專利名稱：甘薯潛隱病毒的特異性引物、探針制備及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，特別是涉及甘薯潛隱病毒的特異性引物、 探針制備及檢測方法。二背景技術：
甘薯潛隱病毒(Sweet potato latent virus,縮寫為SPLV)，是侵染甘薯的主要 病毒之一，1979年臺灣學者在臺農65號甘薯品種上首次發(fā)現(xiàn)。SPLV病毒顆粒 為彎曲絲狀，長度為700 750nm。該病毒侵染甘薯一般不產生明顯的葉部癥狀， 有的僅產生輕度斑駁，SPLV可隨薯塊、薯苗營養(yǎng)繁殖體傳播，但蚜蟲、白粉虱、 種子不會傳播。SPLV屬于馬鈴薯Y病毒屬(尸o^v/n^)，具有許多Po/yv/ms病 毒的特性，如在被感染植株的細胞中產生特異性的內含體，與一些Po(yv/n^屬 病毒有血清學關系等。SPLV常與甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)、甘薯G病毒(SPVG)等化0^>^ 病毒混合侵染，造成甘薯產量降低，品質變劣和種性退化，對甘薯生產造成嚴 重危害。對甘薯病毒病目前尚無特別有效的化學防治方法，利用莖尖分生組織 培養(yǎng)，培育脫毒甘薯是防治病毒病最有效的方法。在培育脫毒甘薯的過程中， 需要對甘薯莖尖苗進行病毒檢測，由于大多數情況下SPLV在侵染甘薯時不產生 明顯癥狀，給該病毒的檢測、鑒定帶來難度。目前用于甘薯病毒檢測的常用方 法是酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)技術，但ELISA技術的靈敏度較低，而且SPLV、 SPVG和SPFMV三種病毒的抗體之間常有交互反應，不能對三種病毒進行特異 性檢測。三、 發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題提供一種甘薯潛隱病毒的特異性引物和利用該 引物制備探針的方法，建立了可有效區(qū)分其它甘薯病毒的核酸斑點雜交檢測技 術，為甘薯潛隱病毒的特異性檢測提供了一種簡便、有效和安全的方法。本發(fā)明的技術方案是甘薯潛隱病毒的特異性引物，其序列為SEQ1、 SEQ2， SEQ 1: 5 ，-GCCGACGAAACCATCATCGAT-3'， SEQ2: 5，-CATATGGATGCCACGCATTCC-3，。甘薯潛隱病毒的探針制備方法，運用所述的甘薯潛隱病毒的特異性引物 SEQ1、 SEQ2，以地高辛為標記物制備cDNA探針。所述的以地高辛為標記物制備cDNA探針的步驟為(1) 采用特異性引物SEQ 1 、 SEQ 2，用PCR方法從重組質粒pMDLVCP 中擴增出目的DNA片段，然后電泳回收目的DNA片段；PCR退火溫度為56°C;(2) 將l嗎的回收DNA片段加滅菌雙蒸水至16(il;(3) 在沸水中加熱5min使DNA變性，然后在冰上冷卻；(4) 充分混勻DIG-HighPrime,力t) 4pl到變性DNA中，混勻，瞬間離心， 于37。C孵育反應16h;(5) 再加入2ji1 0.2mol/L的EDTA，于65。C反應10min，終止反應。 甘薯潛隱病毒的檢測方法，運用所述的方法制得的探針建立核酸斑點的雜交檢測方法。本發(fā)明的積極有益效果(1) 本發(fā)明采用甘薯潛隱病毒SPLV的特異性引物SEQ 1、 SEQ2，以非放 射性物質地高辛(DIG)為標記物，制備了甘薯潛隱病毒的cDNA探針，建立了 可有效區(qū)分甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)和甘薯G病毒(SPVG)的核酸斑點 雜交檢測技術，為甘薯潛隱病毒(SPLV)的特異性檢測提供了一種簡便、有效 和安全的方法。(2) 本發(fā)明制備的探針具有較高的靈敏度。檢測結果表明，檢測重組質粒 pMDLVCP的最低濃度為h 1000，相當于可檢測出質粒DNA的最低量為0.26ng(見圖3)。(3) 本發(fā)明制備的探針具有較高特異性。用本發(fā)明制備的DIG探針去檢測 SPVG和SPFMV的質粒稀釋液，結果均無雜交信號出現(xiàn)，說明SPLV的DIG 探針具有較好的特異性。四

