菌對峙培養(yǎng)；n為HND5與香蕉炭疽病菌對峙培養(yǎng)；III為HND5與香蕉枯萎病菌對峙培養(yǎng)；IV為HND5與竹子枯萎病菌對峙培養(yǎng)；V為HND5與木瓜棒孢病菌對峙培養(yǎng)；VI為HND5與水稻稻瘟菌對峙培養(yǎng)；W為HND5與甘蔗赤腐病菌對峙培養(yǎng)；環(huán)為HND5與橡膠棒孢霉菌對峙培養(yǎng)；IX為HND5與橡膠炭疽菌對峙培養(yǎng)(二者同時接種)X為HND5與橡膠炭疽菌對峙培養(yǎng)(HND5預培養(yǎng)5天再接種病原菌)。圖4為HND5的生長曲線圖。圖5為不同培養(yǎng)基培養(yǎng)對HND5的生物量積累的影響的柱形圖。圖6為不同溫度下HND5的生長速度曲線圖。圖7為不同pH值對HND5菌落生長速度影響的柱形圖。圖8為不同碳氮源對HND5菌落生長速度的影響的柱形圖。圖9為HND5菌株在PDA平板上產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌活性氣體物質(zhì)抑制病原真菌;圖9中A-H中左圖分別為受到HND5產(chǎn)生活性揮發(fā)性氣體物質(zhì)抑制影響的芒果炭疽病菌(圖9中A)、香蕉枯萎病菌(圖9中B)、甘蔗赤腐病菌(圖9中C)、木瓜棒孢霉病菌(圖9中D)、水稻稻瘟菌(圖9中E)、橡膠炭疽菌(圖9中F)、香蕉炭疽菌(圖9中G)和橡膠多主棒孢霉菌(圖9中H)菌落生長狀況。圖10為HND5菌株寄生香蕉根結(jié)線蟲圖片。圖11為HND5菌株防治香蕉根結(jié)線蟲的盆栽試驗結(jié)果照片。圖11中A為HND5發(fā)酵液(稀釋100倍)處理植株；圖11中B為5%丁硫克百威(稀釋1000倍)處理植株；圖11中C為無菌水對照植株。圖12為HND5菌株防治香蕉根結(jié)線蟲盆栽試驗的香蕉根結(jié)照片。圖12中A為HND5發(fā)酵液(稀釋100倍)處理6周后的根結(jié)情況；圖12中B為5%丁硫克百威(稀釋1000倍)處理6周后的根結(jié)情況；圖12中C為對照無菌去離子水處理6周后的根結(jié)情況。具體實施方式下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。實施例1、臂形草內(nèi)生真菌菌株直立枝頂孢(^cmo"/wmW〃'cwm)HND5CGMCCNo.2192的篩選及其鑒定1、臂形草內(nèi)生真菌菌株直立枝頂孢(^cremo"/wmWWc&m)HND5CGMCCNo.2192的篩選本發(fā)明的珊狀臂形草內(nèi)生真菌菌株直立枝頂孢(Aremom'w/wWW"wm)HND5CGMCCNo.2192是利用組織塊分離法，采用嚴格表面消毒程序從珊狀臂形草健康的葉片中分離出來。具體方法為取新鮮完好的健康的珊狀臂形草葉片表面消毒后用無菌水清洗4次，再用無菌濾紙吸干葉片上多余水份。用無菌剪刀將葉片剪碎，將其接種到PDA平板(配方去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20，瓊脂20g，去皮馬鈴薯煮沸30min后用蒸餾水將濾液定容至1000mL，121°C，滅菌20min)上，取第4次清洗的無菌水涂布平板以檢測表面消毒效果，28X:暗培養(yǎng)2個月，其間定期檢查。最后共分離獲得了ll個真菌菌株，分別按照實施例2所述的方法對芒果炭疽病菌，香蕉枯萎病菌，香蕉炭疽病菌，橡膠炭疽病菌，橡膠棒孢霉落葉病菌，木瓜棒孢霉病菌，竹子枯萎病菌，水稻稻瘟病菌，水稻胡麻斑病菌，甘蔗赤腐病菌以及臂形草葉斑病菌進行拮抗活性試驗，結(jié)果表明篩選得到一株具有對多種病原菌具有拮抗作用的臂形草內(nèi)生真菌菌株，將其命名為HND5。2、直立枝頂孢(Jcrewo"/wm5^"wm)HND5CGMCCNo.2192的鑒定將HND5在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分別在試驗培養(yǎng)基平板中央或相距4cm的兩端接種直徑為4mm大小的菌塊，于28t:黑暗或光照條件培養(yǎng)，觀察。該HND5菌株在各種培養(yǎng)基上培養(yǎng)的菌落圖片如圖1所示。結(jié)果表明，HND5菌落的典型形態(tài)特征為在PDA平板上，菌落典型特征為白色棉質(zhì)狀，肉質(zhì)(見圖1中D，PDA培養(yǎng)基，28'C黑暗培養(yǎng)9天)，隨著時間的增加或受光照的影響變?yōu)榉奂t色或橘紅色(見圖1中G(PDA平板28。C黑暗培養(yǎng)1周后的HND5菌落特征，典型PDA平板特征I)和圖1中H(PDA平板28。C光照培養(yǎng)1周后的HND5菌落特征，典型PDA平板特征II))，背面為淡黃色、白色、橙黃、紅色或淡褐色(圖1中I、J、K，即28。C黑暗培養(yǎng)l周后，PDA平板背面三種特征I、n禾HII)。在玉米粉培養(yǎng)基(成分玉米粉30g，瓊脂20g，煮沸30min后用蒸餾水將濾液定容至1000mL，121°C，滅菌20min)上，菌落生長比在PDA平板上快，且氣生菌絲旺盛(見圖1中E(玉米粉培養(yǎng)基，28。C黑暗培養(yǎng)3周))。在PDA平板上，菌落平整或凹凸不平整，中央隆起或表面產(chǎn)生許多小菌絲束突起(見圖1中G，典型PDA平板特征I)，邊緣較規(guī)則或不規(guī)則，菌落表面向培養(yǎng)基平板內(nèi)凹陷，使平板背面產(chǎn)生明顯且較規(guī)則的褶皺紋(見圖1中的J、K(PDA平板背面特征n和in))。菌落質(zhì)地緊密，濕潤，后期表面能夠分泌無色或黃色粘性液珠(見圖1中I、J(典型PDA平板特征I和II))。在胡蘿卜培養(yǎng)基(配方胡蘿卜200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，煮沸30min后用蒸餾水將濾液定容至1000mL，121°C，滅菌20min)(培養(yǎng)3周,圖1中A)、燕麥培養(yǎng)基(配方燕麥片30g，瓊脂20g，煮沸30min后用蒸餾水將濾液定容至1000mL，121°C，滅菌20min)(培養(yǎng)3周，圖1中B)和MM培養(yǎng)基(配方KN0310g，KH2P045g，MgS04'7H202.5g，F(xiàn)eCl30.02g，葡萄糖10g，瓊脂20g，定容至1000mL，121°C，滅菌20min)(培養(yǎng)1周)上菌落白色，質(zhì)地疏松(圖1中F)。