專利名稱：：一種雙液相系統(tǒng)中生物降解植物甾醇制備“雄烯二酮”的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種生物藥業(yè)制劑，特別是涉及微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體"雄烯二酮"。本發(fā)明還涉及該微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體"雄烯二酮"的制備方法。
背景技術(shù)：
：雄甾-4-烯-3,17-二酮(androst-4-ene-3，17-dione,)簡稱"雄烯二酮"或"AD"，是甾體激素類藥物不可替代的中間體，對機(jī)體起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。目前我國生產(chǎn)"AD"主要是從野生中藥材"穿地龍"等植物中提取薯蕷皂苷元經(jīng)化學(xué)合成所獲得，其工藝十分復(fù)雜，消耗成本很高，而且還污染環(huán)境。通過微生物發(fā)酵提取"AD"，其工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)有著誘人的前景，不僅可從根本上改變傳統(tǒng)化學(xué)合成甾體藥物步驟多、得率低、價格貴等不足之處，還可充分利用和發(fā)揮資源優(yōu)勢，擺脫原材料來源因季節(jié)、地域等自然因素對生產(chǎn)的制約，對保護(hù)自然資源和生態(tài)環(huán)境、維護(hù)人類健康起重大作用。植物甾醇與甾體激素藥物的主體結(jié)構(gòu)都是甾核，不同的只是側(cè)鏈和雙鍵上的差異。植物甾醇的這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)決定了它可以作為甾體激素藥物半合成的原料。但是，利用化學(xué)手段降解植物甾醇側(cè)鏈難度較大，長期以來將植物甾醇當(dāng)作廢物處理，造成人為浪費(fèi)資源。微生物選擇性降解甾體側(cè)鏈技術(shù)的發(fā)展使這些廉價易得的甾醇充分利用成為可能。微生物法生產(chǎn)"AD"主要受甾醇在水中溶解度低的限制。傳統(tǒng)的單水相發(fā)酵多采用添加少量有機(jī)溶劑、表面活性劑的方法來提高甾醇在發(fā)酵液中的濃度，但效果并不理想。高聚物/高聚物雙水相系統(tǒng)因生物相容性好而被應(yīng)用于甾醇側(cè)鏈切除的微生物轉(zhuǎn)化，但高聚物的增溶能力有限且價格較貴，限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。有機(jī)溶劑/水兩液相系統(tǒng)增溶能力有所提高，在甾醇側(cè)鏈切除的微生物轉(zhuǎn)化中研究較多，該體系的主要缺點(diǎn)是有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒性以及有機(jī)溶劑的揮發(fā)性，增加了環(huán)境、安全的復(fù)雜性等。合肥工業(yè)大學(xué)生物食品學(xué)院通過對分枝桿菌Mycobacteriumsp.BD696tt各種誘變得到一株可將植物甾醇轉(zhuǎn)化為"AD"的高產(chǎn)菌株。本實(shí)驗提出以植物油替代常用的乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，不僅可增加底物溶解度，而且減小了細(xì)胞毒性。主要研究突變株在葵花油/水雙液相系統(tǒng)中，植物甾醇微生物轉(zhuǎn)化制備雄烯二酮的新工藝以及系統(tǒng)中底物投料量、表面活性劑和添加抑制劑對轉(zhuǎn)化的影響。有效成分與化學(xué)性質(zhì)雄烯二酮1)英文通用名Androst-4-ene-3，17-dione(4-AD)2)化學(xué)名稱雄甾-4-烯-3，17-二酮3)結(jié)構(gòu)式4)分子式C19H26025)分子量2866)理化性質(zhì):外觀呈準(zhǔn)白色晶體粉末，無異味，無毒性，溶于乙醇、醋酸、乙醚，不溶于水，是一種用途極廣的生物化工中間體。