專利名稱：一種高效降解木質(zhì)素的菌種及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物菌種的篩選、純化和鑒定方法及其應(yīng)用，特別是涉及高 降解木質(zhì)素菌種的篩選純化，以及培養(yǎng)該高效降解木質(zhì)素菌種的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木質(zhì)素是植物中含量僅次于纖維素的一種豐富的大分子次生代謝產(chǎn)物。據(jù) 估算，世界每年可由植物產(chǎn)生約600萬噸木質(zhì)素。木質(zhì)素具有重要的生物學(xué)功能。 在木質(zhì)化過程中，木質(zhì)素滲入到細(xì)胞壁，以提高植物體的機(jī)械強度；木質(zhì)素由于 具有疏水性而有利于疏導(dǎo)組織的水分運輸；木質(zhì)素還有利于植物體抵抗病菌微生 物等不良外界環(huán)境的侵襲。然而，木質(zhì)素的存在并不利于人類的某些重要經(jīng)濟(jì)用 途，尤其是在制槳造紙工業(yè)中，制漿造紙的中心環(huán)節(jié)是利用大量的化學(xué)品將原料 中的木質(zhì)素與纖維素分離，纖維素用于造紙，而分離的木質(zhì)素形成造紙廢液，造 成嚴(yán)重的環(huán)境污染，且脫木質(zhì)素的化學(xué)藥品投入及廢液的堿回收處理大大增加了 造紙成本。
在自然界中，大多微生物個體雖然個體微小，但生長旺盛繁殖快，若其具 有降解木質(zhì)素能力，將能有效的降解木質(zhì)素。目前發(fā)現(xiàn)的能降解木質(zhì)素的微生物 主要是真菌，根據(jù)真菌降解木材時引起其性狀變化不同，將它們分為白腐真菌， 褐腐真菌和軟腐真菌。白腐真菌降解木質(zhì)素能力一般高于降解纖維素能力，其他 兩種降解木質(zhì)素能力弱于降解纖維素能力。關(guān)于真菌能夠降解木質(zhì)素，大多認(rèn)為 其能產(chǎn)生能一些降解木質(zhì)素酶。目前，研究比較多，降解能力較強的酶有三種， 即木質(zhì)素過氧化物酶(Lignin Peroxidase/Lip)、錳依賴過氧化物酶(Manganases peroxidase/Mnp)和漆酶(lacase)。除了上述3種重要的酶外，其他的如葡萄糖 氧化酶、過氧化氫酶及一些還原酶和蛋白酶等都參與或?qū)δ举|(zhì)素的降解有一定的 影響b
近年來，某些真菌降解木質(zhì)素己開始應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境處理。如黃原孢毛平革菌和Phlebia brevispora等白腐菌已應(yīng)用于造紙工業(yè)中的生物制漿，生 物漂白等過程。Setliff利用真菌對楊木進(jìn)行了預(yù)處理，結(jié)果表明，與未經(jīng)真菌處 理相比，在盤磨機(jī)磨至相同游離度的情況下，楊木可以降低20%的能耗。
用木質(zhì)素降解菌處理飼料可提高動物對飼料的消化，并且已經(jīng)突破了秸稈 僅用于反芻動物飼料的禁區(qū)，對飼養(yǎng)豬、雞的實驗效果已有報道。而且秸稈可以 轉(zhuǎn)化為有機(jī)肥料，但自然轉(zhuǎn)化的過程較長，應(yīng)用白腐菌可以加快它的轉(zhuǎn)化速度。 此外，木質(zhì)素降解菌還可以應(yīng)用于污水處理，土壤恢復(fù)等領(lǐng)域。
目前研究及應(yīng)用的菌種存在對木質(zhì)素降解的特異性和活性不足等缺點，因 此，篩選產(chǎn)酶量高、抗性強的菌種，從而改進(jìn)生產(chǎn)工藝是國內(nèi)外研究的主要熱點。 本實驗從長白山腐朽的木材中篩選獲得了能較強降解木質(zhì)素的菌種，其在造紙 業(yè)，畜牧業(yè)，以及環(huán)境保護(hù)等方面具有很大意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種篩選獲得高活性的降解木質(zhì)素的菌種的方 法，該方法包括利用馬鈴薯培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)獲得單克隆菌株，而后利用苯胺蘭平 板、分光光度計、木質(zhì)素平板、纖維素培養(yǎng)液以及紫穗槐木材中實際測試從而獲 得對木質(zhì)素降解能力強而對纖維素降解能力弱的菌種。
