專利名稱：：Mx1基因作為豬生產(chǎn)性狀的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于豬遺傳(分子)標(biāo)記輔助選擇領(lǐng)域，具體涉及一種與豬生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記的篩選及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：根據(jù)生產(chǎn)性狀的表型值估算出育種值進(jìn)行動物育種，己經(jīng)大大促進(jìn)了家畜生產(chǎn)性狀的遺傳改良。九十年代以來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及在豬育種中的應(yīng)用，逐步出現(xiàn)了以分子標(biāo)記為核心的分子標(biāo)記輔助選擇和分子標(biāo)記滲入等分子育種技術(shù)，這些技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合大大加速了豬育種的進(jìn)程，能夠應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇的基因或標(biāo)記必須對目標(biāo)性狀具有較大的貢獻(xiàn)率，即主基因或標(biāo)記，因此尋找這些主基因或與之緊密連鎖的分子標(biāo)記成為分子標(biāo)記輔助選擇的基礎(chǔ)和前提，也是當(dāng)前和今后一段時(shí)間豬分子生物學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和急需解決的問題。目前巳有多個(gè)位于功能基因的內(nèi)部與生產(chǎn)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記被發(fā)現(xiàn)并申請專利，例如在傳統(tǒng)的豬育種計(jì)劃中，由于消費(fèi)者對瘦肉的興趣，因此主要選擇降低脂肪，降低脂肪主要以降低背膘厚來衡量，然而背膘厚下降同樣導(dǎo)致了肌內(nèi)脂肪的卜降，脂肪最后沉積的部位是肌肉，導(dǎo)致了肌肉品質(zhì)的下降。由于肌內(nèi)脂肪是難以在活體測量，并為了防止肌內(nèi)脂肪的進(jìn)一步下降，必須找到影響此性狀的分子標(biāo)記。Gerbens等證實(shí)了位于豬6號染色體上的心脂肪酸結(jié)合蛋白與肌內(nèi)脂肪含量和其它生產(chǎn)性狀的關(guān)系，該基因已被申請專利，專利號為W097/35878，另夕卜，Rothschild等發(fā)現(xiàn)Leptin受體基因與瘦肉率有關(guān)的分子標(biāo)記，其專利號為U.S.Pat.Nos.5972621。MX蛋白是由Lindenmann等在研究近交系A(chǔ)2G小鼠對流感病毒具有天然免疫力這一現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)，并命名的一種GTPase結(jié)合蛋白，主要對RNA病毒敏感，具有抗流感病毒功能(LindenmannJ,LaneCA,HobsonD.TheresistanceofA2Gmicetoorthomyxoviruses.JImmunol,1963，90:942—951)。體內(nèi)外試驗(yàn)研究表明，皿基因受I型干擾素、雙鏈RNA的誘導(dǎo)或在病毒感染的情況下被激活，表達(dá)MX蛋白發(fā)揮GTP酶活性水解病毒核衣殼，抑制病毒復(fù)制，以抵抗病毒對細(xì)胞的感染。豬AQ7基因定位于第13號染色體上與干擾素受體l基因緊密連鎖，包含一個(gè)663個(gè)氨基酸堿基的開放式閱讀框，與人和鼠的MW基因相似(RettenbergerQBruchJ，F(xiàn)riesR，ArchibaldAL，HameisterH.Assignmentof19porcinetypeIlocibysomaticcellhybridanalysisdetectsnewregionsofconservedsyntenybetweenhumanandpig.MammGenome,1996,7(4):275—279)。MXl基因是迄今為止找到的為數(shù)不多的抗性基因或抗性標(biāo)記之一，豬的生產(chǎn)性能受疾病感染和遺傳機(jī)制雙重因素影響，如果豬對某種疾病只有部分抗性，則其生產(chǎn)性能下降程度由抗性程度和感染程度決定。目前對抗病力、免疫應(yīng)答能力與生產(chǎn)性能之間的關(guān)系研究結(jié)果有一定的差異。例如'Meeker等(MeekerDL,RothschildMF,ChristianLL,WarnerCM,HillHTGeneticcontrolofimmuneresponsetopseudorabiesandatrophicrhinitisvaccines:I.Heterosis,generalcombiningabilityandrelationshiptogrowthandbackfat.JAnimSci.1987，64(2):407-413)發(fā)現(xiàn)生長速度與接種了支氣管敗血巴氏桿菌商品疫苗或偽狂犬病毒疫苗后的免疫應(yīng)答呈負(fù)相關(guān)，豬的SLA與生長、背膘和繁殖性狀間的聯(lián)系多呈正相關(guān)。