專利名稱：：一種快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米bt11的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于分子生物學
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測方法，具體說是一種快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米BT11的方法，通過肉眼觀察反應(yīng)管濁度或觀察加入IOOOxSYBRGreen后顏色變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳來判斷擴增情況。
背景技術(shù)：
：隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，基因工程技術(shù)為人類食品和動物飼料的供應(yīng)提供了新的途徑。目前，全球已商業(yè)化和正在研究的轉(zhuǎn)基因植物項目中，大多數(shù)與食品和伺料有關(guān)，其中已有成熟技術(shù)的共有數(shù)十個品種、數(shù)百個品系，主要有大豆、玉米、油菜籽、馬鈴薯、番茄、小麥等。玉米是世界上重要的糧食作物之一，在其生長過程中受到的危害主要來自病蟲害，其次為雜草。據(jù)統(tǒng)計，玉米如不噴施殺蟲劑可能造成59%的產(chǎn)量損失。因此，基因工程技術(shù)最早應(yīng)用在玉米上是開發(fā)具有抗蟲和抗除草劑特性的轉(zhuǎn)基因玉米品系。經(jīng)濟合作發(fā)展組織(organizationforeconomiccooperationanddevelclpment，0ECD)2000年登記的轉(zhuǎn)基因玉米品系共計18種，主要改良性狀為抗病蟲害和耐除草劑等。2000年美國栽種的轉(zhuǎn)基因玉米中72%屬抗蟲害特性，24%屬耐除草劑，4%則兼具抗蟲害及耐除草劑兩種特性。轉(zhuǎn)基因玉米BU1為兼具抗蟲害及耐除草劑兩種特性的品系，其轉(zhuǎn)入的抗蟲基因為Bt系列毒蛋白基因的CrylAb抗蟲基因/轉(zhuǎn)入的耐草丁膦除草劑基因是草丁膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因。隨著大量轉(zhuǎn)基因作物逐步走向市場，轉(zhuǎn)基因作物和轉(zhuǎn)基因作物加工的,食物的安全性問題也開始受到人們的關(guān)注。從本質(zhì)上講，轉(zhuǎn)基因作物和常規(guī)育成的作物品種沒有差別。常規(guī)育種一般是通過有性雜交來實現(xiàn)，而植物基因工程則是用農(nóng)桿菌、基因槍、電激、微注射等技術(shù)將外源重組DNA導入植物基因組中。盡管從理論上講，轉(zhuǎn)基因的遺傳特性及表型應(yīng)該可以更加精確的預測，在應(yīng)用上更加安全，但對轉(zhuǎn)基因作物進行安全性評估仍然很有必要。歐盟最早提出對轉(zhuǎn)基因食品進行標識管理。1999年，要求出口到歐盟的非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不得含有1°/。的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品污染；2002年，歐盟將標識的最低限量降低到O.9%。日本、澳大利亞、新西蘭對轉(zhuǎn)基因成分的最低含量做了不同規(guī)定，域值從1-5%不等。我國于2001年5月9日公布并實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，于2002年1月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價、標識和進口安全管理三個配套管理辦法，確定了第一批實施標識管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實施。目前，PCR檢測方法是最主要、最準確地檢測轉(zhuǎn)基因作物的方法，包括定性PCR方法、復合PCR方法、巢式PCR方法、竟爭性定量PCR方法、熒光定量PCR方法等。國內(nèi)外推廣使用的是定性PCR和實時定量PCR檢測方法
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于公開一種快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米BT11的方法及根據(jù)外源基因與內(nèi)源基因接合處序列設(shè)計一套引物對其進行擴增，通過肉眼觀察濁度或觀察加入SYBRGreen后顏色的變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判斷擴增情況。