圖l: SPLV特異性引物的PCR擴增結果其中，泳道l為入DNA/EcoRI+歷"din標準分子量marker;泳道2為PCR產物。圖2: DIG探針雜交檢測結果 其中，1-2為重組質粒pMDLVCP樣品。圖3: DIG探針標記的靈敏度檢測結果其中l(wèi)-7代表質粒稀釋倍數，分別是10"-106。圖4: DIG探針檢測甘薯病毒結果 其中，A是質粒對照，B是甘薯病葉提取的總RNA， C是牽牛病葉提取的總RNA, l-4表示1(^-103稀釋。五具體實施例方式實施例甘薯潛隱病毒的特異性引物、利用該引物制備探針的方法及檢測方法。(一)、材料和方法1、 引物的設計與合成運用Vector NT軟件進行引物設計，確定制備SPLV探針所使用的引物。目 的片段大小為880bp左右。 SPLV的特異性引物為SEQ1: 5'-GCCGACGAAACCATCATCGAT-3，， SEQ 2: 5 ，-CATATGGATGCCACGCATTCC-3 ，。2、 RT-PCR:取田間顯癥甘薯苗的莖尖，嫁接到巴西牽牛上，待巴西牽牛出現(xiàn)系統(tǒng)花葉 癥狀后，取其葉片利用上海生工生物工程公司的Flash UNIQ柱式總RNA抽提試 劑盒，并按其說明書方法，提取感病葉片的總RNA。以提取的病葉總RNA為模 板進行反轉錄和PCR。即在10 )iL反應體系中加入l pL 10xRT buffer、 2 pL MgCL2 、 1 ^LdNTP混合物、0.5 jiL下游引物(SEQ2)、 0.25 ^LRNase抑制劑、 0.5 pLAMV反轉錄酶、4.75 pL總RNA，于42。C反應30 min, 99。C反應5min， 5°C反應5 min。反應結束后，取反轉錄產物作為模板，加入l P5引物，10 5xPCR buffer, 0.25jiL7^HS， 28.75 ddH20，進行PCR擴增。擴增條件為94。C預變 性2min， 94。C變性30s， 56。C退火30s， 72。C延伸2min，共30個循環(huán)。PCR結束 后，經0.8%瓊脂糖凝膠電泳，利用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒、回收880bp 左右的目的DNA片段(見附圖l)。3、 RT-PCR產物的克隆與鑒定將純化后的PCR產物與pMD18-Tvector連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5a， 經藍白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽性克??；然后由TaKaRa公司測定核苷酸序列 進一步驗證，將構建好的SPLV重組質粒命名為pMDLVCP。4、 探針的制備(1) 利用SPLV的特異性引物SEQ 1和SEQ 2，從重組質粒pMDLVCP中 擴增出目的DNA片段；電泳回收目的片段。(2) 將lpg的回收DNA片段加滅菌雙蒸水至16^1。(3) 在沸水中加熱10min使DNA變性，之后在冰上迅速冷卻。(4) 充分混勻DIG-High Prime,加4(il到變性DNA中，混勻，瞬間離心， 于37。C孵育反應16h。(5) 加入2^1 0.2mol/L EDTA(pH 8.0)于65。C反應10min，終止反應。 將標記好的探針放在-7(TC保存。