本發(fā)明提供了抗病基因MY7基因第八內(nèi)含子內(nèi)的遺傳變異與胴體和肉質(zhì)性狀間的關(guān)系。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克隆一個(gè)與豬生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記，該遺傳標(biāo)記是從豬MX1基因序列克隆得到的一段特異DNA片段，已知豬MX1基因是調(diào)控疾病性狀的，而本發(fā)明則是與豬生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)的，是一個(gè)與豬生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)的新的遺傳標(biāo)記，同時(shí)本發(fā)明還涉及該遺傳標(biāo)記的制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種篩選的與豬生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:l所示。其中序列表SEQIDNO:1的第167bp處有一個(gè)A167—G167的突變，導(dǎo)致HpaII—RFLP多態(tài)性。其中檢測所述堿基突變的引物對的DNA序列如下所示正向引物F:5'TTACAGAAGTATGGCTCCG3',反向引物R:5'TTGGTAAACAGCCGACAC3'。一種篩選適用于與豬生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記的方法，按照以下步驟-從豬血液中提取基因組DNA，根據(jù)豬MW基因序列設(shè)計(jì)引物，得到的引物序列如下正向引物F:5'TTACAGAAGTATGGCTCCG3',反向引物R:5'TTGGTAAACAGCCGACAC3'。用所示的引物在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化克隆測序，獲得如如序列表SEQIDNO-l所示的核苷酸序列，其中包含A167—G167的突變。本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用邵a11—RFLP不同基因型個(gè)體與生產(chǎn)性狀間的關(guān)聯(lián)分析中的應(yīng)用。本發(fā)明的具體實(shí)施方案見《具體實(shí)施方式》所述。序列表SEQIDNO:1是本發(fā)明克隆的外來品種"大白豬"的核苷酸序列；圖l:是外來血緣豬大白豬、長白與和中國血緣豬通城豬和清平豬MW基因序列比對結(jié)果和SNP位點(diǎn)；圖2:是豬MO基因第8內(nèi)含子擴(kuò)增結(jié)果；瓊脂糖濃度為1.5%;圖中泳道M為DL2000Marker;泳道1一4分別為大白豬、長白豬、通城豬和清平—豬中的擴(kuò)增片段，片段大小為563bp。圖3:豬MXl基因i^"II一RFLP檢測結(jié)果。瓊脂糖濃度為1.5%;圖中泳道M為DL2000Marker;AA基因型'339bp，224bp;AB基因型'339bp'224bp，174bp，165bp;BB基因型，224bp，174bp,165bp。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1豬iJ/A7基因片段的獲得及多態(tài)性檢測方法的建立選擇外來血緣豬"大白豬""長白豬"和中國地方血緣豬"通城豬"和"清平豬"為試驗(yàn)材料根據(jù)必17基因的基因組序歹lJ(GenBank登陸號DQ144503)設(shè)計(jì)以下引物正向引物F:5'TTACAGAAGTATGGCTCCG3'，反向引物R:5'TTGGTAAACAGCCGACAC3'。用上述引物對在大白豬、長白豬、通城豬和清平豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系25UL，體系中各組分的濃度為50ng模板DNA、1XT叫buffer2.5mmol/L、1.5mmol/LMgC12、2.5mmol/LdNTPs、0.5mmol/LPCRprimers、2UTaqDNA聚合酶(MBI)，PCR的運(yùn)行程序如下預(yù)變性94°C4min;94。C45s，59°C40s,72°C40s，35個(gè)循環(huán)；最后72。C繼續(xù)延伸10min。對上述四個(gè)豬種的PCR產(chǎn)物經(jīng)GelExtractionKit試劑盒(購自上海生工生物工程技術(shù)有限公司，按照試劑盒說明書操作)純化、克隆測序。