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米BTll的特異性引物，其中外引物正向序列AGGGATTCTTGGATTTTTGG,外引物反向序列AGAAATGGTTTCCACCAGAA;內(nèi)引物正向序列ATGAAAATAGCCATGAGCGACCATCCATTTCTTGGTCTAAAATCTGT，內(nèi)引物反向序列GGCCATTTATCATCGACCAGAGGAATGTAATCTATGGCAAGGAA。每條引物分別配制成濃度為100jiM的母液，取外引物各ljiL,內(nèi)引物各8卩L，滅菌去離子水2juL,充分混合，為引物混合溶液。本發(fā)明釆用上述一套引物進行快速檢測轉(zhuǎn)基因玉來BT11的方法，其特征在于包括如下步驟(1)采用權(quán)利要求1所述的4條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-651C進行45-60min，并且在801C持續(xù)2min，4C保存；其中的擴增反應(yīng)體系擴增反應(yīng)的總體積為25nL,其各種成分分別為10xBuffer2.5uL，4M甜菜堿6.25pL,0.2MMgS040.25jaL，混合引物lpL,10jaMdNTPs3.5pL,8000U/LBstDNA聚合酶大片段l-5HL,模板DNAl-5jaL，用滅菌去離子水補齊到25yL;(2)擴增反應(yīng)結(jié)束，取體系液3-25jiL,采用不同方法判斷擴增與否，包括直接向擴增管中加入嵌入劑SYBRGreen，通過顏色變化觀察有無擴增反應(yīng)；或評估擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀物的量來觀察有無擴增反應(yīng)；或通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴增結(jié)果。本發(fā)明所述的檢測方法，其中所述的鏈置換活性的DNA聚合酶為8000U/LBstDNA聚合酶大片段l-2nL。本發(fā)明所述的嵌入劑SYBRGreen加入量為l-2jiL，濃度為1000倍。本發(fā)明所述的檢測方法，模板DNA指的待測樣品采用CTAB法提取純化得到的DNA。為了能更加清楚的說明本發(fā)明的測定方法，下面對本發(fā)明的試驗方法做以詳細的i兌明。1、原理本方法應(yīng)用一種新型的核酸擴增方法，其原理是采用4條特異引物及一種具有鏈置換活性的DM聚合酶，在63t:-65X:對核酸進行擴增，短時間擴增效率可達到l(T-l(r個拷貝。具有高特異性、高效性、快速、筒便、易檢測等特點。2、引物設(shè)計本研究依據(jù)轉(zhuǎn)基因玉米BT11外源基因與內(nèi)源基因結(jié)合處序列設(shè)計了4條引物。引物由上海生物工程公司合成。表l引物序列表如下:__<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>Bt-B320AGAAATGGTTTCCACCAGAABt-FIP47ATGAAAATAGCCATGAGCGACCATCCATTTCTTGGTCTAAAATCTGTBt-BIP44GGCCATTTATCATCGACCAGAGGAATGTAATCTATGGCAAGGAA3、反應(yīng)條件反應(yīng)試劑需要鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs、轉(zhuǎn)基因玉米BT11特異性引物、甜菜堿、MgSO,和反應(yīng)緩沖液。反應(yīng)在恒溫條件下進行，反應(yīng)時間依據(jù)引物的效率和模板DNA質(zhì)量變化，一般為lh或更少。加入模板DNA,在63-65"C進行45-60min，并且在80X:，持續(xù)2min而終止。這項技術(shù)的優(yōu)點就是不需要熱循環(huán)。由于擴增是在恒溫條件下進行的，因此僅需要恒溫水浴鍋或金屬加熱塊維持反應(yīng)溫度，不需要PCR儀等昂貴的儀器。材料與方法(1)試劑BioLabs(NEWENGLAND)生產(chǎn)的BstDNA聚合酶大片段和lO倍Buffer溶液；特異性引物；甜菜堿溶液；MgSO濃液;dNTPs;(2)擴增反應(yīng)體系擴增反應(yīng)的總體積為25pL，其各種成分及終濃度分別為10xBuffer2.5jaL,4M甜菜堿6.25pL,0.2MMgS040.25jiL，引物混合液ljaL,10pMdNTPs3.5jjL,8000U/LBstdna聚合酶大片段1-2nL,模板DNAl-5jaL，用滅菌去離子水補齊到25pL。(3)擴增反應(yīng)過程在63-65n進行45-60min,并且在80t:持續(xù)2inin,4€保存；(4)擴增反應(yīng)結(jié)束，取體系液3-25pL用不同的檢測方法判斷擴增與否。4、擴增結(jié)果觀察有三種觀察方法，適合不同情況下進行1)使用2%瓊脂糖凝膠，加入EB染色劑，100V電泳50min，在紫外燈下觀察。反應(yīng)會產(chǎn)生各種片斷長度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的擴增產(chǎn)物，因此在電泳圖譜中顯示為從點樣孔處開始的彌散和階梯狀條帶現(xiàn)象。