在NA培養(yǎng)基(配方牛肉膏3g，蛋白胨5g，瓊脂20g，定容至1000mL，121°C，滅菌20min)上菌落淡粉紅色，菌落質(zhì)地緊密，表面粉質(zhì)(培養(yǎng)2周，圖1中C)。圖1中，A為胡蘿卜培養(yǎng)基培養(yǎng)3周的HND5菌落，B為燕麥培養(yǎng)基培養(yǎng)3周的HND5菌落，C為NA培養(yǎng)基培養(yǎng)2周的HND5菌落，D為PDA培養(yǎng)基28"C黑暗培養(yǎng)9天的HND5菌落，E為玉米粉培養(yǎng)基，28"黑暗培養(yǎng)3周的HND5菌落，F(xiàn)為MM培養(yǎng)基培養(yǎng)1周的HND5菌落，G為典型PDA平板特征I(PDA平板28。C黑暗培養(yǎng)l周)，H為典型PDA平板特征II(PDA平板28'C光照培養(yǎng)1周)，I為PDA平板背面特征I(PDA平板28。C黑暗培養(yǎng)1周)，J為PDA平板背面特征II(PDA平板28'C黑暗培養(yǎng)1周)，K為PDA平板背面特征III(PDA平板28"黑暗培養(yǎng)1周)。采用插片法對本發(fā)明的珊狀臂形草內(nèi)生真菌菌株HND5CGMCCNo.2192進行光學顯微形態(tài)觀察鑒定。同時也利用掃描電子顯微鏡SEM(型號為S-3000N，日本Hitachi公司生產(chǎn))對其進行顯微觀察。該菌株在PDA平板上培養(yǎng)容易產(chǎn)孢，光學顯微形態(tài)觀察中，在PDA平板中央接種HND5菌塊，相距2cm處與瓊脂平板成45度斜插入蓋玻片。28。C培養(yǎng)1個月，定期取出蓋玻片，顯微鏡下觀察具有基內(nèi)菌絲和氣生菌絲，菌絲纖細，具分枝，剛性，成網(wǎng)狀，無隔，無色或淺淡綠色，直或彎曲，光滑或不平整，粗度為1.21.81)Lim，且菌絲上可形成菌環(huán)結(jié)構；分生孢子梗不分枝或偶爾分支，直立單生或偶爾多生，無隔，頂端成頭狀，分生孢子頭為圓形或梭形，大小為1.644.1pmx1.754.9|im(見圖2中J(單分生孢子梗)和K(單分生孢子梗三瓶梗?；稚咦宇^))；?；裙ｍ敹舜?，粗x長1.461.97nmx15.8225.95拜；分生孢子(圖2中G)無隔，單孢，短圓桶狀、橢圓狀、紡錘狀，桿狀或球狀，大小為1.231.62pmx1.932.88|xm。該HND5產(chǎn)生的分生孢子在質(zhì)量百分含量為1.6%水瓊脂上，28"C培養(yǎng)30小時后即行萌發(fā)，可以形成兩種萌發(fā)形態(tài)，一種可形成較長萌發(fā)管(圖2中I)，一種在孢子一端出現(xiàn)酵母芽殖樣萌發(fā)，頂端有小細胞，小細胞與母孢子由一短或長細管連接(圖2中H)。該菌株在PDA上培養(yǎng)時能形成菌環(huán)結(jié)構(圖2中E、F)。HND5在含1000pg/mL重鉻酸鉀的PDA平板上生長9天后菌落直徑可達1.3cm。該菌株的具體顯微照片結(jié)果如圖2所示，圖2中A為產(chǎn)孢器形態(tài)I，是HND5在繁殖菌絲上稀疏出現(xiàn)的分生孢子產(chǎn)孢器(菌齡為2周，箭頭示)；圖2中B為產(chǎn)孢器形態(tài)I1(箭頭示)，是HND5在繁殖菌絲上出現(xiàn)的大量緊密排列的分生孢子產(chǎn)孢器(菌齡為2周)；圖2中c為產(chǎn)孢器形態(tài)m(箭頭示)，是HND5后期的分生孢子產(chǎn)孢器形態(tài)(菌齡為3周)；圖2中D為產(chǎn)孢器形態(tài)IV(箭頭示)是指單分生孢子梗雙瓶梗?；p分生孢子頭(菌齡為2周)；圖2中E為菌環(huán)形態(tài)I,是多個菌環(huán)結(jié)構狀態(tài)照片(箭頭示)；圖2中F為菌環(huán)形態(tài)II,是單個菌環(huán)結(jié)構狀態(tài)照片(箭頭示)；圖2中G為分生孢子；圖2中H為分生孢子萌發(fā)形態(tài)I(箭頭示)；圖2中I為分生孢子萌發(fā)形態(tài)n(箭頭示)；圖2中J為分生孢子頭掃描電子顯微鏡圖I(單生分生孢子梗，放大3200倍)；圖2中K為分生孢子頭掃描電子顯微鏡圖II(單生分生孢子梗三瓶梗?；糯?000倍)。根據(jù)上述形態(tài)特征，鑒定該菌株為直立枝頂孢Ucremow/MmWn'"wm)。進一步對該菌株的rDNA-ITS序列即18S，ITS1，5.8S，ITS2和28S區(qū)域部分序列進行擴增鑒定提取菌株的基因組DNA作為模板，采用兩條通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG誦3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')進行PCR擴增，獲得大小約0.6Kb的擴增產(chǎn)物。擴增片段克隆后送由上海InvitrogenBiotechnologyCo.,Ltd進行測序，測序獲得585個堿基的ITS序列，序列如序列表中序列1所示。將該菌株的上述rDNA-ITS序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，結(jié)果顯示，其序歹U與v4cre附o"/w附Wn."wmgenogroupIIIstrainUW940的rDNA-ITS區(qū)序歹ll(GenBankaccessionNo.DQ45卯04)同源性達到94%，與另外其它不同的v4ormo"/Mm菌株的rDNA-ITS區(qū)序列同源性為8993%，與^cremo"/ww/mp"cWww的rDNA陽ITS區(qū)序歹U(GenBankaccessionNo.AF368810)同源性為89%，與爿cre附om'Mmh7/erae的rDNA-ITS區(qū)序列(GenBankaccessionNo.AJ853771)同源性為93%，與7Vec^"/amaiY//co/a(GenBankaccessionNo.AJ557830)禾口一禾中來自D/oycwraz/"g/Z^re"^的內(nèi)生真菌DF3(GenBankaccessionNo.DQ459004)的rDNA-ITS區(qū)序列同源性也達到了94%。