本發(fā)明的另一個目的是提供高活性的降解木質(zhì)素的菌種，其特征在于生長 繁殖迅速，對木質(zhì)素降解能力強而對纖維素降解能力很弱。
目前， 一些降解木質(zhì)素的微生物已開始應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境處理。如黃 原孢毛平革菌和Phlebia brevispora等白腐菌已應(yīng)用于造紙工業(yè)中的生物制漿, 生物漂白等過程。Setliff利用真菌對楊木進(jìn)行了預(yù)處理，結(jié)果表明，與未經(jīng)真菌 處理相比，在盤磨機(jī)磨至相同游離度的情況下，楊木可以降低20%的能耗。用木 質(zhì)素降解菌處理飼料可提高動物對飼料的消化。而且秸稈可以轉(zhuǎn)化為有機(jī)肥料,
但自然轉(zhuǎn)化的過程較長，應(yīng)用白腐菌可以加快它的轉(zhuǎn)化速度。此外，木質(zhì)素降解 菌還可以應(yīng)用于污水處理，土壤恢復(fù)等領(lǐng)域。
本發(fā)明將取材于長白山的質(zhì)地松軟的腐朽木材用無菌的蒸餾水沒過浸泡兩 小時，然后將取200微升液體均勻涂到馬鈴薯培養(yǎng)板(PDA)上，28r培養(yǎng)2 天，選取不同位置的菌落于選擇培養(yǎng)基上多次劃板傳代，獲得單克隆菌株。本發(fā)明在獲得多株單克隆菌株后，繼而采用下述方法進(jìn)行了菌種的篩選， 從而獲得了具有高活性木質(zhì)素能力而對纖維素降解活性低的菌種。
首先使用苯胺蘭法初步選擇菌種，將菌種分別接種到選擇培養(yǎng)板苯胺蘭平 板上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察不同天數(shù)脫色情況，選出脫色能力強的菌種。我們在實驗中 以水為空白分別對苯胺蘭溶液和未加苯胺蘭的選擇培養(yǎng)液進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn) 苯胺蘭溶液在625nrn處有吸收峰而未加苯胺蘭的培養(yǎng)液在此處無吸收，故選擇 625nm測定不同濃度的苯胺蘭溶液的吸光度，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線形回歸方程。 將不同克隆的菌種接種到含苯胺蘭的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)五天，測定降解的苯胺蘭的 量。選出降解能力強的菌種。
將苯胺蘭法篩選出來的菌種接種到以木質(zhì)素作為唯一碳源的培養(yǎng)基上，觀 察不同天數(shù)的生長狀態(tài)，定性的確定其利用木質(zhì)素的能力強弱。
在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步利用纖維素法對菌種進(jìn)行進(jìn)一步篩選。將濾紙剪 成0.6cmX1.6cm的濾紙條，加缺碳源的培養(yǎng)液10ml，高壓滅菌后，接種有較高 降解木質(zhì)素能力的菌種，空白管為含濾紙片的培養(yǎng)液，置于28'C搖床里150轉(zhuǎn) 震蕩培養(yǎng)，定時觀察濾紙崩潰情況，崩解速度越快降解纖維素能力越強，反之亦 然。從而初步獲得對木質(zhì)素降解能力強而對纖維素降解能力很弱的菌種。
在初步獲得較理想的菌種后，我們利用紫穗槐木材對我們篩選獲得的菌種 進(jìn)行了實際測試。將紫穗槐枝條去皮，烘干，削成碎片，準(zhǔn)確稱量，高壓滅菌， 接種前幾步曬選出來的菌種，空白對照為不接種的菌的紫穗槐，陽性對照為購自 廣東微生物所的白腐菌GIM3.383， GIM3.393培養(yǎng)環(huán)境保持濕潤。對每一菌種降 解的紫穗槐在不同天數(shù)時用酸不溶解木質(zhì)素提取方法提取木質(zhì)素，計算其降解木 質(zhì)素以及纖維素的量，篩選出降解纖維素很弱而降解木質(zhì)素很強的菌種。重復(fù)該 實驗。
結(jié)果顯示本發(fā)明所獲得的菌種具有高降解木質(zhì)素的活性和很低的降解纖維 素的活性，其性能優(yōu)于上述購買的對照菌種。本發(fā)明的這些研究結(jié)果將會為該菌 種在造紙工業(yè)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
具體實施例方式
以下借助實施例描述本發(fā)明的最佳實施方式。這些實施例旨在進(jìn)一步舉例闡 明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明待批權(quán)利要求的范圍。 實施例l:菌種分離與純化
