專利名稱:一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域,涉及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)方法,具體 說是一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的方法,通過肉眼觀察反應(yīng)管濁度或觀
察加入1000 x SYBR Green后顏色變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳來判斷擴(kuò)增情 況。
背景技術(shù):
轉(zhuǎn)基因工程自20世紀(jì)70年代誕生以來,已經(jīng)取得迅速的發(fā)展。在 1996 ~ 1999年全球共有12個(gè)國(guó)家種植轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。美國(guó)是轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物 種植面積最大的國(guó)家,中國(guó)居第4位,但種植面積僅占全球總面積的1%。 目前,轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)的研究,大多分布在抗蟲基因工程、抗病基因工程、 抗逆基因工程、品質(zhì)基因工程、品質(zhì)改良基因工程、控制發(fā)育的基因工程 等領(lǐng)域。如抗蟲基因工程將Bt基因?qū)朊藁?、玉米、水稻、煙草、馬鈴薯 等作物,毒殺害蟲;或?qū)⒛z蛋白酶抑制劑基因?qū)胱魑铮蓴_害蟲消化作 用,而導(dǎo)致害蟲死亡。中國(guó)農(nóng)科院、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院、河南農(nóng) 科院等許多科研單位和高校將幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶雙價(jià)基因?qū)胄←溣?成抗病轉(zhuǎn)基因小麥、轉(zhuǎn)基因煙草、轉(zhuǎn)基因水稻等等。英國(guó)愛丁堡大學(xué)將水 母發(fā)光基因?qū)霟煵荨⒀坎?、馬鈴薯等作物,獲得發(fā)光作物,驅(qū)趕害蟲。 目前在其它轉(zhuǎn)基因工程方面也取得了許多成果,在此不能——例舉??傊?在作物種類方面,大多集中在大豆、玉米、棉花、油菜、馬鈴薯、南瓜、 木瓜、西葫聲七大類作物。
轉(zhuǎn)基因水稻獲得成功始于1986年,Uchimiya等首先獲得了卡那霉素 抗性的轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織,相隔2年,世界上就有3個(gè)實(shí)驗(yàn)室分別獲得 了轉(zhuǎn)基因水稻植林??v觀轉(zhuǎn)基因水稻的發(fā)展歷程,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)開展水 稻遺傳改良主要集中在下列幾個(gè)方面 1 抗蟲性
應(yīng)用于水稻抗蟲性改良的外源基因主要有3種,一是從蘇云金桿菌分 離的蘇云金桿菌殺蟲結(jié)晶蛋白基因(Bt基因),二是從植物中分離出的昆 蟲蛋白酶抑制劑(PI基因),三是植物凝集素基因??茖W(xué)家分別應(yīng)用基因 槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、電擊法等成功地將cryIA(b)、 cryIA(c)基因?qū)胨?稻中,獲得了轉(zhuǎn)基因植林,經(jīng)抗蟲性檢測(cè),轉(zhuǎn)基因植林對(duì)二化螟、三化螟、 大螟、稻縱巻葉螟等具有明顯的致死效應(yīng)。美國(guó)康奈爾大學(xué)1993年將豇 豆胰蛋白酶抑制劑基因CPT導(dǎo)入水稻獲得轉(zhuǎn)基因植林,對(duì)二化螟、三化螟 具有一定的抗性。Vain等將半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因?qū)胨舅玫?轉(zhuǎn)基因植林使線蟲的孵化率下降了 55 %。浙江大學(xué)應(yīng)用Bt基因轉(zhuǎn)化育成 的"克螟稻"已通過了浙江省科技廳的鑒定,1999年獲準(zhǔn)開展環(huán)境釋放試 驗(yàn)。
2 抗病小生
曰本國(guó)家農(nóng)業(yè)環(huán)境所成功地將水稻條紋葉枯病毒外殼蛋白基因RS V CP導(dǎo)入水稻獲得轉(zhuǎn)基因植林,接種后2 ~ 3周發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植林只有2% - 3 % 發(fā)病,而對(duì)照則有95%~ 100%發(fā)病。
Christou等將Xa21基因?qū)胨竞螅@著提高了水稻對(duì)白葉枯病和 稻瘟病的抗性。何迎春等將煙草幾丁質(zhì)酶基因?qū)胨精@得了高抗紋枯病 和稻瘟病轉(zhuǎn)基因植林。四川農(nóng)業(yè)大學(xué)將抗病和抗蟲基因?qū)腚s交稻的恢復(fù) 系中,獲得了轉(zhuǎn)基因的雙抗雜交稻等。
3 抗除草劑
20世紀(jì)80年代,美國(guó)孟山都公司以其擁有廣譜、高效除草劑農(nóng)達(dá)(草 甘膦)的優(yōu)勢(shì),率先開展除草劑抗菌性基因的轉(zhuǎn)移研究與抗性品種的開發(fā), 隨后,美國(guó)艾格福公司(AgrEvo)抗廣譜除草劑草銨膦轉(zhuǎn)基因水稻和美國(guó)氰 胺公司的抗咪唑啉酮類除草劑轉(zhuǎn)基因水稻相繼問世。中國(guó)用于水稻抗除草 劑的基因主要是PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶基因,即抗Basta基因(bar),目前也已 獲得抗Basta水稻。