通過上述表型特征和分子特征將其鑒定為^cremo"^m屬真菌，即直立枝頂孢(y4cre附ow/w附Wr/Cwm)HND5，直立t支丁頁抱(爿crewow/wns^7'cZw附)HND5，已于2007年09月30日保藏于中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市海淀區(qū)中關村北一條13號)，保藏號為CGMCCNo,2192。實施例2、內(nèi)生真菌菌株直立枝頂孢"c/^mom'wmWr/"wm)HND5CGMCCNo.2192對病原真菌的拮抗活性鑒定檢測直立枝頂孢Ucremo"/wmW〃'"wm)HND5CGMCCNo.2192對病原真菌的拮抗活性，包括對芒果炭疽病菌，香蕉枯萎病菌，香蕉炭疽病菌，橡膠炭疽病菌，橡膠棒孢霉落葉病菌，木瓜棒孢霉病菌，竹子枯萎病菌，水稻稻瘟病菌，水稻胡麻斑病菌，甘蔗赤腐病菌以及臂形草葉斑病菌等的拮抗活性。供試病原真菌有芒果炭疽病菌(Co〃etofr7'c/zwmg/oeas;w7'o/flfey，購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌株保藏管理中心，保藏編號ACCCNo.31219)，香蕉枯萎病菌(7^ran力moxygon',f.sp.cubense，購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌株保藏管理中心，保藏編號ACCCNo.31272)，香蕉炭疽病菌(G/o^w/o〃'Mm/m^^Mm，購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌株保藏管理中心，保藏編號ACCCNo.31247)，橡膠炭疽病菌(Co〃etoWc/mmg/oeaypoho^^，購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌株保藏管理中心，保藏編號ACCCNo.30012)，橡膠樹棒孢霉落葉病菌(Coo;"e5poraca^/co/a，購買自中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號CGMCCNo.3.10072)，木瓜棒孢霉病菌(Coo;"ewora平，購買自日本農(nóng)林水產(chǎn)省農(nóng)業(yè)生物學國家農(nóng)業(yè)生物學研究所菌種保存中心，保藏編號MAFFNo.239507)，竹子枯萎病菌(i^^n'wmowoWww，購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌株保藏管理中心，保藏編號ACCCNo.31353)，水稻稻瘟病菌(Magwa;oW/^g^sea，購買于中國農(nóng)業(yè)微生物菌株保藏管理中心，保藏編號ACCCNo.30320)，水稻胡麻斑病菌CB^o/an、w^zaeShoem，購買自美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心，保藏編號NRRLNo.5232)，甘蔗赤腐病菌(Co〃eto^c/mm/a/c^wmWent，購買于日本國家技術與評價研究所生物資源中心，保藏編號NBRCNo.l01620)以及臂形草葉斑病菌(Z^ec/w/era取，購買于美國典型菌種保藏中心，保藏編號ATCCNo.38737)。采用體外平板對峙法進行拮抗病原真菌活性評價，具體方法為分別在PDA平板中央接種直徑為4mm的上述供試病原真菌菌塊(滅菌打孔器打取)，于距平板中央3cm的兩點或三點處接種直徑約4mm的直立枝頂孢"cremo"/wmWh"wm)HND5CGMCCNo,2192圓菌塊(滅菌打孔器打取)，以只接種供試病原真菌菌塊不接種直立枝頂孢(Aremo"/Mw^7'"wm)HND5CGMCCNo.2192的該菌株為對照，28。C暗培養(yǎng)7天后觀察并測量生長距離，計算抑制率。抑制率(％)=[(對照組病原菌生長直徑一處理組病原菌生長直徑)/(對照組病原菌生長直徑一原菌餅直徑)]xlOO%。直立枝頂孢(Jcrewom'wmWn'"wm)HND5CGMCCNo.2192與上述各病原真菌對峙培養(yǎng)結(jié)果如圖3(直立枝頂孢(爿cremom'wm欲Wwm)HND5CGMCCNo.2192與9種病原真菌的平板對峙結(jié)果圖)和表1所示，結(jié)果表明，內(nèi)生真菌直立枝頂孢"cremom'"mW^"wm)HND5菌株對所有的這些供試病原真菌均具有較強的抑制活性，抑制距離達到0.41.4cm，抑菌率為51.2±0.7%91.0±3.4%。圖3中I一X中左圖均為對照，右圖均為HND5與病原菌對峙培養(yǎng)的照片。圖3中I為HND5與芒果炭疽病菌對峙培養(yǎng)；H為HND5與香蕉炭疽病菌對峙培養(yǎng)；III為HND5與香蕉枯萎病菌對峙培養(yǎng)；IV為HND5與竹子枯萎病菌對峙培養(yǎng)；V為HND5與木瓜棒孢病菌對峙培養(yǎng)；VI為HND5與水稻稻瘟菌對峙培養(yǎng)；VE為HND5與甘蔗赤腐病菌對峙培養(yǎng)；Vffl為HND5與橡膠棒孢霉菌對峙培養(yǎng)；IX為HND5與橡膠炭疽菌對峙培養(yǎng)(二者同時接種)；X為HND5與橡膠炭疽菌對峙培養(yǎng)(HND5預培養(yǎng)5天再接種病原菌)。表l.平板對峙法中HND5對不同病原真菌的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>同時采用直立枝頂孢(Aremom'wm欲/"wm)HND5CGMCCNo.2192菌液進行了該菌株菌液拮抗活性試驗，采用PDA培養(yǎng)基進行。