上述擴(kuò)增片段的人小為563bp，序列經(jīng)ClusterW軟件進(jìn)行序列比對，其中位于該片段167bp處(位于第8內(nèi)含子中)A/G變異引起了/^alI酶切位點(diǎn)(C'CGG)多態(tài)。取5uLPCR產(chǎn)物加入限制性內(nèi)切酶0.5uL(IOU/uL),10Xbuffer1nL，ddH203.5uL,置37。C恒溫反應(yīng)過夜，后經(jīng)1.5。/。的瓊脂糖凝膠凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄酶切分型結(jié)果。當(dāng)167bp處的堿基都為A時(shí)/f/7alI不識別該位點(diǎn)，記為AA型(339bp+224bp),當(dāng)突變位點(diǎn)堿基都為G時(shí)fl^a11酶識別該位點(diǎn)，記為BB型(224bp+174bp+165bp)，當(dāng)G和A都存在時(shí)記為AB型(339bp+224bp+174bp+165bp)。豬MO基因的PCR--RFLP的酶切分型結(jié)果如圖3。實(shí)施例2本發(fā)明克隆的遺傳標(biāo)記在不同豬群中的多態(tài)性分布檢測在四個(gè)中國豬種(梅山、通城、清平、鄂西黑豬)和兩個(gè)國外豬種(大白、長白)檢測豬MW基因第8內(nèi)含子PCR-i^alI-RFLP多態(tài)性分布頻率，檢測結(jié)果如表l所示。在六豬種中基因型頻率和基因頻率無明顯差異，BB基因型占優(yōu)勢，在梅山豬群體中只有BB基因型；等位基因B的的頻率較高，在人白、長白、梅山、通城、清平、鄂西六個(gè)品種中等位基因的頻率分別為0.83、0.89、1.00、0.94、0.87、0.89。表likO:/基因第8內(nèi)含子g/;3n酶切多態(tài)在不同品種中的分布結(jié)果IIH#n,等位基因頻率品種數(shù)量基因型GenotypeAllelefrequencyBreedNumberAAABBBAB大白LargeWhite383(0.08)7(0.18)28(0.74)0.170.83長白Landrace321(0.03)(0.16)26(0.81)0.110.89梅山Meishan300(0,00)0(0.00)30(1.00)01.00通城Tongcheng241(0.04)1(0.04)22(0.92)0.060.94清平Qingping28(0.07)3(0.11)23(0.82)0.130.87鄂西Exi352(0.06)4(0.11)29(0.83)0.110.89實(shí)施例3本發(fā)明克隆的遺傳標(biāo)記與豬生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析及應(yīng)用為了確定豬il^W基因多態(tài)性與豬表型性狀是否相關(guān)，選擇280頭大白x梅山F2代資源群體為試驗(yàn)材料，采用實(shí)施例1所建立的i/戶II-RFLP方法進(jìn)行多態(tài)性檢測,采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件((SASInstituteInc,Version8.0)glm程序進(jìn)行單標(biāo)記方差分析，分析豬基因i/戸II-RFLP不同基因型與豬生產(chǎn)性狀的相關(guān)關(guān)系，同時(shí)采用reg程序計(jì)算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，所采用模型為模型~，+6r+6妙J^He種為性狀表型值，p為平均值，G,為基因型效應(yīng)(包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)；加性效應(yīng)用-l，0和1分別代表AA，AB和BB基因型，顯性效應(yīng)用1，-1和1分別代表AA，AB和BB基因型)；S、K為固定效應(yīng)，分別為性別、年度效應(yīng)，6#為屠宰體重或屠宰日齡的回歸系數(shù)，胴體性狀以屠宰體重為協(xié)變量，肉質(zhì)性狀以屠宰日齡為協(xié)變量，^為殘差效應(yīng)。由表2可以看出/^alI-RFLP基因型不同時(shí)，屠宰率、瘦肉率、眼肌高存在顯著差異，該位點(diǎn)在屠宰率、眼肌高表現(xiàn)為加性效應(yīng)，加性效應(yīng)值分別為0.689±0.374和-0.399±0.155;眼肌高和瘦肉率表現(xiàn)為顯性效應(yīng)，顯性效應(yīng)分別為-0.208±0.123和-0.56±0.233。表2豬MA7基因第8內(nèi)含子PCR-及/;aZr-RFLP基因型與胴體和肉質(zhì)性狀的統(tǒng)計(jì)分析表^0^01-77戸//-虹0>基因型(n±SE)基因效應(yīng)(n±SE)<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><110〉湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所〈120〉^i7基因作為豬生產(chǎn)性狀的遺傳標(biāo)記及應(yīng)用<130><141>2008-08-22〈160〉1<170>Patentlnversion3.1〈210〉1〈211>563<212>腿〈213〉豬(Susscrofa)〈220〉<221〉gene<222>(1)..