4 抗逆性
由于有關(guān)水稻抗逆基因的定位、克隆和分離工作難度較大,抗逆轉(zhuǎn)基
因水稻的研究報(bào)道還不多。目前已經(jīng)導(dǎo)入水稻的抗逆基因主要有煙草中的
CMO基因、甜菜堿生物合成酶基因codA和水稻耐淹能力有關(guān)的基因(pdc , pdc , pdc),將其轉(zhuǎn)入水稻中分別獲得了具有抗旱、耐堿、耐鹽和耐漬的 轉(zhuǎn)基因水稻植林。
5高產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)性狀
產(chǎn)量和品質(zhì)是由多基因控制的綜合性狀,個(gè)別外源基因的導(dǎo)入只能使
其組成成分中單一因子的水平獲得提高,而對(duì)其綜合水平?jīng)]有明顯的影 響。目前提高水稻產(chǎn)量的基因工程主要設(shè)想是將高光效C4植物的磷酸烯 醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)和二磷酸核酮糖羧化酶基因(RuB pC)導(dǎo)入水稻 中,在水稻葉片的葉綠體中表達(dá)以提高水稻光合效率,達(dá)到增加產(chǎn)量的目 的。雖然Ku等將PEPC基因?qū)胨?,獲得了光合效率提高近50 %的轉(zhuǎn)基 因水稻,但離獲得高產(chǎn)品種還相距甚遠(yuǎn),只是為水稻大幅度增產(chǎn)帶來了新 的希望。在品質(zhì)改良方面,富脯氨酸基因、富甲硫氨酸和賴氨酸基因、八 氬番茄合成酶及其脫氫酶基因、大豆球蛋白基因和高賴氨酸基因等都已被 成功地導(dǎo)入水稻并獲得了轉(zhuǎn)基因植林,對(duì)于開發(fā)特用稻米產(chǎn)品具有非常重 要的意義。
隨著大量轉(zhuǎn)基因作物逐步走向市場(chǎng),轉(zhuǎn)基因作物和轉(zhuǎn)基因作物加工的 食物的安全性問題也開始受到人們的關(guān)注。從本質(zhì)上講,轉(zhuǎn)基因作物和常
規(guī)育成的作物品種沒有差別。常規(guī)育種一般是通過有性雜交來實(shí)現(xiàn),而植 物基因工程則是用農(nóng)桿菌、基因槍、電激、微注射等技術(shù)將外源重組DNA
導(dǎo)入植物基因組中。盡管從理論上講,轉(zhuǎn)基因的遺傳特性及表型應(yīng)該可以 更加精確的預(yù)測(cè),在應(yīng)用上更加安全,但對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行安全性評(píng)估仍 然很有必要。
歐盟最早提出對(duì)轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識(shí)管理。1999年,要求出口到歐盟 的非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不得含有1%的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品污染;2002年,歐盟將標(biāo)識(shí)的最 低限量降低到O. 9%。日本、澳大利亞、新西蘭對(duì)轉(zhuǎn)基因成分的最低含量做 了不同規(guī)定,域值從1-5%不等。
我國(guó)于2001年5月9日公布并實(shí)施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》,
于2002年1月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)、標(biāo)識(shí)和進(jìn)口安全管 理三個(gè)配套管理辦法,確定了第一批實(shí)施標(biāo)識(shí)管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目 錄,并于2002年3月20日起正式實(shí)施。
轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)方法有Western blots、 ELISA、試紙條、竟?fàn)幮訮CR、 實(shí)時(shí)定量PCR和PCR- ELISA等。轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)主要是檢測(cè)樣品是否含 有外源蛋白質(zhì)(基因表達(dá)產(chǎn)物)和是否含有外源基因(DNA)。轉(zhuǎn)基因作 物中外源蛋白可以利用基于免疫學(xué)原理的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、試 紙條檢測(cè)、Western雜交等方法檢測(cè),主要從待測(cè)樣品中按照一定的程序 抽提含有目的蛋白的基質(zhì),利用抗體與目的蛋白(抗原)特異結(jié)合的特性, 通過偶聯(lián)抗體與抗原抗體復(fù)合物的作用產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)。轉(zhuǎn)基因作物的 核酸檢測(cè)方法主要有兩種核酸分子雜交技術(shù)(Sourthern blot) , PCR 檢測(cè):技術(shù)。
目前,PCR檢測(cè)方法是最主要、最準(zhǔn)確地檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的方法,包 括定性PCR方法、復(fù)合PCR方法、巢式PCR方法、竟?fàn)幮远縋CR方法、熒光 定量PCR方法等。國(guó)內(nèi)外推廣使用的是定性PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法