先將該菌株在PDB培養(yǎng)液(配方去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20，去皮馬鈴薯煮沸30min后用蒸餾水將濾液定容至1000mL，121°C，滅菌20min。)中搖菌培養(yǎng)7天(28°C，180rpm)，再按1:25(體積比)的比例接種新鮮培養(yǎng)基，28°C，180rpm擴大培養(yǎng)14天，再在28"靜置暗培養(yǎng)14天。用0.22pm的無菌濾膜過濾除菌獲取無菌菌液(OD60()值0.40.5)。在每20mLPDA培養(yǎng)基中加入2mL無菌菌液將其制成帶毒平板。在中央接種上述供試病原真菌，以不加菌液為對照28。C暗培養(yǎng)7天后觀察并測量生長距離，計算抑菌率。抑制率(％)=[(對照組病原菌生長直徑一處理組病原菌生長直徑)/(對照組病原菌生長直徑一原菌餅直徑)]xl00%。其菌液只對臂形草葉斑病、木瓜棒孢和水稻稻瘟病菌具有一定的抑制作用，抑制率低，分別為36.8±2.6%、42.2±1.8%和51.6±3.1%，該菌株菌液對病原菌的抑菌譜不廣。實施例3、直立枝頂孢"crewom'wmWW"wm)HND5CGMCCNo.2192的基礎生物學特性研究1、直立枝頂孢(Arewo"/wmWW"wm)HND5CGMCCNo.2192生長曲線測定用滅菌打孔器打取1塊菌齡為2周(PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng))、直徑約為4mm的直立枝頂孢(^cremom'MwWW"wm)HND5CGMCCNo.2192菌塊到50mL液體PDA中，28°C，180rpm搖菌培養(yǎng)。分別取第1天到第7天，第9天和第15天的菌液，真空泵抽除濾液后，收集菌體，分別稱取其濕重和干重重量(6(TC烘干至衡重)(g)。發(fā)現(xiàn)其干濕重菌體量高峰均出現(xiàn)在第7天，隨后其生物量下降；其生長曲線圖如圖4所示。2、直立枝頂孢(^cremo"iwmWWc^m)HND5CGMCCNo.2192生長最適培養(yǎng)基的確定1)直立枝頂孢"cremom'wm^n'"ww)HND5CGMCCNo.2192在如下所述的固體培養(yǎng)基(pH67)平板上生長情況的比較Minimalagarmedium:KN0310g，KH2P045g，MgS04.7H202.5g，F(xiàn)eCl30.02g，葡萄糖10g，瓊脂20g，定容至lOOOmL;PDA(馬鈴薯葡萄糖)培養(yǎng)基去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，去皮馬鈴薯煮沸30min后用蒸餾水將濾液定容至1000mL*,CMV(玉米粉)培養(yǎng)基玉米粉30g，瓊脂20g，煮沸30min后用蒸餾水將濾液定容至1000mL;OA(燕麥)培養(yǎng)基燕麥片30g，瓊脂20g，煮沸30min后用蒸餾水將濾液定容至1000mL;CA(胡蘿卜)培養(yǎng)基胡蘿卜200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，煮沸30min后用蒸鎦水將濾液定容至1000mL;NA培養(yǎng)基牛肉膏3g，蛋白胨5g，瓊脂20g，定容至1000mL;上述培養(yǎng)基均在121°C，滅菌20min。分別在直徑9cm的培養(yǎng)皿中倒入20mL融化的上述六種固體培養(yǎng)基，凝固后即得各種培養(yǎng)基的等厚度固體平板，在平板中央接種直徑約4mm大小的菌齡為PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)了2周的直立枝頂孢(Aremom'wmHND5CGMCCNo.2192打孔菌塊，每種培養(yǎng)基設三次重復，28。C暗培養(yǎng)，7天后測量菌落大小，計算菌落生長速度。結(jié)果如表2所示，在PDA平板上生長速度最快，其次為OA平板，MM平板，CA平板和CMV平板，在NA平板上的生長速度最慢。在CMV，OA，MM和CA培養(yǎng)基上菌落質(zhì)地疏松，在PDA和NA培養(yǎng)基上菌落質(zhì)地非常緊密。培養(yǎng)后期，PDA，CMV，OA，CA和NA平板上菌落變?yōu)榈冱S色或橘紅色，而MM平板上菌落始終為白色。表2.在不同培養(yǎng)基上的生長速度(菌落直徑/培養(yǎng)時間)培養(yǎng)基MMPDACMV0ACANA生長速度(mm/天)3,51±0.153.75±0.113.13±0.123.68±0.133.34±0.092.02±0.132)直立枝頂孢(Aremom'Mm憤/"wm)HND5CGMCCNo.2192在不同的液體培養(yǎng)基(pH67)上生長狀況的比較，選用如下液體培養(yǎng)基PDA:去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，去皮馬鈴薯煮沸30min后用蒸餾水將濾液定容至1000mL。PDB:去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2P045g，MgS04'7H203g，VBi10mg，去皮馬鈴薯煮沸30min后用蒸餾水將濾液定容至1000mL。YEG(酵母提取物葡萄糖培養(yǎng)基)酵母膏2.0g，KH2PO45.0g，MgSO40.5g，葡萄糖5.0g，定容至1000mL。M102培養(yǎng)基蔗糖30.0g，麥芽提取物20.0g，細菌蛋白胨2.0g，酵母提取物1.0g，KC10.5g，KH2PO40.5g，MgS04'7H200.5g，定容至1000mL。SM培養(yǎng)基山梨糖醇100.0g，葡萄糖40.0g，琥珀酸10.0g，酵母提取物1.0g，KH2PO41.0g，MgS04.7H200.3g，TE溶液5,0mL，定容至1000mL，pH5.6;[TE溶液成分(g/100mL):檸檬酸5g，F(xiàn)e(NH4)2(S04)2-6H20100g，ZnS047H205g，MnS04.H200.05g，Na2Mo04-2H200.05g，CuS04.5H200.25g。