(563)<223>〈220>〈221>primer—bind<222>(l)..(19)〈223〉<220>〈221>primer—bind<222>(546)..(563)<223><220>〈221>mutation〈222>(167)..(167)<223〉〈400〉1ttscag肌gtatggctccgat8ttCC3g3gg3tg3卿Cggg卿atgttttttctgata60g3tgtgsgtgctgcc鄉(xiāng)ggcgcc犯ggtggagaagcatccaccattgtcC3g卿gggg120ccatgtgctttgcacgtgtctcgcttcattcccctcaggctg3tCC3g3Ctcatgctgcc180cacttagcccC3C卿gCggcc鄉(xiāng)ttgggggCtgggt3g3C￡Lggg3gtgggggaccgtc240ccattcacgccactggctcttcatc犯gtgcgctcacctggcagtaggga300gggtgggattgcctgctgccaaagcccctgctctccctccggacgcgcacctgctcccca360cccgcaccctgcccsttaggggctcgccagccctgtctgcaccctctcca420aatcacctcttatatttgcaatatttccgcttatacgaatgtgtttcctt480atcgatgcattt犯tsgtgatatcactgctg卿gg獄tggtggtggag540tacgagtgtcggctgtttacC3￡l56權(quán)利要求1、一種篩選的與豬生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQIDNO1所示。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的遺傳標(biāo)記，其特征在于，序列表SEQIDNO:1第167bp處有一個(gè)A167—G167的突變，導(dǎo)致i7戸n—RFLP多態(tài)性。3、檢測權(quán)利要求2所述堿基突變的引物對的DNA序列如下所示正向引物F:5'TTACAGAAGTATGGCTCCG3'，反向引物R:5'TTGGTAAACAGCCGACAC3'。4、一種篩選適用于豬生產(chǎn)性狀關(guān)聯(lián)的遺傳標(biāo)記的方法，按照以下步驟從豬血液中提取基因組DNA，根據(jù)豬MH基因序列設(shè)計(jì)引物，得到如權(quán)利要求3所示的引物，用權(quán)利要求3所示的引物在豬基因組DNA中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化克隆測序，獲得如如序列表SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，其中包含A167—G167的突變。5、權(quán)利要求1或2所述的遺傳標(biāo)記在豬標(biāo)記輔助選擇中應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明屬于豬遺傳標(biāo)記制備
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種豬生產(chǎn)性狀基因MX1第八內(nèi)含子突變位點(diǎn)多態(tài)性檢測方法及作為豬生產(chǎn)性狀遺傳標(biāo)記的克隆和應(yīng)用。從豬血液中提取基因組DNA，設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增，克隆測序獲得563bpDNA序列，序列比對分析發(fā)現(xiàn)在序列表SEQIDNO1第167bp處有一個(gè)A167-G167的突變，導(dǎo)致HpaII-RFLP多態(tài)性。利用該遺傳標(biāo)記，在不同豬群中檢測了該標(biāo)記基因的基因型頻率和基因頻率及與豬生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)分析，表明該遺傳標(biāo)記與豬某些重要生產(chǎn)性狀存在顯著相關(guān)。本發(fā)明公布了豬MX1基因第八內(nèi)含子的SNP分型檢測技術(shù)，為豬的標(biāo)記輔助選擇提供了新的標(biāo)記和檢測方法。文檔編號C12N15/12GK101353700SQ200810048949公開日2009年1月28日申請日期2008年8月22日優(yōu)先權(quán)日2008年8月22日發(fā)明者政馮,劉貴生,華孫,宋忠旭,彭先文,李明波,李良華,梅書棋,武華玉,銳郭,郭萬正,黃京書申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所