定性PCR方法技術(shù)成熟,穩(wěn)定,但反應(yīng)體系和操作過程比較復(fù)雜,需 要專業(yè)人員;所需PCR儀價(jià)格在5萬元左右,擴(kuò)增時(shí)間2-3小時(shí),擴(kuò)增結(jié)果 電泳時(shí)間需l小時(shí)左右;電泳常用染料EB是強(qiáng)致癌物,有較強(qiáng)毒性。實(shí)時(shí) 熒光定量PCR技術(shù)先進(jìn),靈敏度更高,擴(kuò)增時(shí)間在l小時(shí)左右,擴(kuò)增結(jié)果實(shí) 時(shí)在電腦上顯示;能檢測(cè)出樣品中外源基因的數(shù)量信息(拷貝數(shù))穩(wěn)定性、 體系和操作同定性PCR相當(dāng),但儀器和耗材價(jià)格較高; 一臺(tái)定量PCR在50萬 元左右,不宜大范圍推廣。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開一種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的方法及根據(jù) 外源基因與內(nèi)源基因接合處序列設(shè)計(jì)一套引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增,通過肉眼觀 察濁度或觀察加入SYBR Green后顏色的變化或觀察瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果判 斷擴(kuò)增情況。
本發(fā)明的^支術(shù)方案如下一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的特異性引物,其中外引物正向序列 AGGATTCACTGGTGGAGA,外引物反向序列GATTATCCAAGGAGGTAGCT;內(nèi)引物 正向序列TGGGAAGTGAATTGGAACTTCAATACCTCGTTAGACTCAACAGC ,內(nèi)引物反 向序列TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGAAGATGGATGAATTACCCCAA。
每條引物分別配制成濃度為IOOmM的母液,然后取外引物各lpL, 內(nèi)引物各8pL,滅菌去離子水2iuL,充分混合,為引物混合溶液。
本發(fā)明采用上述一套$I物進(jìn)行快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的方法,其特 征在于包括如下步驟
(1)采用權(quán)利要求1所述的4條特異引物及一種具有鏈置換活性的 DNA聚合酶,加入模板DNA,在63-65 。C進(jìn)行45-60min,并且在80"C持續(xù) 2min, 4XM呆存;
其中的擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25uL,其各種成分分別 為10 x Buffer 2. 5jiL, 4M甜菜堿6. 25)liL, 0. 2M MgS04 0. 25 yL,混 合引物ljiL, 10jiM dNTPs 3.5nL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-5 UL,模板DNA l-5jaL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25pL;
(2)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束,取體系液3-25jiL,采用不同方法判斷擴(kuò)增與否, 包括直接向擴(kuò)增管中加入嵌入劑SYBR Green,通過顏色變化觀察有無擴(kuò) 增反應(yīng);或評(píng)估擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀物的量來觀察有無擴(kuò)增反
應(yīng);或通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴(kuò)增結(jié)果。'
本發(fā)明所述的檢測(cè)方法,其中所述的鏈置換活性的DNA聚合酶為
8000U/L Bst DM聚合酶大片段l-2uL。
本發(fā)明所述的嵌入劑IOOO倍SYBR Green加入量為1-2 pL。 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法,模板DM指的待測(cè)樣品采用CTAB法提取純
化得到的DM。
為了能更加清楚的說明本發(fā)明的測(cè)定方法,下面對(duì)本發(fā)明的試驗(yàn)方法 做以詳細(xì)的說明。 1、原理
本方法應(yīng)用一種新型的核酸擴(kuò)增方法,其原理是采用4條特異引物及
一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在63r;-65匸對(duì)核酸進(jìn)行擴(kuò)增,短時(shí)間 擴(kuò)增效率可達(dá)到10'-1(T個(gè)拷貝。具有高特異性、高效性、快速、簡(jiǎn)便、易 檢測(cè)等特點(diǎn)。
2、 引物設(shè)計(jì)
本研究依據(jù)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻外源基因與內(nèi)源基因結(jié)合處序列設(shè)計(jì)了4 條引物。引物由大連寶生物公司合成。
表l引物序列表如下:_
引物名稱 堿基數(shù)_序列(5'to3')_
Bt-F3 18 AGGATTCACTGGTGGAGA
Bt-B3 20 GATTATCCAAGGAGGTAGCT
Bt-FIP 44 TGGGAAGTGAATTGGAACTTCAATACCTCGTTAGACTCAACAGC