(1) 培養(yǎng)基的配制
馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA):馬鈴薯200g去皮，切成小塊煮沸30min，然后用 紗布過濾，濾液中再加蔗糖20g，瓊脂15g，補水至1000ml。 115。C滅菌20min。
(2) 菌種的分離與純化
將取材于長白山的質(zhì)地松軟的腐朽木材置于50毫升無菌離心管中，用無菌 的蒸餾水沒過浸泡兩小時，然后將取200微升液體均勻涂到馬鈴薯培養(yǎng)板(PDA) 上，28。C培養(yǎng)2天，再從長出的菌中，用接種環(huán)挑取不同位置的20-40個菌落至 馬鈴薯培養(yǎng)基平板劃線，將平板置于28'C培養(yǎng)2天，重復(fù)該步驟至少2次，獲 得單克隆菌株。
實施例2:苯胺蘭法初步選擇菌種
(1) 苯胺蘭平板法真菌降解木質(zhì)素一般是由于該菌產(chǎn)生了LiP及MnP等 可以降解木質(zhì)素的酶，這些酶可以使得染料苯胺蘭脫色，因此可以用來監(jiān)測氧化 物型木質(zhì)素酶，本實驗采用苯胺蘭平板法對菌種進(jìn)行初步篩選。將菌種分別接種 到選擇培養(yǎng)板苯胺蘭平板上進(jìn)行培養(yǎng)，同時用購于廣東省微生物研究所的白腐菌 GIM3.383和GIM3.393為對照，觀察不同天數(shù)脫色情況，選出脫色能力強的菌 種。
(2) 分光光度計法以水為空白分別對苯胺蘭溶液和未加苯胺蘭的選擇培 養(yǎng)液進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)苯胺蘭溶液在625nm處有吸收峰而未加苯胺蘭的培 養(yǎng)液在此處無吸收，故選擇625nm測定不同濃度的苯胺蘭溶液的吸光度，做出 標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線形回歸方程。因此不同克隆的菌種接種到含苯胺蘭的培養(yǎng)液中， 同時用購于廣東省衛(wèi)生研究所的白腐菌GIM3.383和GIM3.393為對照，培養(yǎng)五 天，利用分光光度計較為精確的測定降解的苯胺蘭的量，選出降解能力強的菌種。
實施例3:菌種的進(jìn)一步篩選 (1)培養(yǎng)基
A、選擇培養(yǎng)基蛋白胨3g， MgS04.7H20 (X5g,酒石酸銨0. 1 g, KH2P04
60.5g，MnSO4, 0.04g,CuSO4.H2O 0曹g，苯胺蘭O.lg,瓊脂18g，加蒸餾水至 1000ml 。 115。C滅菌20min。
B、木質(zhì)素降解培養(yǎng)基木質(zhì)素lg，酒石酸銨O. 1 g，MgSO40.5g,KH2PO40.5g， MnS04 0.04g, CuS04 .H20 0.007g，瓊脂18g，加蒸餾水至1000ml。 115。C滅菌 20min。
C、纖維素崩解培養(yǎng)液KH2P04 2.0g, (NH4)2S04 1.4g, MgS04.7H20 0.3g, CaCl2 0.3g,尿素0.3g,蛋白胨0.5g, FeSO4.7H20 0.005g， MnS04 0.0016, ZnS04 0.0017g， CoCl2 0.002g,加蒸餾水至1000ml ，壓力115。C滅菌20min。
(2) 木質(zhì)素平板法篩選
將苯胺蘭法篩選出來的菌種以及GIM3.383和GIM3.393為對照接種到以木 質(zhì)素為唯一碳源的降解培養(yǎng)基上，觀察不同天數(shù)的生長狀態(tài)，按照其生長狀態(tài)， 定性的確定其利用木質(zhì)素的能力強弱。
(3) 纖維素法進(jìn)一步篩選
將濾紙剪成0.6cmX 1.6cm的濾紙條，加纖維素崩解培養(yǎng)液10ml，高壓滅 菌后，接種有較高降解木質(zhì)素能力的菌種，空白管為含濾紙片的纖維素崩解培養(yǎng) 液，置于28'C搖床里150轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)，定時觀察濾紙崩潰情況，崩解速度越快 降解纖維素能力越強，反之亦然。選出崩解很弱者以及很強者。'
實施例4:紫穗槐木材中實際測試菌種效能