SM-TE培養(yǎng)基即不含TE溶液的SM培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基均為12rC，滅菌20min。用滅菌打孔器打取一塊直徑約4mm、菌齡為2周的直立枝頂孢"cremom'^nWW"ww)HND5CGMCCNo.2192菌塊，接種到75mL各上述液體培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基三次重復。28°C，180rpm搖菌培養(yǎng)7天，真空泵抽除濾液后，收集菌體，稱取其干重重量(6(TC烘干至衡重)(g)，比較其對菌體生物量產(chǎn)生的影響。結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明，最適液體培養(yǎng)基為SM-TE，其次為SM和M102，而液體PDA為效果最差。3、直立枝頂孢"cremom'wmWn'"wm)HND5CGMCCNo.2192菌株生長溫度范圍研究PDA平板的制備:在直徑9cm的培養(yǎng)皿中倒入20mL溶化的PDA固體培養(yǎng)基，凝固后即得等厚度的PDA固體平板，在平板中央接種打孔得到的直徑約4mm大小的菌齡為PDA固體平板培養(yǎng)2周的直立枝頂孢(Jcremom'wmWWc^m)HND5CGMCCNo.2192菌塊，分別置于不同的溫度(4°C，15°C，22°C，28°C，30°C，37。C和45。C)下暗培養(yǎng)，每個測試溫度設三次重復，于培養(yǎng)7天和14天后均測量一下各個處理PDA平板菌落生長直徑。結(jié)果如圖6所示，結(jié)果表明，在所采用的8個溫度中，28°C為其生長最適溫度。4、直立枝頂孢"cremo"/MmHND5CGMCCNo.2192生長pH值范圍檢測制備不同pH值的PDA平板分別用1MHC1和1MNaOH調(diào)節(jié)液體PDA培養(yǎng)基PH值到4，5，6，7，8，9，10，11或12，調(diào)節(jié)好PH后，加入瓊脂配制成固體培養(yǎng)基，121°C，20min滅菌得到PH值分別為4，5，6，7，8，9，10，11或12的PDA平板。在上述制備的PH值分別為4，5，6，7，8，9，10，11或12的PDA平板中央分別接種一個用滅菌打孔器打取直徑約4mm大小的菌齡為PDA固體平板培養(yǎng)2周的直立枝頂孢(Aremom't/mWn'"wm)HND5CGMCCNo.2192菌塊，分別置28。C暗培養(yǎng)，于培養(yǎng)7天和14天后，分別用十字交叉法測量菌落直徑，設三次重復，求取平均數(shù)和標準差。結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明，該菌株在供試pH511范圍內(nèi)生長直徑差異不大，最適生長pH為7。5、不同碳氮源對直立枝頂孢"cremom'w附欲/"wm)HND5CGMCCNo.2192生長的影響配制不同碳源的培養(yǎng)基以Czapek培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別用D—葡萄糖，乳糖，淀粉，麥芽糖，D-山梨醇，D-果糖，D-木糖，甘露醇，D-甘露糖替換Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖，其他成分不變，制備得到以這些物質(zhì)為唯一碳源的培養(yǎng)基(加入瓊脂配制固體培養(yǎng)基)。配制不同氮源的培養(yǎng)基以Czapek培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，分別用硝酸鉀，硝酸銨，硫酸銨，酵母提取物，牛肉浸膏，酵母浸膏，蛋白胨替換Czapek培養(yǎng)基中的硝酸鈉，其他成分不變，制備得到以這些物質(zhì)為唯一氮源的培養(yǎng)基(加入瓊脂配制固體培養(yǎng)基)。上述Czapek培養(yǎng)基的配方為MgS04'7H200.5g，K2HP041g,KC10.5g，F(xiàn)eS047H2O0.01g，NaN032g，蔗糖20g，定容至1000mL，pH7.0(加入瓊脂配制固體培養(yǎng)基)。均經(jīng)121。C，20min滅菌。1)采用固體平板法測其菌落平均直徑分別將上述不同碳原和氮原的固體培養(yǎng)基以及Czapek固體培養(yǎng)基溶化融化后，分別倒入直徑9cm的培養(yǎng)皿中，20mL/皿，凝固后即得的等厚度上述不同培養(yǎng)基的固體平板。在平板中央接種打孔得到的直徑約4mm大小的菌齡為PDA固體平板培養(yǎng)2周的直立枝頂孢(爿c"mo"/wwHND5CGMCCNo.2192菌塊，設三次重復,28'C暗培養(yǎng)7天，用十字交叉法測量菌落直徑。結(jié)果如表3所示，結(jié)果表明，在含唯一碳源為蔗糖的平板上，其生長速度最快，而在含唯一碳源為D-山梨醇的平板上生長最差，在以D-木糖和乳糖為唯一碳源的平板上其生長速度不如在甘露醇、淀粉、麥芽糖、D-果糖、D-甘露糖和D-葡萄糖平板上的。在含唯一氮源平板上，在以硝酸鈉為唯一氮源的平板上生長最快，其次分別為硝酸鉀，酵母浸膏，蛋白胨，牛肉浸膏，酵母提取物和硝酸銨，而在硫酸銨平板上生長最慢。表3.不同唯一碳氮源平板上HND5生長直徑(培養(yǎng)7天)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>2)液體搖菌法測其干重分別接種一塊用滅菌打孔器打取、菌齡為2周(PDA固體培養(yǎng)基平板培養(yǎng))、直徑約為4mm大小的HND5菌株菌塊到50mL含上述不同氮源或不同碳源的液體培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基設三次重復，28°C，180rpm搖菌7d。真空泵抽除濾液，收集菌絲體，稱取其干重重量(6(TC烘干至衡重)。