Bt-BIP 47 TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGAAGATGGATGAATTACCCCAA
3、 反應(yīng)條件
反應(yīng)試劑需要鏈置換型DNA聚合酶、dNTPs、轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻特異性引 物、甜菜堿、MgS04和反應(yīng)緩沖液。反應(yīng)在恒溫條件下進(jìn)行,反應(yīng)時(shí)間依據(jù) 引物的效率和模板DNA質(zhì)量變化, 一般為lh或更少。加入模板DNA,在63-65 X:進(jìn)行45-60min,并且在8(TC,持續(xù)2min而終止。
這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)就是不需要熱循環(huán)。由于擴(kuò)增是在恒溫條件下進(jìn)行 的,因此僅需要恒溫水浴鍋或金屬加熱塊維持反應(yīng)溫度,不需要PCR儀等 昂貴的儀器。 材料與方法
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產(chǎn)的Bst DNA聚合酶大片段和 10倍Buffer溶液;特異性引物;甜菜堿溶液;MgS(^溶液;dNTPs;
(2) 擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25fiL,其各種成分及終濃度 分別為10xBuffer 2.5pL, 4M甜菜堿6.25jiL, 0. 2M MgS04 0. 25 n L, 引物混合液ljLiL, 10 pM dNTPs 3. 5pL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段 l-2jiL,模板DNA l-5uL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25 n L。
(3) 擴(kuò)增反應(yīng)過程在63-65 。C進(jìn)行45-60min,并且在80lC持續(xù)2min,(4 )擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束,取體系液3-25 ja L用不同的檢測(cè)方法判斷擴(kuò)增與否。
4、擴(kuò)增結(jié)果,見察 有三種觀察方法,適合不同情況下進(jìn)行
1) 使用2%瓊脂糖凝膠,加入EB染色劑,100V電泳50min,在紫外燈下 觀察。反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生各種片斷長(zhǎng)度的莖環(huán)結(jié)構(gòu)的擴(kuò)增產(chǎn)物,因此在電泳圖譜 中顯示為從點(diǎn)樣孔處開始的彌散和階梯狀條帶現(xiàn)象。結(jié)果見圖l。
2) 由于反應(yīng)形成大量雙鏈DNA產(chǎn)物,所以可直接向擴(kuò)增管中加入嵌入 劑SYBRGreen,紫外燈下或肉眼觀察,無擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈橙色,有擴(kuò)增 反應(yīng)的管子將變?yōu)榫G色。結(jié)果見圖2。
3) 檢測(cè)還可以通過評(píng)估擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀物的量來進(jìn) 行。在反應(yīng)中,在核酸大量合成時(shí),產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀,可以 用肉眼觀察或濁度儀檢測(cè)反應(yīng)管中的沉淀濁度就能夠判斷擴(kuò)增與否。
本發(fā)明用于轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻檢測(cè)的擴(kuò)增方法,具有以下優(yōu)點(diǎn)
1) 操作簡(jiǎn)便不需要復(fù)雜的儀器,只需一恒定溫度就能反應(yīng),不需 要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性。
2) 高特異性該技術(shù)由4條引物擴(kuò)增靶序列的6個(gè)區(qū)段,因此具有高 度特異性。
3) 快速高效整個(gè)擴(kuò)增不到lh即可完成,產(chǎn)量可達(dá)到10'-10"個(gè)拷貝;
4) 靈敏度高擴(kuò)增模板可僅為10拷貝甚至更少。
5) 鑒定簡(jiǎn)便可以用肉眼直接觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的混濁度或者通過 SYBR Green顏色變化判斷擴(kuò)增與否。
圖l為擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖譜。自左向右依次為Marker、陰性對(duì)照、 陰性樣品l、陰性樣品2、陽性對(duì)照和陽性樣品。
圖2為擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green結(jié)果圖。左為陽性對(duì)照,右為陰性對(duì)照。
圖3為擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green結(jié)果圖。從左邊依次為陽性對(duì)照、待測(cè)樣品、陰性對(duì)照。
圖4為擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green結(jié)果圖。由左至右為陰性對(duì)照、待測(cè) 樣品l、陽性對(duì)照和待測(cè)樣品2。