結(jié)果見圖l。2)由于反應(yīng)形成大量雙鏈DNA產(chǎn)物，所以可直接向擴增管中加入嵌入劑SYBRGreen，通過肉眼觀察，無擴增反應(yīng)的管子呈橙色，有擴增反應(yīng)的管子將變?yōu)榫G色。結(jié)果見圖2。3)檢測還可以通過評估擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀物的量來進行。在反應(yīng)中，在核酸大量合成時，產(chǎn)生副產(chǎn)物一一焦磷酸鎂沉淀，可以用肉眼觀察或濁度儀檢測反應(yīng)管中的沉淀濁度就能夠判斷擴增與否。本發(fā)明用于轉(zhuǎn)基因玉米BT1l檢測的擴增方法，具有以下優(yōu)點(1)操作簡便不需要復雜的儀器，只需一恒定溫度就能反應(yīng)。(2)高特異性該技術(shù)由4條引物擴增靶序列的6個區(qū)段，因此具有高度特異性。(3)快速高效整個擴增不到lh即可完成，產(chǎn)量可達到10'-10"個拷貝；(4)鑒定簡便可以用肉眼直接觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的混濁度或者通過SYBRGreen顏色變化判斷擴增與否。圖l為擴增產(chǎn)物的電泳分析圖譜。自左向右依次為Marker、空白對照、陰性對照、陰性拜品、陽性對照和陽性樣品。圖2為擴增產(chǎn)物加入SYBRGreen結(jié)果圖。左為陽性對照，右為陰性對照。圖3為擴增產(chǎn)物加入SYBRGreen結(jié)果圖。從左邊依次為陰性對照、陽性對照、待測樣品。圖4為擴增產(chǎn)物加入SYBRGreen結(jié)果圖。由左至右為陰性對照、陽性對照、待測樣品1和待測樣品2。圖5為擴增產(chǎn)物的電泳分析圖鐠。由左至右陰性對照、陽性對照、待測樣品l、待測樣品2、待測樣品3、DL2000DNAMarker。圖6為實施例4，采用本發(fā)明方法擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下觀察結(jié)果，其中M，DL2000DNA，Marker;1,5%;2，1%;3,0.5%;4,0.1%;5，0.05%;6，0.01%;7，0.005%;8，0.001%;9，0.0005%;10，陰性對照。圖7為實施例4，常規(guī)定性PCR方法擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下觀察結(jié)果。其中M,DL2000DNA，Marker;1,5%;2,1%;3,0.5%;4,0.1%;5，0.05%;6,0.01%;7，0.005%;8，0.001%;9，0.0005%;10，陰性對照。為了能更加清楚的說明本發(fā)明的方法，下面對本發(fā)明的試驗方法做以詳細的說明，在此需加以說明的是l本發(fā)明所述的引物序列見表l。2玉米模板DNA的提取常規(guī)CTAB法提取(見附件)。實施例l(1)試劑BioLabs(NEWENGLAND)生產(chǎn)的BstDNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；特異性引物混合液；4M甜菜堿溶液；0.2MMgS04溶液；(2)擴增反應(yīng)體系擴增反應(yīng)的總體積為25pL,其各種成分分別為10xBuffer2.5yL,4M甜菜堿6.25yL,0.2MMgS040.25jiL,混合引物lpL，lOjnMdNTPs3.5jiL，8000U/LBstdna聚合酶大片段lmL，模板DM1jliL，用滅菌去離子水補齊到25jaL,混合均勻后離心；(3)擴增反應(yīng)程序在63t:進行60min,并且在80。C保溫2min，4"C,保存；(4)擴增反應(yīng)結(jié)束，取體系液15pL,直接向擴增管中加入嵌入劑lpL1000xSYBRGreen，振蕩混勾，肉眼觀察結(jié)果。無擴增反應(yīng)的管子呈橙黃色，有擴增反應(yīng)的管子將變?yōu)榫G色。結(jié)果見圖3，由圖可見，待測樣品為陽性樣品，含有轉(zhuǎn)基因玉米BT11成份。實施例2(1)試劑BioLabs(NEWENGLAND)生產(chǎn)的BstDNA聚合酶大片段和lO倍Buffer溶液；特異性引物混合液；4M甜菜堿溶液；0.2MMgS04溶液；(2)擴增反應(yīng)體系擴增反應(yīng)的總體積為25jiL，其各種成分分別為10xBuffer2.5yL，4M甜菜堿6.25yL,0.2MMgS04,混合引物0.25jaL，10nMdNTPs3.5jLiL,8000U/LBstDNA聚合酶大片段2mL，模板DNA2nL,用滅菌去離子水補齊到25yL，混合均勻后離心；(3)擴增反應(yīng)程序在65t:進行45min，并且在80匸保溫2min，4T，保存；(4)擴增反應(yīng)結(jié)束，取體系液15jiL,直接向擴增管中加入嵌入劑2HL1000xSYBRGreen，震蕩混勻，肉眼觀察結(jié)果。無擴增反應(yīng)的管子呈橙黃色，有擴增反應(yīng)的管子將變?yōu)榫G色。