液體搖菌法測定不同碳氮源影響其生物量的結(jié)果如圖8所示，結(jié)果表明，在單一碳源因子條件下，蔗糖為其最適碳源，D-山梨醇為最不適碳源。而硝酸鈉為最適氮源，最不適宜氮源為硫酸銨。上述兩種方法結(jié)果表明，其最適碳氮源結(jié)果一致。但在部分氮源結(jié)果上有些差異，平板法中最適為硝酸鈉或硝酸鉀，酵母提取物、酵母浸膏和牛肉浸膏與硝酸鈉具有較大差異。而在液體搖菌法中雖然最適氮源為硝酸鈉，但酵母提取物、酵母浸膏和牛肉浸膏與其沒有較大差異。6、直立枝頂孢"cremom'wwW〃'"Mm)HND5CGMCCNo.2192對不同濃度鹽堿的耐受檢測配制含有鹽份NaCl(質(zhì)量百分濃度分別為1%、3%、5%、7%、10%或15%)或KC1(質(zhì)量百分濃度分別為1%、3%、5%、7%、10%或15%)的PDA培養(yǎng)基、含有堿份KOH(質(zhì)量百分濃度分別為1%、3%、5%、7%或9%)的PDA培養(yǎng)基、含有NaOH(質(zhì)量百分濃度分別為1%、3%、5%、7%或9%)的PDA培養(yǎng)基或含有Na2C03(質(zhì)量百分濃度分別為1%、3%、5%、7%或9%)的PDA培養(yǎng)基，用于檢測直立枝頂孢C4cremom'wmHND5CGMCCNo.2192對不同濃度鹽堿的耐受。按照步驟5的方法制備上述培養(yǎng)基的平板，并接種直立枝頂孢(Aremo"/z^欣〖"wm)HND5CGMCCNo.2192菌塊，每個培養(yǎng)基處理三次重復。28。C暗培養(yǎng)14天,用十字交叉法測量菌落直徑。結(jié)果如表4所示，結(jié)果表明HND5菌株僅能耐受質(zhì)量百分比濃度為1%的NaCl，但能夠耐受5。/。KCl。對于三種堿KOH、NaOH或Na2(X)3的耐受力僅在質(zhì)量百分比濃度為1%的濃度上能夠生長。表4.HND5菌株在含不同濃度鹽、堿的PDA平板上菌落平均直徑(cm)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>7、直立枝頂孢"c^mom'MmWr/c&m)HND5CGMCCNo.2192對不同濃度重鉻酸鉀的耐受研究重鉻酸鉀是一種重金屬鹽類，能夠抑制真菌的生長，在分離土壤放線菌時，培養(yǎng)基中加入50pg/mL的重鉻酸鉀即可較好得起到抑制真菌污染的效果。在培養(yǎng)了直立枝頂孢(Arewo"/wmWn'"ww)HND5CGMCCNo.21922周的PDA培養(yǎng)基平板上菌落邊緣用滅菌打孔器打取直徑約4mm的菌塊，分別接種一塊于含有10|Lig/mL、50|xg/mL、100嗎/mL、150|ig/mL、200嗎/mL、300jng/mL、400嗎/mL、500嗎/mL、600pg/mL或1000pg/mL的重鉻酸鉀的PDA培養(yǎng)基的平板中央(培養(yǎng)基平板的制備方法同步驟5)，每個濃度的重鉻酸鉀處理進行三次重復，將平板置于28"C暗培養(yǎng)9天后測量菌落直徑。結(jié)果如表5所示，結(jié)果表明，隨著重鉻酸鉀濃度的升高，菌株HND5的生長速度遞減。在含IOOOpg/mL重鉻酸鉀的PDA平板上，9天后菌落直徑為1.3cm。由于該菌株對重鉻酸鉀具有較強的耐性，在進一步篩選內(nèi)生真菌過程中，利用該特性可以很好的抑制雜菌污染，從而可以進一步將其或相關菌從宿主植物中分離出來。表5.HND5菌株在含不同濃度重鉻酸鉀的PDA平板上菌落平均直徑(cm)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>8、直立枝頂孢"c"mo"/wmHND5CGMCCNo.2192不同保存方法的研究利用PDA培養(yǎng)基作為活化培養(yǎng)基。對于直立枝頂孢"cremom'MmWn'"wm)HND5CGMCCNo.2192的保存方法，主要采用了四種方法，分別是4t:平板保存法，-20°C濾紙片保存法，常溫超純水保存法和-2(TC臂形草種子保存法。4'C平板保存法PDA平板接種直立枝頂孢(Are附o"/廳Wn'"畫)HND5菌塊后，28r暗培養(yǎng)2周后保存于4。C;-20°(:濾紙片或臂形草種子保存法PDA平板接種直立枝頂孢Uc"mo"/MmWW"wm)HND5菌塊后，28r暗培養(yǎng)2周后，菌落表面放置無菌濾紙片或無菌臂形草種子，繼續(xù)培養(yǎng)2周后，將濾紙片或臂形草種子取出，置于保菌袋中，5(TC烘箱烘干，2天后置于-20。C保存；常溫超純水保存法挖取兩塊大小約5mm菌齡為2周的直立枝頂孢"crewom'wmWn'c^m)HND5菌塊，放置于裝有3mL無菌超純水的保菌管中，室溫保存。4°C平板保存法保存直立枝頂孢Ucremo"/wmWn'c&m)HND5菌株，保存3個月后活化，培養(yǎng)兩周后直徑為3.5cm。但保存6個月后再活化，其生長速度減慢，兩周后直徑為2.8cm，而且發(fā)現(xiàn)4i:平板保存時間越長，就越存在被污染的可能性。-2(TC濾紙片保存法保存直立枝頂孢"cremo剛'i^nWn'c加m)HND5菌株，3個月和12個月后分別活化，發(fā)現(xiàn)其生長速度和菌落形態(tài)與保存前的菌落形態(tài)一致。常溫超純水保存法和-2(TC臂形草種子保存法保存效果也同-2(TC濾紙片保存法。上述保存方法保存的菌株活化后，經(jīng)進一步的體外拮抗活性評價，發(fā)現(xiàn)其活性可以很好的保存。為降低污染，在有條件的情況下，可以采用-20'C濾紙片保存法作長期保存。實施例4、內(nèi)生真菌菌株直立枝頂孢(v4fremom'wmWhc化w)HND5CGMCCNo.2192的內(nèi)生性鑒定珊狀臂形草種子除菌處理選取健康飽滿的珊狀臂形草(^mc/n'『/a^/za"Afl)種子(購買自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究中心)，經(jīng)活體苯胺藍染色檢測，其內(nèi)生真菌帶菌率為70%。