將紫穗槐枝條去皮，烘干，準(zhǔn)確稱量，削成碎片，高壓滅菌，接種上述實 施例篩選出來的菌種，空白對照為不接種的菌的紫穗槐，陽性對照為購自廣東省 微生物研究所的白腐菌GIM3.383， GIM3.393培養(yǎng)環(huán)境保持濕潤。對每一菌種降 解的紫穗槐在不同天數(shù)時用酸不溶解木質(zhì)素提取方法提取木質(zhì)素，計算其降解木 質(zhì)素以及纖維素的量，篩選出降解纖維素很弱而降解木質(zhì)素很強的菌種。重復(fù)該 實驗。
實施例5:所獲菌種的鑒定
白腐真菌是一種能夠引起木材白色腐朽的擔(dān)子菌，它腐生在木材或樹木上， 使木材上出現(xiàn)袋狀、片狀或者環(huán)形的淡色海綿狀團(tuán)塊，并因此得名。它能夠降解 其他微生物無法或很難降解的污染物，主要是依靠其胞外氧化酶——過氧化物 酶、過氧化錳酶、漆酶氧化降解。(1) 肉眼觀察
菌落形態(tài)采用在固體培養(yǎng)板上28。C培養(yǎng)四天，肉眼觀察菌絲長滿平板，相
互交錯連接，呈白色絮狀；在液體培養(yǎng)液中28°C， 150rpm/min，培養(yǎng)四天時， 白色菌體相互抱團(tuán)，形成球形絮狀物。
(2) 光學(xué)顯微鏡下觀察
使用六胺銀染色法對該菌染色，光學(xué)顯微鏡觀察該菌菌絲構(gòu)成，粗細(xì)均勻， 兩側(cè)菌絲壁平行，有橫隔，有分枝，呈放樹枝狀排列。
(3) 酶學(xué)的鑒定
過氧化物酶的檢測將該菌株接種于選擇培養(yǎng)基加苯胺蘭的平板上保溫培 養(yǎng)3天，菌體及菌絲周圍的苯胺蘭顏色變淺許多，證明有過氧化物酶存在。
漆酶分析檢測將該菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天，將0.04 mmol愈創(chuàng)木酚 加入至15mL濃度為95%的乙醇溶液中，滴定至PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌落邊緣， 經(jīng)4小時滴定區(qū)變淺紅色，說明該菌也分泌漆酶。
從菌體形態(tài)以及生理生化特征來看來看該菌屬于白腐真菌中的擔(dān)子綱、非褶 菌目，伏革科，顯革菌屬的黃孢原毛平革菌類。
實驗結(jié)果
1. 菌種的分離
將質(zhì)地松軟的腐朽木材置于50ml離心管中，用高壓過的蒸餾水沒過浸泡兩小 時，然后蘸取該液體劃在馬鈴薯培養(yǎng)板(PDA)上，30度培養(yǎng)2天，然后在從不 同位置挑菌，劃板，培養(yǎng)，再次挑菌，劃板，培養(yǎng)，共獲得單克隆菌種36株(編 號1-36)。
2. 苯胺蘭法初步選擇菌種
36株菌種中有8株(序號為l， 2， 8， 15, 18， 21， 28， 34，)培養(yǎng)4天后 就出現(xiàn)脫色環(huán)，對照組GIM3.383， GIM3.393在4天時亦可見脫色環(huán)，11號在6 天時能出現(xiàn)脫色環(huán)，有7株序號為(4， 7， 16, 24， 26， 30， 31)的菌株培養(yǎng)7 天后出現(xiàn)脫色環(huán)，有3株(序號為l， 2， 18) 7天時將藍(lán)色脫得很淡。由于未加 苯胺蘭的選擇培養(yǎng)液以水為空白在625nm處沒有吸收峰(圖2)，而苯胺蘭溶液 卻在此處有強吸收峰(圖3)，如圖l，圖2所示，再選擇不同濃度的苯胺蘭溶液做吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4)，獲得線形回歸方程yi.l43973x-0.01645相關(guān)系數(shù)Y 2=0.99198，再將苯胺蘭平板法選出9株(1， 2， 8， 11， 15， 18， 21， 28， 34) 脫色能力較強的菌株以及對照組GIM3.383， GIM3.393使用分光光度計法對其不 同時間的脫色能力進(jìn)行研究，實驗結(jié)果如表1，從中可以看出7株(1， 2， 8， 15， 18， 28， 34)有較強的降解苯胺蘭的能力。
表1 不同時間的苯胺蘭法測定的結(jié)果
編號 第一天稀釋10倍測第三天稀釋10倍測第六天稀釋10倍測
定OD625/苯胺蘭降解定OD62s/苯胺蘭降解定OD625/苯胺蘭降解
量(Xl(T8mol) 量(Xl(T8mol) 量(Xl(T8mol)
空白0.3931/0.000.3925/0.000.3910/0.003
10.3920/0.000.3228/9.960.1446/35.6
20.3919/0.000.2889/14.820.1257/38.32
80.3920/0.000.3550/5.290.2347/22.17