5、 SPLVDIG探針的靈敏度和特異性檢測 (1)靈敏度檢測1) 樣品處理為鑒定所標記探針的靈敏度，對重組質粒pMDMVCP進行了 系列稀釋，分別為原液、1:10、 1:102、 1:103、 1:104、 1:105、 1:106，共7個處理。2) 剪取尼龍膜戴手套操作，用鑷子夾住膜邊，剪取2x4cm膜，剪去右上 角，以方便辨別正反面和左右位置，可用鉛筆在膜上做上點樣標記。3) 點樣將樣品在100。C時預變性5min，之后迅速冰上冷卻；取2pl樣品直 接點于尼龍膜上。4)固定點樣后，先置室溫自然干燥，之后將膜放置于干凈的培養(yǎng)皿中， 上下用原膜襯紙夾住，上壓一載薄片，以保持膜的平整；在12(TC烘箱中烘烤305) 預雜交將烘烤后的膜放入雜交袋中，加入預熱的標準雜交緩沖液(見 附錄)，37。C預雜交0.5h，并伴隨著輕微的搖動。6) 雜交將地高辛標記的探針用10(TC沸水煮5min，使其變性，迅速置冰 上冷卻，加入預熱的標準雜交液中，加入量為0.035mL/cm"尼龍膜，49。C雜交過 夜，并伴隨著輕微搖動。7) 洗膜雜交結束后，用2xSSC、 0.1X的SDS洗液常溫下洗膜2次，每次 15min，之后用0.5xSSC、 0.1 XSDS于68。C下洗膜2次，每次15min。8) 膜平衡將洗好的膜用Washing buffer (0.1 mol/L馬來酸，0.15mol/L氯 化鈉，pH值為7.5; 0.3%Tween20)漂洗5 min，以平衡膜。9) 膜封閉膜平衡之后，用鑷子把膜裝入新雜交袋中，用25mLBlocking solution (1%封閉劑，0.1mol/L馬來酸，0.15 mol/L氯化鈉，pH值為7.5)封 閉30 min。10) 抗體結合吸出膜中的Blocking solution,加入2-3 mL AP (堿性磷酸酶) 標記的DIG抗地高辛抗體堿性磷酸酶復合物，封膜，平置于搖床上，2(TC下輕 搖30 min。11) 洗膜用Washingbuffer洗滌液洗膜2次，每次15min。12) 膜平衡加入20mL Detection buffer(0.1mol/LTris-HCl， 0.1mol/L氯化 鈉，pH值為9.5)平衡5min。13) 生色反應在黑暗條件下，加入10mL新鮮配制的NBT/BCIP，顯色lh， 顯色結束后，用TE(10mmol/LTris-HCl， lmmol/LEDTA， pH值為8.0)溶液洗膜 5 min結束反應。14) 終止反應觀察到理想的顯色結果后，將膜移至滅菌水中終止反應。(2) 特異性檢測為鑒定SPLV D.IG探針的特異性，分別用SPLV的DIG探針去檢測SPVG 和SPFMV的重組質粒，雜交方法、步驟同靈敏度檢測。(3) 利用SPLVDIG探針檢測甘薯和牽牛感病葉片中的病毒用UN1Q-10柱式總RNA抽提試劑盒提取感染病毒的甘薯病葉總RNA，和通過嫁接獲得的巴西牽牛感病葉片的總RNA，用RNA稀釋液(H2O:20xSSC: 甲醛=5:3:2)對提取的總RNA進行系列稀釋。用制備好的SPLV DIG探針進行檢測，方法步驟同上。 (二)、結果1、 地高辛探針的獲得利用PCR方法從質粒pMDMVCP擴增出SPLV特性的DNA片段；對擴增 的產物回收、純化；再將所得的純化產物通過DIG-High Primer,制備地高辛標 記的探針。將標記好的探針與pMDMVCP質粒雜交，呈現(xiàn)了雜交信號，說明標記較為 成功(見附圖2)。2、 探針的靈敏度和特異性檢測結果 (1)靈敏度的檢測結果對重組質粒pMDLVCP進行系列稀釋，分別為原液、1:10、 1:102、 1:103、 1:104、 1:105、 1:106共7個處理。結果表明，地高辛標記的探針可檢測出重組質粒 pMDLVCP的最低濃度為1:1000，相當于可檢測出質粒DNA的最低量為0.26ng (見附圖3)。