取一部分均勻飽滿種子經(jīng)熱處理(先經(jīng)過43"C恒溫水浴保溫15min，再升溫至6(TC恒溫水浴保溫60min)后，再經(jīng)70%(體積百分含量)酒精消毒90s，再用質(zhì)量百分濃度為0.1%的升汞溶液消毒20min，無菌水清洗3次，無菌濾紙吸干后置于MS平板上，26'C暗培養(yǎng)萌發(fā)。當種子萌發(fā)至三葉期后，進行內(nèi)生真菌苯胺藍染色和組織塊分離檢測，結(jié)果表明處理后的幼苗帶菌率僅為11.15±0.21%，其除菌率達到了84.37±0.62%。將上述經(jīng)檢測不帶菌的幼苗進行HND5菌株回接用無菌刀片在幼苗頂端分生組織處劃一個小傷口，從新鮮菌落上挑取少許菌絲體接種到幼苗傷口處，然后在傷口處涂上少量無菌凡士林防止真菌掉到培養(yǎng)基平板上。接種后繼續(xù)在MS平板上培養(yǎng)一周后，轉(zhuǎn)移到含營養(yǎng)液的小盆中培養(yǎng)24h，然后移植到含有無菌土的盆中種植。共接種223株，最終共獲得34株成活幼苗，成活率為15.2%。種植接種植株3個月后，取植株葉鞘和葉片進行苯胺藍染色檢測和組織塊分離內(nèi)生真菌，結(jié)果從3株植株中分離出HND5菌株，經(jīng)檢測其拮抗活性與最初接種的菌株一致。在另外的18株植株中只能夠染色檢測到內(nèi)生真菌的存在，但未能分離到內(nèi)生真菌，其它13株中未能檢測出內(nèi)生真菌。接種3個月后仍然能從接種的部分幼苗中分離到HND5菌株，表明該菌株能夠在珊狀臂形草植株穩(wěn)定存在并正常繁殖。接種34株植株只有3株分離到該菌株，表明接種方法還有待改進，也有可能人工接種條件與自然環(huán)境不一致而造成的。實施例5、直立枝頂孢(Jcremow/wmWn'"wm)HND5CGMCCNo.2192產(chǎn)生揮發(fā)性氣體化合物及該氣體對病原真菌的抑制作用實驗1、按照實施例3中步驟3的方法用直徑為9cm的培養(yǎng)皿制備PDA平板，并在每個平板上的多個不同位置各接種一塊打孔得到的直徑約4mm大小的菌齡為PDA固體平板培養(yǎng)2周的直立枝頂孢(Jcremom'wmWn'c似w)HND5CGMCCNo.2192菌塊，28"C培養(yǎng)15天，待其基本長滿平板后，即用于活性揮發(fā)性氣體化合物試驗。2、用上述同樣方法制備PDA平板，在平板中央接種大打孔直徑約4mm、菌齡為一周的芒果炭疽病菌等ll種病原真菌(芒果炭疽病菌、香蕉枯萎病菌、香蕉炭疽病菌、竹子枯萎病菌、橡膠樹炭疽病菌、橡膠樹棒孢霉落葉病菌、木瓜棒孢霉病菌、臂形草葉斑病菌、水稻稻瘟病菌、水稻胡麻斑病菌、甘蔗赤腐病菌，菌株來源同實施例2)的菌塊到PDA平板(培養(yǎng)皿皿底)中央。3、取步驟1所述已經(jīng)培養(yǎng)15天的HND5平板，輕輕將培養(yǎng)皿上方的皿蓋與下方具有培養(yǎng)基的長有HND5菌落的皿底移開，再分別將步驟2所述11種接好病原真菌的PDA平皿皿底(中央帶有接種好的病原真菌菌塊)倒扣在原來培養(yǎng)HND5培養(yǎng)皿的皿底上，用parafilm"M"封口，以倒扣在沒有培養(yǎng)過HND5的皿底上的接好病原真菌的PDA平皿皿底作對照，三次重復，28。C暗培養(yǎng)7天后觀察，按照實施例2的方法計算抑菌率。結(jié)果如表6所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有供試病原真菌的生長都受到抑制，其中對水稻稻瘟病菌菌株抑制率最高，表明菌株直立枝頂孢(v4cremo&mHND5CGMCCNo.2192能夠產(chǎn)生活性揮發(fā)性氣體物質(zhì)抑制病原真菌的生長，其中的8種病原真菌受抑制情況如圖9所示。圖9中A-H中左圖分別為受到HND5產(chǎn)生活性揮發(fā)性氣體物質(zhì)抑制影響的芒果炭疽病菌(圖9中A)、香蕉枯萎病菌(圖9中B)、甘蔗赤腐病菌(圖9中C)、木瓜棒孢霉病菌(圖9中D)、水稻稻瘟菌(圖9中E)、橡膠炭疽菌(圖9中F)、香蕉炭疽菌(圖9中G)和橡膠多主棒孢霉菌(圖9中H)菌落生長狀況，圖9中A-H中的左圖平皿下方為HND5培養(yǎng)平板，上方為接種病原真菌的平板，兩平板倒扣在一起，右圖均為沒有加蓋培養(yǎng)過HND5的皿底(加蓋無菌皿底)的對照。表6.活性氣體對病原菌的抑制率<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>實施例6、直立枝頂孢"crewo"/"wW〃'c,"w)HND5CGMCCNo.2192寄生線蟲功能鑒定直立枝頂孢"cremo"&mHND5寄生準備在載玻片上滴加一滴PDA半固體培養(yǎng)基(含有質(zhì)量百分濃度為1%的瓊脂)，從PDA培養(yǎng)1周菌齡的HND5菌落上挑取少量菌絲體接種在該PDA半固體培養(yǎng)基上，28。C暗培養(yǎng)一周，備用。HND5寄生線蟲實驗剖開患有香蕉根結(jié)線蟲病的香蕉幼苗根結(jié)，置于滅菌水中，8h后挑取線蟲。用含有10%次氯酸鈉和10pg/mL四環(huán)素的滅菌水溶液清洗挑取的活線蟲，3min后將其挑到載玻片上的菌株HND5的菌落上，共接種10片載玻片。28"C暗培養(yǎng)24小時后觀察，然后每隔12小時觀察一次。結(jié)果鏡檢發(fā)現(xiàn)，該菌約60小時后可以產(chǎn)生菌絲套住線蟲并寄生致其死亡(圖10，HND5寄生香蕉根結(jié)線蟲)。打取2塊直徑約為4mm的菌齡為PDA固體平板培養(yǎng)2周的直立枝頂孢(^cremow/"mHND5菌塊接種到200mL的PDA液體培養(yǎng)基中，28°C，180卬m條件下振蕩培養(yǎng)25天，然后常溫靜置14天，無菌過濾獲其菌液，挑取上述處理的活線蟲到菌液中，2天后觀察其殺線蟲作用，對照組是直接將線蟲挑取到無菌蒸餾水中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組中線蟲存活率為76%，菌液處理組中線蟲存活率僅為37%，二者間效果差異極顯著。同時利用上述發(fā)酵液進行了室內(nèi)盆栽防治香蕉根結(jié)線蟲病害評價。