圖5為擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析圖譜。由左至右DL2000 DNA Marker、待 測(cè)樣品l、待測(cè)樣品2、陰性對(duì)照、陽性對(duì)照。
圖6為實(shí)施例4,采用本發(fā)明方法擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析,紫 外燈下觀察結(jié)果,其中M,DL2000 DNA, Marker; 1,5%; 2, 1%; 3,0.5%; 4,0.1%; 5, 0.05%; 6, 0. 01%; 7, 0. 005%; 8,陰性對(duì)照。
圖7為實(shí)施例4,常規(guī)定性PCR方法擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析,紫 外燈下觀察結(jié)果。其中M,DL2000 DNA Marker; 1,5%; 2, 1%; 3, 0. 5°乂; 4,0.1%; 5, 0.05%; 6, 0. 01%; 7, 0. 005%; 8,陰性對(duì)照。
為了能更加清楚的說明本發(fā)明的方法,下面對(duì)本發(fā)明的試驗(yàn)方法做以 詳細(xì)的說明,在此需加以說明的是
l本發(fā)明所述的引物序列見表l。
2水稻模板DNA的提取常規(guī)CTAB法提取(見附件)。 實(shí)施例l
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產(chǎn)的Bst DNA聚合酶大片段和 10倍Buffer溶液;特異性引物混合液;4M甜菜堿溶液;0. 2M MgS04溶液;
(2) 擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25jaL,其各種成分分別為 10 x Buffer 2. 5pL, 4M甜菜堿6.25yL, 0. 2M MgS04 0. 25 pL,混合引 物lyL, 10|aM dNTPs 3.5juL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段l n L,才莫 板DNA lpL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25pL,混合均勻后離心;
(3) 擴(kuò)增反應(yīng)程序在63t:進(jìn)行60min,并且在80^C保溫2min, 4'C,
保存;
(4) 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束,取體系液10jiL,直接向擴(kuò)增管中加入嵌入劑l pL 1000 xSYBR Green,振蕩混勻,肉眼觀察結(jié)果。無擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈 橙黃色,有擴(kuò)增反應(yīng)的管子將變?yōu)榫G色。結(jié)果見圖3,由圖可見,待測(cè)樣 品為陽性樣品,含有轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻成份。
實(shí)施例2
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產(chǎn)的Bst DNA聚合酶大片段和 10倍Buffer溶液;特異性引物混合液;4M甜菜堿溶液;0. 2M MgS04溶液;
(2) 擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25yL,其各種成分分別為 10xBuffer 2. 5yL, 4M甜菜堿6.25pL, 0. 2M MgS04,混合引物0.25p L , 10 pM dNTPs 3. 5yL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2 p L,模板DNA 2juL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25y L,混合均勻后離心;
(3) 擴(kuò)增反應(yīng)程序在65n進(jìn)行45min,并且在80。C保溫2min, 4t:,
保存;
(4) 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束,取體系液15pL,直接向擴(kuò)增管中加入嵌入劑2 ]LiL 1000 xSYBR Green,震蕩混勻,肉眼觀察結(jié)果。無擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈 橙黃色,有擴(kuò)增反應(yīng)的管子將變?yōu)榫G色。結(jié)果見圖4,由圖可以看出,待 測(cè)樣品l為陰性樣品,不含有轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻成分,樣品2含有轉(zhuǎn)基因抗蟲 水稻成分。
實(shí)施例3
(1) 試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產(chǎn)的Bst DM聚合酶大片段和 lO倍Buffer溶液;特異性引物混合液;4M甜菜堿溶液;0. 2M MgS04溶液;
(2) 擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25pL,其各種成分分別為 10xBuffer 2. 5 y L, 4M甜菜堿6.25juL, 0. 2M MgS04,混合引物0.25jLi L , 10 nM dNTPs 3. 5jiL, 8000U/L Bst DM聚合酶大片段2yL,模板DNA 5|iL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25pL,混合均勻后離心;