110.3930/0.000.3825/1.510.2532/20.13
150.3930/0.000.3224/10.160.2321/23.16
180.3929/0.000.3223/10.160.1680/32.38
210.3928/0.000.3820/1.550.2523/20.22
280.3926/0.000.3245/9.800.1824/30.26
340.3927/0.000.3533/5.670.1920/28.89
GIM3.3830.3926/0.000.3531/5.690.179/30.75
GIM3.3930.3928/0.000.3422/7.240.185/29.87
3. 木質(zhì)素法復(fù)篩菌種
苯胺蘭紫外法篩選的有較高活力的菌株(1， 2， 8， 15， 18， 28， 34)接種 到木質(zhì)素作為唯一碳源的降解培基上，培養(yǎng)觀察，發(fā)現(xiàn)6株(編號為l， 2， 15， 18， 28， 34)生長較迅速，三天就能長滿培養(yǎng)皿，證明其降解木質(zhì)素能力強，能 以木質(zhì)素作為碳源生長，8號生長緩慢，利用木質(zhì)素能力差。再將這6株細(xì)菌在該 培養(yǎng)基上多次培養(yǎng)馴化。
4. 纖維素法復(fù)篩菌種將上述6株菌種(編號為l， 2， 15， 18， 28， 34)接種到含濾紙條及15ml纖 維素崩解培養(yǎng)液50ml離心管中，空白對照為含有濾紙條及15ml纖維素崩解培養(yǎng) 液，培養(yǎng)到第6天時15號的濾紙條出現(xiàn)破潰，8天時較嚴(yán)重破潰，其他的6管的濾 紙條沒有變化。
5.紫穗槐木材中實際測試
將l， 2， 18， 28， 34以及購自廣東微生物所的GIM3.383， GIM3.393作為陽
性對照接種到2份高壓滅菌過的2g紫穗槐木屑中，分別在培養(yǎng)10和40天時采用酸 不溶解法提取其剩余的木質(zhì)素，計算木質(zhì)素和纖維素降解率，計算方法是木質(zhì) 素降解率=(降解前木質(zhì)素的質(zhì)量-降解后的木質(zhì)素的質(zhì)量)/降解前木質(zhì)素的質(zhì) 量X100。/。；纖維素降解率=[(降解前木材的量-降解后的木材的量)-(降解前木 質(zhì)素的量-降解后的木質(zhì)素的量)]/木材中纖維素的量X100。/。。從表中可以看出2 號降解木質(zhì)素能力最強，降解纖維素能力最弱，為最佳降解木質(zhì)素菌種。
表2菌種對紫穗槐木材中木質(zhì)素與纖維素降解作用的測試結(jié)果
編號IO天時降解的百分比40天時降解的百分比木質(zhì)素降解率纖維素降解率木質(zhì)素降解率纖維素降解率
空白0000
129.03%18.84%51.68%29.72%
235.48%14.50%65.17%18.12%
1832.25%23.18%56.17%20.72%
2829.03%23.18%60.68%26.12%
3429.03%21.73%61.80%21.63%
GIM 3.38332.25%18.84%61.79%22.52%
GIM 3.39329.03%24.63%62.92%34.23%
權(quán)利要求
1.一種高活性的降解木質(zhì)素的菌種，其特征在于生長繁殖迅速，對木質(zhì)素降解能力強而對纖維素降解能力很弱。
2. 按照真菌鑒定的方法，對權(quán)利要求l中的菌種進(jìn)行生理生化鑒定，其中所說的菌種為白腐真菌中的擔(dān)子綱、非褶菌目，伏革科，顯革菌屬的黃孢原毛平革菌類。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1中所描述的菌種特征，該菌種可用于造紙原材料的處理，及廢水處理等方面。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物菌種的篩選、純化和鑒定方法及其應(yīng)用，特別是涉及高效降解木質(zhì)素菌種的篩選純化，以及培養(yǎng)該高效降解木質(zhì)素菌種的方法及其應(yīng)用。
文檔編號C12N1/14GK101538536SQ20081005051
公開日2009年9月23日 申請日期2008年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月18日
發(fā)明者張新民, 顏煒群 申請人:吉林圣元科技有限責(zé)任公司