(2) 探針的特異性檢測結果 分別用SPLV的DIG探針去檢測SPVG和SPFMV的質粒稀釋液，結果均無雜交信號出現(xiàn)，說明SPLV的DIG探針具有較好的特異性。(3) 地高辛標記探針檢測甘薯葉片中的病毒點雜交結果圖顯示，利用SPLV的DIG探針能從甘薯病葉總RNA提取原液和 牽牛病葉總RNA提取原液中檢測到病毒的存在(見附圖4)，說明標記的探針可 用于甘薯病毒的檢測。附錄1、標準雜交緩沖液(300ml)的組成為20xSSC 一250ml 10% sodium-lauroylsarcosine 10ml 10% SDS 2ml II20 38ml上述緩沖液經DEPC處理，高溫高壓滅菌，然后隔離貯存。其中20xSSC (1000ml)的組成為NaCl (MW58.44) 175.32g Citrate (C6H807-H20, MW210.14) 63.042g H20 譜ml2、甘薯潛隱病毒的特異性引物序列表(見下頁)序歹IJ表<110〉河南省農業(yè)科學院植物保護研究所<120>甘薯潛隱病毒的特異性引物、探針制備及檢測方法 <160>2<170> Patentln3.4<210>1<211〉21<212>DNA<213>甘薯潛隱病毒(Sweet potato latent virus) <400>1GCCGACGAAA CCATC ATCGA T 21<210>2<211>21<212〉DNA<213>甘薯潛隱病毒(Sweet potato latent virus) <400>2CATATGGATG CCACGCATTC C 2權利要求
1、甘薯潛隱病毒的特異性引物，其特征在于，該特異性引物序列為SEQ 1、SEQ 2，SEQ 15’-GCCGACGAAACCATCATCGAT-3’，SEQ 25’-CATATGGATGCCACGCATTCC-3’ 。
2、 甘薯潛隱病毒的探針制備方法，其特征在于，運用權利要求1所述的 甘薯潛隱病毒的特異性引物SEQ 1、 SEQ 2，以地高辛為標記物制備cDNA探針。
3、 根據權利要求2所述的甘薯潛隱病毒的探針制備方法，其特征在于， 所述的以地高辛為標記物制備cDNA探針的步驟為(1) 采用特異性引物SEQ 1、 SEQ 2，用PCR方法從重組質粒pMDLVCP 中擴增出目的DNA片段，然后電泳回收目的DNA片段；PCR退火溫度為56°C;(2) 將l嗎的回收DNA片段加滅菌雙蒸水至16^1;(3) 在沸水中加熱5min使DNA變性，然后在冰上冷卻；(4) 充分混勻DIG-HighPrime,力Q 4^1到變性DNA中，混勻，瞬間離心， 于37。C孵育反應16h;(5) 再加入2pl 0.2mol/L的EDTA，于65。C反應10min，終止反應。
4、甘薯潛隱病毒的檢測方法，其特征在于，運用權利要求2或3所述的方 法制得的探針建立核酸斑點的雜交檢測方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程技術領域，特別是涉及一種甘薯潛隱病毒(SPLV)的特異性引物、探針制備及檢測方法。本發(fā)明以甘薯潛隱病毒SPLV病毒為材料，采用特異性引物SEQ 1、SEQ 2，以非放射性物質地高辛(DIG)為標記物，制備了SPLV的cDNA探針，建立了可有效區(qū)分甘薯G病毒(SPGV)、甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)的核酸斑點雜交檢測技術，為SPLV的特異性檢測提供了一種簡便、有效和安全的方法。
文檔編號C12Q1/70GK101230346SQ200810049089
公開日2008年7月30日 申請日期2008年1月15日 優(yōu)先權日2008年1月15日 公開號200810049089.發(fā)明者奇 喬, 張德勝, 張振臣, 王永江, 秦艷紅, 蔣士君, 黃玉娜 申請人:河南省農業(yè)科學院植物保護研究所