(3) 擴(kuò)增反應(yīng)程序在63。C進(jìn)行60min,并且在80C保溫2min, 4匸,
保存;
(4) 擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束,取體系液25ML經(jīng)2yn瓊脂糖凝膠電泳分析,紫外 燈下觀察結(jié)果。無擴(kuò)增反應(yīng)的管子無明顯條帶,有擴(kuò)增反應(yīng)的管子出現(xiàn)階 梯狀條帶。結(jié)果見圖5,樣品不含有轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻成分。
實(shí)施例4
'對(duì)比實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的定性PCR測(cè)定方法與本發(fā)明的測(cè)定方法
的對(duì)比
(1) 本發(fā)明方法試劑BioLabs (NEW ENGLAND)生產(chǎn)的Bst DNA聚合 酶大片段和10倍Buffer溶液;特異性引物混合液;4M甜菜堿溶液;0.2M MgS04溶液;DNA模板包括含有轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻成份5"/。、 1%、 0.5%、 0.1%、 0.05%、 0.01%、 0.005%、 0. 001%的樣品。
(2) 本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25yL,其各種成分 分別為10xBuffer 2. 5yL, 4M甜菜堿6. 25 n L, 0. 2M MgS04 0. 25 ju L, 混合引物lyL, 10juMdNTPs 3.5juL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2ja L,模板DNA 5yL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25jaL,混合均勻后離心;
(3) 本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)程序在63'C進(jìn)行60min,并且在80X:保溫2niin, 4'C,保存;
(4) 本發(fā)明擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束,取體系液3uL,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分 析,紫外燈下觀察結(jié)果。無擴(kuò)增反應(yīng)的管子無明顯條帶,有擴(kuò)增反應(yīng)的管 子出現(xiàn)階梯狀條帶。結(jié)果見圖6: M,DL2000 DNA, Marker; 1,5%; 2, 1%; 3,0.5%; 4,0.1%; 5, 0.05%; 6, 0. 01%; 7, 0. 005%; 8,陰性對(duì)照。
PCR方法反應(yīng)引物采用本發(fā)明反應(yīng)中一對(duì)外引物F3和B3。 PCR反應(yīng) 為25yL體系,10x PCRbuffer(Promega) 2. 5 jiL, 10 mM證Ps ( Promega ) 0. 5 jnL,上游和下游引物(10mM)各O. 5 pL, Taq酶(5 U/yL, Promega) 0.5 )aL, DM模板1jjL,滅菌去離子水19. 5 ju l。反應(yīng)程序?yàn)?5 。c預(yù)變 性5min, 95匸變性30 s, 58"C退火30 s, 72。C延伸30 s, 72 。C延伸7 min。 PCR產(chǎn)物取IO ML于2 d瓊脂糖凝膠電泳,100 V電壓下40 min,通過凝膠成 像分析儀觀察,結(jié)果見圖7: M,DL2000 DNA, Marker; 1,5%; 2,1%; 3,0.5%; 4,0.1%; 5, 0.05%; 6, 0. 01%; 7. 0. 005%; 8,陰性對(duì)照。
由兩種方法比較可以看出,本發(fā)明的方法靈敏度明顯高于PCR方法的 敏感度,能檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻含量更低的樣品。
附件常規(guī)CTAB法提取水稻DNA
(1)取轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻,約100mg,放入研缽中,加入少量液氮迅速
磨碎。液氮反復(fù)加入3~4次,磨碎成粉末為止;
(2) 加入1. 5mL預(yù)熱至65r;的CTAB提取緩沖液,充分混合、懸浮試樣(依 試樣不同,可適當(dāng)增加緩沖液的用量),651C保育30min,期間不停顛倒 混勻;
(3) 約12000g離心10min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管,加入l倍體積的酚 氯仿異戊醇(25: 24: 1 ),充分混合。約12000g離心15min。轉(zhuǎn)移上清 至一新離心管中;
(4) 加入1倍體積的氯仿異戊醇(24: 1),充分混合。約12000g離 心15min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中;
(5) 加入2倍體積CTAB沉淀緩沖液,室溫靜置保育60min; 12000g離心 15min,棄上清;加入350 u L氯化鈉溶液溶解沉淀;12000g離心10 min, 轉(zhuǎn)移上清至一新離心管。
(6) 加入0. 6倍體積異丙醇,倒置離心管輕柔混合,室溫放置20min。 12000g離心15min。棄上清。加入500 n L70%乙醇溶液,并顛倒離心管數(shù) 次。12000g離心10min。棄上清。