結(jié)果見圖4，由圖可以看出，待測樣品l為陽性樣品，不含有轉(zhuǎn)基因玉米BT11成分，樣品2不含有轉(zhuǎn)基因玉米BT11成分。實施例3(1)試劑BioLabs(NEWENGLAND)生產(chǎn)的BstDM聚合酶大片段和lO倍Buffer溶液；特異性引物混合液；4M甜菜堿溶液；0.2MMgS04溶液；(2)擴增反應(yīng)體系擴增反應(yīng)的總體積為25pL，其各種成分分別為10xBuffer2.5yL,4M甜菜堿6.25yL,0.2MMgS04,混合引物O.25jiL,lOjiiMdNTPs3.5yL，8000U/LBstDM聚合酶大片段2jiL,模板DNA5|iL，用滅菌去離子水補齊到25jaL,混合均勻后離心；(3)擴增反應(yīng)程序在63"C進行60min,并且在80。C保溫2min，4。C,保存；(4)擴增反應(yīng)結(jié)束，取體系液25nL經(jīng)2。/。瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下觀察結(jié)果。無擴增反應(yīng)的管子無明顯條帶，有擴增反應(yīng)的管子出現(xiàn)階梯狀條帶。結(jié)果見圖5，三個樣品都含有轉(zhuǎn)基因玉米BT11成分。實施例4對比實驗轉(zhuǎn)基因玉米BT11的定性PCR測定方法與本發(fā)明的測定方法的對比(1)本發(fā)明方法試劑BioLabs(NEWENGLAND)生產(chǎn)的BstDNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；特異性引物混合液；4M甜菜堿溶液；0.2MMgS04溶液；DNA模板包括含有轉(zhuǎn)基因玉米BT11成份5。/。、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0.0005%、0%的樣品。(2)本發(fā)明擴增反應(yīng)體系擴增反應(yīng)的總體積為25"L，其各種成分分別為10xBuffer2.5pL，4M甜菜堿6.25nL，0.2MMgS040.25jiL，混合引物1"L，10yMdNTPs3.5|uL，8000U/LBstDNA聚合酶大片段2|uL,模板DNA5niL,用滅菌去離子水補齊到25jiL,混合均勻后離心；(3)本發(fā)明擴增反應(yīng)程序在63iC進行60min,并且在80X:保溫2min，4匸，保存；(4)本發(fā)明擴增反應(yīng)結(jié)束，取體系液4nL，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外燈下觀察結(jié)果。無擴增反應(yīng)的管子無明顯條帶，有擴增反應(yīng)的管子出現(xiàn)階梯狀條帶。結(jié)果見圖6:M,DL2000DM,Marker;1,5%;2,1%;3,0.5%;4,0.1%;5，0.05%;6,0.01%;7，0.005%;8，0.001%;9,0.0005%;10，陰性對照。PCR方法反應(yīng)引物采用本發(fā)明反應(yīng)中一對外引物F3和B3。PCR反應(yīng)為25j^L體系，10xPCRbuffer(Promega)2.5iliL，10mMd證s(Promega)0.5jiL，上游和下游引物(10mM)各O.5pL，Taq酶(5U/nL,Promega)0.5jiL,DNA模板lyL，滅菌去離子水19.5|LiL。反應(yīng)程序為95X:預變性5min，95t:變性30s,52^C退火30s，72*0延伸30s，72"C延伸7min。PCR產(chǎn)物取IOyL于2。y4瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓下40min，通過凝膠成像分析儀觀察，結(jié)果見圖7:M,DL2000腿，Marker;1,5%;2,1%;3,0.5%;4,0.1%;5，0.05%;6,0.01%;7，0.005%;8，0.001%;9，0.0005%;10,陰性對照。由兩種方法比較可以看出，本發(fā)明的方法靈敏度明顯高于PCR方法的敏感度，能檢測出轉(zhuǎn)基因玉米BT11含量更低的樣品。附件常規(guī)CTAB法提取玉米DM的方法(1)取轉(zhuǎn)基因玉米BTll,約100mg,放入研缽中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反復加入3~4次，磨碎成粉末為止；(2)加入1.5mL預熱至65t;的CTAB提取緩沖液，充分混合、懸浮試樣(依試樣不同，可適當增加緩沖液的用量)，65"C保育30min，期間不停顛倒混勻；(3)約12000g離心10min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管，加入l倍體積的酚氯仿異戊醇(25:24:1)，充分混合。約12000g離心15min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；(4)加入1倍體積的氯仿異戊醇(24:1),充分混合。