該發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):1、通過微生物發(fā)酵提取"AD"，其工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)有著誘人的前景，不僅可從根本上改變傳統(tǒng)化學(xué)合成甾體藥物步驟多、得率低、價格貴等不足之處，還可充分利用和發(fā)揮資源優(yōu)勢，擺脫原材料來源因季節(jié)、地域等自然因素對生產(chǎn)的制約，對保護(hù)自然資源和生態(tài)環(huán)境、維護(hù)人類健康起重大作用。2、本發(fā)明提出以有機(jī)溶劑為葵花油，其轉(zhuǎn)化率最高，且?guī)缀鯖]有結(jié)構(gòu)類似副產(chǎn)物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的產(chǎn)生，葵花油具有較好的乳化能力，乳化現(xiàn)象的發(fā)生可以進(jìn)一步促進(jìn)甾醇與細(xì)胞的接觸，從而促進(jìn)甾醇的轉(zhuǎn)化，且大大減小了有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒性。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種效果好，成本低，安全環(huán)保的微生物選擇性俾解植物留醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體"雄烯二酮"。本發(fā)明的另一個目的是提供一種雙液相系統(tǒng)中生物降解植物甾醇"雄烯二酮"的制備方法。本發(fā)明是通過下列技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)的1制備材料與方法l.l材料1.1.1菌種菌種來源Mycobacteriumsp-UV-8(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品學(xué)院保藏)。1.1.2儀器與分析條件TLC:薄板為鋁箔硅膠60F254(merck公司)，流動相為石油醚乙酸乙酯-6:4,飽和30mi11，展層0.511。試齊1」:雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)為色譜純(sigma公司);其余試劑均為分析純。GC-MS:島津GC-14氣相色譜系統(tǒng)。色譜條件:色譜柱為PEG-20M不銹鋼柱(4mmX2mm)，柱溫采用程序升溫，起始柱溫21(TC維持3min，再以30°C/min的速率升至280。C,維持10min。含量用外標(biāo)峰面積法計算。1.2實(shí)施方法1.2.1培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基(Ml，%):葡萄糖1;酵母膏0.5;聚蛋白胨0.5;瓊脂粉2，K,O.1,NH，NO:,O.1，pH7.07.2。種子培養(yǎng)基(M2,):糖蜜6.0，葡萄糖0.8，K跳0.06,NH具0.5，消后pH7.07.2。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(M3,W):糖蜜6.0，甾醇l，甘油16,KH2P040.06，NH4N030.5，pH8.28.4。1.2.2培養(yǎng)條件斜面溫度30'C32。C，生長周期5d;分離平板57d。搖瓶種子溫度3(TC32。C,轉(zhuǎn)速130r/min，生長周期72h。轉(zhuǎn)化接種量10%，溫度3(TC32。C，轉(zhuǎn)速250280r/min，生長周期120140h。1.2.3制備技術(shù)(1)對不同濃度乙醇/水、甘油/水、葵花油/水組成的系統(tǒng)進(jìn)行有機(jī)溶劑/水雙相系統(tǒng)轉(zhuǎn)化實(shí)驗，選擇最佳有機(jī)溶劑。