(7) 干燥DNA沉淀,加IOO ji L水或TE緩沖液溶解DNA。
序列表
<110>天津巿農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室
<120> —種快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的方法
<160> 4
<210> 1
<211> 18bp
<212> 廳
<213> 人工序列
<權(quán)> 1
aggattcact ggtggaga 18
<210> 2
<211〉 20bp
<212> DNA
<213>人工序列
<400> 2
gattatccaa ggaggtagct 20
<210> 3 <211> 44bp <212>醒 <213>人工序列 <400> 3
tgggaagtga attggaactt caatacctcg tUgactcaa cage 44
<210> 4 <211> 47bp <212> ■ <213> 人工序列 <400> 4
tctaccagat atagagttcg tgtgagaaga tggatgaatt accccaa 4權(quán)利要求
1、用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的特異性引物,其特征在于,包括外引物正向序列AGGATTCACTGGTGGAGA,外引物反向序列GATTATCCAAGGAGGTAGCT;內(nèi)引物正向序列TGGGAAGTGAATTGGAACTTCAATACCTCGTTAGACTCAACAGC,內(nèi)引物反向序列TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGAAGATGGATGAATTACCCCAA。
2、 一種采用權(quán)利要求1所述特異性引物快速檢測(cè)轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻方 法,其特征在于包括如下步驟(1)采用權(quán)利要求1所述的4條特異引物及一種具有鏈置換活性的 DNA聚合酶,加入才莫板DNA,在63-65℃進(jìn)行45-60min,并且在8℃持續(xù) 2min, 4℃保存;其中的擴(kuò)增反應(yīng)體系擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25jliL,其各種成分分別 為10 x Buffer 2.5 ]uL, 4M甜菜堿6.25UL, 0. 2M MgS04 0. 25 n L,引 物混合液lpL, 10pM dNTPs 3.5pL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段 1-5 mL,模板DM l-5pL,用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25yL;(2)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束,取體系液3-25nL,采用不同方法判斷擴(kuò)增與否, 包括直接向擴(kuò)增管中加入嵌入劑SYBR Green,通過顏色變化觀察有無擴(kuò) 增反應(yīng);或評(píng)估擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀物的量來觀察有無擴(kuò)增反 應(yīng);或通過觀察瓊脂糖凝膠電泳條帶判斷擴(kuò)增結(jié)果。
3、 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法,其中所述的引物混合溶液指的是 將合成的引物粉末分別配成濃度為100nM的母液,然后取外引物各luL, 內(nèi)引物各8nL,加滅菌去離子水2uL,充分混合,制得引物混合溶液。
4、 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法,其中嵌入劑SYBR Green加入量為l-2 uL。
5、 如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法,其中所述的鏈置換活性的DM聚 合酶為8000U/L Bst DM聚合酶大片段l-2pL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的快速檢測(cè)方法。其原理是采用4條特異引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在63~65℃對(duì)樣品DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增,短時(shí)間擴(kuò)增出大量產(chǎn)物。其鑒定采用肉眼直接觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的混濁度或者通過加入SYBR Green顏色變化判斷擴(kuò)增與否。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有高特異性、高效性、快速、簡(jiǎn)便、易檢測(cè)等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101343665SQ20081005428
公開日2009年1月14日 申請(qǐng)日期2008年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月26日
發(fā)明者蘭青闊, 珠 朱, 永 王, 奕 程, 新 趙 申請(qǐng)人:天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室