約12000g離心15min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；(5)加入2倍體積CTAB沉淀緩沖液，室溫靜置保育60min;12000g離心15min，棄上清；加入350pL氯化鈉溶液溶解沉淀；12000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清至一新離心管。(6)加入0.6倍體積異丙醇，倒置離心管輕柔混合，室溫放置20min。12000g離心15min。棄上清。加入500pL70%乙醇溶液，并顛倒離心管數(shù)次。12000g離心10min。棄上清。(7)干燥DNA沉淀，加IOOpL水或TE緩沖液溶解DNA。序列表<110>天津巿農(nóng)業(yè)科學院中心實驗室<120>—種快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米BTll的方法<160>4<210>1<211>20bp<212>醒<213>人工序列<楊>1agggattcttggatttttgg20<210>2<211>20bp<212>DNA<213>人工序列<徹>2agaaatggtttccaccagaa20<210>3<211>47bp<212>廳<213>人工序列<細>3atgaaaatagccatgagcgaccatccatttcttggtctaaaatctgt47<210>4<211>44bp<212>腿<213>人工序列<400>4ggccatttatcatcgaccagaggaatgtaatctatggcaaggaa4權(quán)利要求1、用于檢測轉(zhuǎn)基因玉米BT11的特異性引物，其特征在于，包括外引物正向序列AGGGATTCTTGGATTTTTGG，外引物反向序列AGAAATGGTTTCCACCAGAA；內(nèi)引物正向序列ATGAAAATAGCCATGAGCGACCATCCATTTCTTGGTCTAAAATCTGT，內(nèi)引物反向序列GGCCATTTATCATCGACCAGAGGAATGTAATCTATGGCAAGGAA。2、一種采用權(quán)利要求1所述特異性引物快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米BTll方法，其特征在于包括如下步驟(1)采用權(quán)利要求1所述的4條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模板DM,在63-65℃進行45-60min，并且在8(TC持續(xù)2min，4℃保存；其中的擴增反應(yīng)體系擴增反應(yīng)的總體積為25pL，其各種成分分別為10xBuffer2.5μL，4M甜菜堿6.25μL，0.2MMgS040.25μL，引物混合液lμL,lOiuMdNTPs3.5μL，8000U/LBstDNA聚合酶大片段1-5μL，模板DNA1-5uL，用滅菌去離子水補齊到25μL;(2)擴增反應(yīng)結(jié)束，取體系液3-25μL，采用不同方法判斷擴增與否，包括直接向擴增管中加入嵌入劑SYBRGreen，通過顏色變化觀察有無擴增反應(yīng)；或評估擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀物的量來觀察有無擴增反應(yīng)；或通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴增結(jié)果。3、如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其中所述的引物混合溶液指的是將合成的引物粉末分別配成濃度為100mM的母液，然后取外引物各1μL,內(nèi)引物各8μL，加滅菌去離子水2μL,充分混合，制得引物混合溶液。4、如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其中嵌入劑SYBRGreen加入量為5、如權(quán)利要求2所述的檢測方法，其中所述的鏈置換活性的DM聚合酶為8000U/LBstDNA聚合酶大片段l-2μL。全文摘要本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因玉米BT11的快速檢測方法。其原理是采用4條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63～65℃對樣品DNA模板進行擴增，短時間擴增出大量產(chǎn)物。其鑒定采用肉眼直接觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的混濁度或者通過加入SYBRGreen顏色變化判斷擴增與否。本發(fā)明的檢測方法具有高特異性、高效性、快速、簡便、易檢測等特點。文檔編號C12N15/11GK101343664SQ20081005428公開日2009年1月14日申請日期2008年8月26日優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日發(fā)明者蘭青闊,珠朱,永王,奕程,新趙申請人:天津市農(nóng)業(yè)科學院中心實驗室