(2)各種添加劑對系統(tǒng)的影響在以上實(shí)施方法的基礎(chǔ)上，在系統(tǒng)中分別添加不同濃度表面活性劑(吐溫—80)、抑制劑(8-羥基喹啉，2，2，-聯(lián)吡啶，氯化汞等)，研究各種添加劑對轉(zhuǎn)化率的影響。1.2.4植物甾醇轉(zhuǎn)化率的計算方法發(fā)酵完成后，用乙酸乙酯以l:1的比例提取4AD，然后稀釋100倍，再用氣相色譜定量測出雄烯二酮的含量，然后運(yùn)用以下公式計算植物甾醇的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率=提純后有機(jī)相中AD含量X100X/(投料油中甾醇含量X0.66X0.95)。2結(jié)果與討論2.1有機(jī)溶劑對轉(zhuǎn)化率的影響甾醇生物轉(zhuǎn)化過程中，溶劑對底物和產(chǎn)物的溶解度、細(xì)胞活性以及產(chǎn)物分離都有很大的影響。因此,構(gòu)建兩液相體系時，最關(guān)鍵的是溶劑的選擇。由表1看出，有機(jī)溶劑為葵花油時，轉(zhuǎn)化率最高，且?guī)缀鯖]有結(jié)構(gòu)類似副產(chǎn)物雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮(ADD)的產(chǎn)生，葵花油具有較好的乳化能力，乳化現(xiàn)象的發(fā)生可以進(jìn)一步促進(jìn)甾醇與細(xì)胞的接觸，從而促進(jìn)甾醇的轉(zhuǎn)化，且大大減小了有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒性；甘油作為有機(jī)溶劑時，低濃度下有少量"AD"生成外，高濃度下均有"ADD"生成，為后續(xù)分離增加難度；有機(jī)溶劑為乙醇時，轉(zhuǎn)化率也較低，最高只達(dá)到36.8%，且時常伴有"ADD"的產(chǎn)生。結(jié)果表明在葵花油/水系統(tǒng)中，葵花油濃度在20%、30%和40%時均能夠達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化率，而油相濃度為10%時，基本不發(fā)生乳化，原因是油相濃度較小，甾醇不能夠很好的溶解。在甘油/水系統(tǒng)中甾醇的轉(zhuǎn)化并不理想，除了在低濃度下有"AD"生成外，在其它濃度下均無"AD"生成，各濃度中普遍有"ADD"的生成。說明甘油/水系統(tǒng)更加有利于甾醇轉(zhuǎn)化為"ADD"。乙醇/水系統(tǒng)中，乙醇濃度的增加可以促進(jìn)甾醇的轉(zhuǎn)化，當(dāng)乙醇濃度為4%時甾醇的轉(zhuǎn)化率最高，而繼續(xù)增加至5%時甾醇轉(zhuǎn)化率急劇下降。原因是乙醇用量太少時，底物甾醇不能很好溶解；乙醇用量太多時，則對菌體產(chǎn)生毒性，影響菌體的生長，抑制側(cè)鏈降解酶活性，不利于轉(zhuǎn)化。因此確定葵花油為最佳有機(jī)溶劑。表1有機(jī)溶劑/水雙相系統(tǒng)對轉(zhuǎn)化的影響Tab.1effectoforganic/waterbiphasicsystemsonbioconversion轉(zhuǎn)化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率葵花油/水系統(tǒng)甘油/水系統(tǒng)乙醇/水系統(tǒng)1020304010203040234AD10.174.173.566.213.700016.327.636.817.4ADD0000054.253.145.66.9003.12.2底物投料量對轉(zhuǎn)化率的影響甾醇是一種疏水性結(jié)晶，在水中的溶解度極低(通常低于0.lmmo1/1)，而在生產(chǎn)中為了提高轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化往往在遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于底物溶解度的濃度條件下進(jìn)行，這種過量的底物勢必對菌體產(chǎn)生毒害，不利于甾醇轉(zhuǎn)化的進(jìn)行，且造成原材料的浪費(fèi)。