隨機選取長勢一致的假莖高度約10cm的香蕉盆栽苗(每盆一株)，每盆接種南方根結(jié)線蟲2000卵，培養(yǎng)兩周后進行接種試驗。分別用稀釋100倍的HND5菌液(用滅菌打孔器打取一塊直徑約4mm菌齡為2周的菌塊，接種到300mL液體PDA培養(yǎng)液中，28°C，180rpm振蕩培養(yǎng)25天，然后常溫靜置14天)，非熏蒸性殺線蟲劑5%丁硫克百威(商品名為好年冬，稀釋1000倍后使用)(陽性對照)或以無菌去離子水(陰性對照)，對感病苗進行灌根施藥，每個處理每株各灌施50mL處理液，每隔7天灌根施藥一次,各施藥四次。每個處理100株，各處理重復3次。6周后，每個處理隨機取香蕉苗20株，將其根挖出，記錄根結(jié)線蟲危害級別和根結(jié)指數(shù)(表7)，線蟲為害分級標準為0級根系完整，無根結(jié)；1級有少量根結(jié)；2級大部分根上有根結(jié)；3級在蟲瘤上有再次根結(jié)；4級根結(jié)互相連結(jié)成為根結(jié)團塊。S(各級植株數(shù)X級值)根結(jié)指數(shù)=xioo調(diào)査總數(shù)X4結(jié)果如表7和圖11、圖12所示。結(jié)果表明，稀釋100倍的菌液與稀釋1000倍的殺線蟲農(nóng)藥好年冬對香蕉根結(jié)線蟲病均有較好的防治效果，兩者之間的防效在1%或5%水平上沒有顯著性或極顯著性差異，但與無菌水對照相比，有顯著性或極顯著性差異。與無菌水對照相比，香蕉苗葉片濃綠，枯葉少，長勢旺(圖11)，根部根結(jié)數(shù)量比對照顯著減少(圖12)。圖11中A為HND5發(fā)酵液(稀釋IOO倍)處理植株；圖11中B為5%丁硫克百威(稀釋1000倍)處理植株；圖11中C為無菌水對照植株。圖12中A為HND5發(fā)酵液(稀釋100倍)處理6周后的根結(jié)情況；圖12中B為5%丁硫克百威(稀釋1000倍)處理6周后的根結(jié)情況；圖12中C為對照無菌水處理6周后的根結(jié)情況。表7.防治盆栽苗香蕉根結(jié)線蟲病試驗<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注表7中小寫字母代表盆栽防治效果在5%時的顯著性水平，倘若不同處理具有不同小寫字母，表示處理結(jié)果之間具有顯著性差異，反之則沒有；大寫字母代表盆栽防治效果在1%時的顯著性水平，倘若不同處理具有不同大寫字母，表示處理結(jié)果之間具有極顯著性差異，反之則沒有。序列表<160〉1<210>1<211〉585〈212〉DNA<213>直立豐支丁頁抱(Jcremow/wm5tn'Cwm)<400>1tccgtaggtg犯cctgcggaggga^tcatt3cagagtagccataggctctccaacccactg60tga^cat3cccatcgttccctcggcgggctcagcgcgcggctgccctcgggctccgcgcg120tccgccggggaca^gca^ctcgttttttatggtgaatctctgsggggcgagagcccgca180atcaaaactttcaacaacggatctcttggc"tctggcatcgatgaaga^cg240cagcg犯a1:gcgataagtaatgtg^ttgcgaatcatcgaatctttgaac300gcacattgcgcccgccggcactccggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctc360agggaccccc"cggggggtaactggtgctggggstc卿gcgccgtccgcggcaccctg420tcccccaaatcgagtggcggtcgcgccgcagcctcccctgCgt3gtagC3caacctxgca480ccgg卿gcggctcggccacgccgtga犯cccccaactctttcaaggttgacctcggatc540aggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggagga58權利要求1、直立枝頂孢(Acremoniumstrictum)HND5CGMCCNo.2192。2、直立枝頂孢(Arewom'wmW〃'"wm)HND5CGMCCNo.2192在防治植物病害中的應用。3、根據(jù)權利要求2所述的應用，其特征在于所述植物病害為芒果炭疽病菌和/或香蕉枯萎病菌和/或香蕉炭疽病菌和/或橡膠炭疽病菌和/或橡膠棒孢霉落葉病菌和/或木瓜棒孢霉病菌和/或竹子枯萎病菌和/或水稻稻瘟病菌和/或水稻胡麻斑病菌和/或甘蔗赤腐病菌和/或臂形草葉斑病菌引起的植物病害。4、直立枝頂孢(Aremo"/wmWW"Mm)HND5CGMCCNo.2192在防治根結(jié)線蟲引起的線蟲病害中的應用。5、根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于所述根結(jié)線蟲病害為香蕉根結(jié)線蟲病。6、直立枝頂孢(Aremom'wmWh"wm)HND5CGMCCNo.2192在生產(chǎn)抑菌性氣體物質(zhì)中的應用。7、以直立枝頂孢"cremom'M附Wn'c&m)HND5CGMCCNo.2192為活性成分的生物菌劑。全文摘要本發(fā)明公開了一株植物內(nèi)生真菌及其應用。該植物內(nèi)生真菌為直立枝頂孢(Acremoniumstrictum)HND5CGMCCNo.2192。該菌株及其代謝產(chǎn)物具有廣譜抑制病原真菌活性、能夠產(chǎn)生具有抑制病原真菌的活性揮發(fā)性天然氣體化合物，該菌株能夠寄生香蕉根結(jié)線蟲，其代謝產(chǎn)物能夠毒殺香蕉根結(jié)線蟲，該菌株可以在生物防治植物病蟲害、臂形草生產(chǎn)以及作為真菌改良及育種材料方面得到廣泛應用。文檔編號C12N1/14GK101235355SQ20081010127公開日2008年8月6日申請日期2008年3月3日優(yōu)先權日2008年3月3日發(fā)明者劉先寶,濤時,蔡吉苗,郭志凱,黃貴修申請人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所