葵花油/水系統(tǒng)較好的解決了這個問題。由圖1底物投料量對轉(zhuǎn)化的影響可知，隨底物投料量的增加，轉(zhuǎn)化率逐漸呈上升趨勢，當(dāng)投料量增加至0.5%時轉(zhuǎn)化率上升到79%左右，然后轉(zhuǎn)化率開始下降，特別是底物濃度接近0.6%時，轉(zhuǎn)化率急劇下降，原因是過量的底物影響到發(fā)酵培養(yǎng)基的溶氧，從而抑制菌體生長。2.3添加劑對轉(zhuǎn)化率的影響2.3.1表面活性劑對轉(zhuǎn)化的影響理論上說，生物轉(zhuǎn)化過程中，表面活性劑一方面增加底物的溶解度，同時改變細(xì)胞膜的通透性，對加快底物的傳遞和與微生物的作用應(yīng)該會產(chǎn)生明顯效果。吐溫一80，又名聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯，是一種應(yīng)用較為普遍的表面活性劑，是水包油型乳化劑，可用作某些水中難溶藥物的增溶劑。由圖2吐溫一80對轉(zhuǎn)化的影響可知，吐溫一80的濃度在2%時轉(zhuǎn)化率較高，達(dá)到60.5%，隨著濃度的增加轉(zhuǎn)化率逐漸下降。各濃度下轉(zhuǎn)化率均低于不加時轉(zhuǎn)化率(74.1%)，原因是由于吐溫一80的加入對細(xì)胞產(chǎn)生了毒性，從而抑制了轉(zhuǎn)化的進(jìn)行。因此，表面活性劑雖有增溶能力，但在葵花油/水雙液相系統(tǒng)中效果并不明顯。2.3.2羥化酶抑制劑對轉(zhuǎn)化的影響甾醇轉(zhuǎn)化"AD"的過程中，同時會伴有"AD"的進(jìn)一步降解，分解產(chǎn)物是水和C0"該反應(yīng)是在9a-羥化酶的作用下進(jìn)行的，要抑制"AD"的降解，必須抑制9ci-羥化酶的活性。9ct-羥化酶是一種含二價鐵離子的單氧化酶，去除或取代二價鐵離子會導(dǎo)致其活性的喪失。Fe2+螯合劑8-羥基喹啉(8-HQ)和2，2'-聯(lián)吡啶(2，2-Dipyridyl)是常用的9a-羥化酶抑制劑。另外，Hg"也是常用的9ci-羥化酶抑制劑。9a-羥化酶一般在菌體對數(shù)生長期加入，此時菌體生長基本穩(wěn)定，在系統(tǒng)中進(jìn)行的主要是對甾醇的轉(zhuǎn)化，加入9a-羥化酶抑制劑可能對轉(zhuǎn)化產(chǎn)生有利影響。實(shí)驗選擇培養(yǎng)開始時加入以及對數(shù)生長期(發(fā)酵培養(yǎng)后72h)加入，由表2可知，發(fā)酵培養(yǎng)開始就加入9a-羥化酶抑制劑，加入8-HQ和2，2'-Dipyridyl的發(fā)酵培養(yǎng)基中均無"AD"的生成，加入氯化汞的培養(yǎng)基中也只有少量的AD產(chǎn)生?？赡苁歉饕种苿┑亩拘栽谝婚_始就發(fā)生了作用，導(dǎo)致細(xì)胞生長不良，影響了甾醇的轉(zhuǎn)化，而8-HQ和2，2，-Dipyridyl的毒性較氯化汞的毒性更強(qiáng)一些。在發(fā)酵培養(yǎng)后72h(對數(shù)生長期)加入9a-羥化酶抑制劑，各抑制劑濃度較低時，抑制劑的加入有利于甾醇提高轉(zhuǎn)化率，8—HQ,2,2-Dipyridyl,HgCU濃度在0.005%時，轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到80.5%，76.4%，73.6%,較不加抑制劑時，轉(zhuǎn)化率都有所提高，當(dāng)濃度增加時，轉(zhuǎn)化有所下降，可能是由于各抑制劑濃度越大，其對細(xì)胞的毒性就越大，雖然在培養(yǎng)72h后加入，但還是起到了不利的影響。說明9a-羥化酶低濃度下利于轉(zhuǎn)化。表2抑制劑對轉(zhuǎn)化的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>2.4正交方法在以上單因素方法的基礎(chǔ)上，選取油相濃度(％)，投料量(％)，抑制劑(Q^)作為考察因素，以AD得率作為考察指標(biāo)，采用三因素三水平正交方法設(shè)計。因素水平、實(shí)驗設(shè)計及結(jié)果見表32.4.1方案及結(jié)果分析由表3可知，各因素影響從主到次的順序為A(油相濃度)，B(投料量)，C(抑制劑)。各因素的極差R都大于空列的極差，由此可知各因素均對結(jié)果具有一定的影響。最優(yōu)方案為AAC;，即油相濃度20%，投料量0.4%，抑制劑為0.005%的氯化汞，此時最高轉(zhuǎn)化率為83.4%,比之前的最高轉(zhuǎn)化率80%高出3.4個百分點(diǎn)。從方差分析的結(jié)果表4看出，有機(jī)溶劑濃度、底物投料量對轉(zhuǎn)化率均有影響，但不顯著。這是因為葵花油/水雙液相系統(tǒng)中，底物和產(chǎn)物主要存在在有機(jī)相，而抑制劑存在水相，因此抑制產(chǎn)物進(jìn)一步降解效果并不明顯，從國外資料看，一般單水相系統(tǒng)或高聚物/高聚物雙水相系統(tǒng)中添加抑制劑會起到一定作用。表3正交方案及結(jié)果分析Tab.3DesignandresultoforthogonaltestU(34)NumberA油相(%)B底物(%)空列C抑制劑(0.005%)轉(zhuǎn)化率(%)11(24)1(0.4)1178.4212(0.6)2273.2313(0.5)3374.542(20)12383,45223172.76231273.573(16)13270.78321371.39332170.9Id226.1232.5223.2222,0K2229.6217.2227,5217.4K:,212.9218.9217.9229.2k,75.477.574.474.0k276.572.475.872.5k:,71.073.072.776.4R5.55.13.13.9表4正交方差分析Tab.4Theanalysisofvarianceofresultsoforthogonaltest方差來源SfVF值A(chǔ)51.709225.8553.35B46.882223.4413,04C23.631211.8161.53615.41627.708總和T13—^,638—183結(jié)論(1)在分枝桿菌降解植物甾醇制備AD工藝中，葵花油作為有機(jī)溶劑，不僅可增加甾醇溶解度，且可減少有機(jī)溶劑對細(xì)胞的毒性。(2)葵花油/水雙液相系統(tǒng)是本研究中轉(zhuǎn)化效果最好的系統(tǒng)，轉(zhuǎn)化率可達(dá)80%，比其它系統(tǒng)轉(zhuǎn)化率高出約20%。在該系統(tǒng)中，基本解決了甾醇轉(zhuǎn)化上存在的溶劑毒性、底物溶解、產(chǎn)物抑制等問題。(3)表面活性劑雖有增溶能力，但葵花油/水雙液相系統(tǒng)中效果并不明顯。(4)羥化酶抑制劑在低濃度時對轉(zhuǎn)化有利，高濃度時，由于對細(xì)胞的毒性，不利于轉(zhuǎn)化。(5)通過正交試驗設(shè)計，得到了甾醇轉(zhuǎn)化率為83.4%的反應(yīng)系統(tǒng)葵花油/水雙液相系統(tǒng)，其中葵花油濃度20%，底物投料量0.4%，添加劑是濃度為0.005%的氯化滎。權(quán)利要求1、一種生物藥業(yè)制劑，具體地說是“一種雙液相系統(tǒng)中生物降解植物甾醇制備“雄烯二酮”的方法”。2、根據(jù)權(quán)力要求1所述的微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體"雄烯二酮"的制備方法。3、根據(jù)權(quán)力要求1所述的微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體"雄烯二酮"的培養(yǎng)基。斜面培養(yǎng)基(Ml，。/。):葡萄糖l;酵母膏0.5;聚蛋白胨0.5;瓊脂粉2，KH2P040.1，NH4N030.1,pH7.07.2;種子培養(yǎng)基(M2，。/o):糖蜜6.0,葡萄糖0.8,KH2PO40.06,NH4NO30.5,消后pH7.07.2;轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(M3,o/o):糖蜜6.0,留醇l，甘油16,KH2PO40.06,NH4NO30.5,pH8.28.4。4、根據(jù)權(quán)力要求1所述的微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體"雄烯二酮"的培養(yǎng)條件。斜面:溫度30'C32。C，生長周期5d;分離平板:57d;搖瓶種子溫度3(TC32。C,轉(zhuǎn)速130r/min，生長周期72h;轉(zhuǎn)化:接種量10。/。，溫度30。C32。C，轉(zhuǎn)速250280r/min，生長周期120140h。5、根據(jù)權(quán)力要求1所述的微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體"雄烯二酮"的制備技術(shù)。(1)對不同濃度乙醇/水、甘油/水、葵花油Z水組成的系統(tǒng)進(jìn)行有機(jī)溶劑/水雙相系統(tǒng)轉(zhuǎn)化實(shí)驗，選擇最佳有機(jī)溶劑；(2)根據(jù)權(quán)力要求1所述的微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體"雄烯二酮"的各種添加劑對系統(tǒng)的影響實(shí)驗，在以上試驗基礎(chǔ)上，在系統(tǒng)中分別添加不同濃度表面活性劑(吐溫-SO)、抑制劑(8-羥基喹啉，2，2，-聯(lián)吡啶，氯化汞等)，研究各種添加劑對轉(zhuǎn)化率的影響。6、根據(jù)權(quán)力要求1所述的微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取留體藥物合成的重要中間體"雄烯二酮"的植物甾醇轉(zhuǎn)化率的檢測方法。島津GC-14氣相色譜系統(tǒng).色譜條件色譜柱為PEG-20M不銹鋼柱(4X2mm)，柱溫采用程序升溫，起始柱溫21(TC維持3min，再以3(TC/min的速率升至280°C，維持lOmin.含量用外標(biāo)峰面積法計算.7、根據(jù)權(quán)力要求1所述的微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體"雄烯二酮"的植物甾醇轉(zhuǎn)化率的計算方法。發(fā)酵完成后，用乙酸乙酯以l:1的比例提取4AD，然后稀釋100倍，再用氣相色譜定量測出雄烯二酮的含量，然后運(yùn)用以下公式計算植物甾醇的轉(zhuǎn)化率轉(zhuǎn)化率=提純后有機(jī)相中AD含量X100%/(投料油中甾醇含量X0.66X0.95)。全文摘要本發(fā)明涉及一種生物藥業(yè)制劑，特別是涉及一種雙液相系統(tǒng)中生物降解植物甾醇制備“雄烯二酮”的方法。所述的微生物選擇性降解植物甾醇側(cè)鏈獲取甾體藥物合成的重要中間體“雄烯二酮”對于我國制藥行業(yè)具有重要意義。本發(fā)明研究雙液相系統(tǒng)中，植物甾醇生物降解制備“AD”的工藝以及底物投料量、表面活性劑和添加抑制劑對降解的影響。結(jié)果表明葵花油是分枝桿菌降解甾醇生成“AD”的最佳有機(jī)溶劑，底物投料量、添加羥化酶抑制劑對轉(zhuǎn)化有一定的影響作用。通過正交試驗，確定了葵花油/水系統(tǒng)最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件葵花油濃度為20％，底物投料量為0.4％，添加劑為0.005％氯化汞，此工藝條件下，AD轉(zhuǎn)化率高達(dá)83.4％。文檔編號C12R1/32GK101525651SQ20081010149公開日2009年9月9日申請日期2008年3月7日優(yōu)先權(quán)日2008年3月7日發(fā)明者吳家全,姜紹通,操麗麗,悅李,英楊,潘麗軍申請人:安徽建筑工業(yè)學(xué)院