專利名稱：：一種與豬肌肉品質(zhì)相關(guān)分子標(biāo)記csrp3克隆及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于家畜基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種與豬肌肉品質(zhì)相關(guān)的分子標(biāo)記CSRP3克隆及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：豬肉是我國(guó)人民動(dòng)物蛋白的主要來源。在過去數(shù)十年時(shí)間里，隨著國(guó)外高瘦肉率和快生長(zhǎng)速度種豬的引進(jìn)，我國(guó)豬肉生產(chǎn)在數(shù)量上逐漸滿足了市場(chǎng)的需求。但是，對(duì)瘦肉率和生長(zhǎng)速度過度選擇而培育的種豬在肌肉品質(zhì)方面卻不及中國(guó)地方豬。隨著生活水平的提髙和消費(fèi)觀念的改變，色、香、味俱佳且安全、營(yíng)養(yǎng)的瘦肉越來越受到消費(fèi)者的青睞。因此，肌肉品質(zhì)的改良已成為當(dāng)今優(yōu)質(zhì)豬育種工作的重耍目標(biāo)，相關(guān)分子標(biāo)記的尋找是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的重要手段。肌肉品質(zhì)是一個(gè)綜合性狀，常常通過肌肉pH值、肌內(nèi)脂肪含量、大理石紋、系水力、剪切力、滴水損失、肉色、嫩度、肌纖維直徑等指標(biāo)進(jìn)行度量。這些指標(biāo)之間并不是獨(dú)立的，而是彼此聯(lián)系，共同決定最終的肌肉品質(zhì)。對(duì)于豬肌肉品質(zhì)等復(fù)雜性狀的分子標(biāo)記篩選通常采用QTL掃描結(jié)合候選基閃克隆的策略，即首先構(gòu)建一個(gè)資源群體，測(cè)定肌肉品質(zhì)相關(guān)的各種指標(biāo)，并進(jìn)行全基因組的QTL掃描，再在QTL區(qū)域內(nèi)采用功能候選基因法或位置克隆的策略篩選相應(yīng)的標(biāo)記。依據(jù)PigOTLdbfhttp:〃www.animalgenome.org/OTLdb/Die.html)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，與肌肉品質(zhì)相關(guān)的OTL己經(jīng)超過1000個(gè)，幾乎分布在豬所有的染色體上，其中2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)、11號(hào)、14號(hào)、15號(hào)和17號(hào)染色體上與肌肉品質(zhì)相關(guān)的QTL最為密集。盡管大量與肌肉品質(zhì)相關(guān)的QTL被定位，但是影響肌肉品質(zhì)的基因及分子標(biāo)記硏究卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于-此。目前，國(guó)內(nèi)外己經(jīng)鑒定的影響肌肉品質(zhì)的主效基因包括(1)/I7W基因(Fujii,J等，Identificationofamutationinporcineryanodinereceptorassociatedwithmalignanthyperthermia.Sc/ence，1991，253:448^451),硏究表明該基岡的C1843T錯(cuò)義突變是導(dǎo)致豬產(chǎn)生應(yīng)激綜合癥而發(fā)生肌肉品質(zhì)下降的主要原因，(2)戶i^G3基因(Milan,D等，AmutationinPRKAG3associatedwithexcessglycogencontentinpigskeletalmuscle.ScZence,2000，288:1248-1251),研究表明該基因的一個(gè)突變是導(dǎo)致漢普夏豬產(chǎn)生"酸肉"的主要原因。這兩個(gè)基因的致因突變均已被鑒定，且得到了很好的分子生物學(xué)解釋，因此已被作為分子標(biāo)記用于淘汰"氟烷"敏感基因和"酸肉"基因的育種實(shí)踐中。而其他一些與肌肉品質(zhì)相關(guān)的基因盡管現(xiàn)在還沒找到致閃突變，但是卻發(fā)現(xiàn)其多態(tài)與肌肉品質(zhì)性狀存在顯著相關(guān)，這些基因包括(1)C4Sr基因(Ciobanu,DC等，Newallelesincalpastatingeneareassociatedwithmeatqualitytraitsinpigs.Jouma/ofiAW/na/Sc/ence,2004,82:2829-2839),研究表明該基因的多個(gè)SNP與肌肉嫩度等多個(gè)肉質(zhì)性狀存在顯著相關(guān)。(2)//-/545戶基因(Gerbens，F(xiàn)等，Theeffectofadipocyteandheartfattyacid-bindingproteingenesonintramuscularfatandbackfatcontentinMeishancrossbredpigs.Jou/na/oMn/Vra/ScZerce,2000，78:552-559),研究表明該基閃的突變與肌內(nèi)脂肪含量存在顯著相關(guān)。(3)CO基因(Wang，H匕等，MolecularcharacterizationandassociationanalysisofporcineCA3.CytogeneticandGenomeResearch,2006，115:129-133),研究表明該基閃的突變與肌內(nèi)脂肪含量及腿臀比例存在極顯著相關(guān)。與已經(jīng)定位的QTL相比，已經(jīng)鑒定出致因突變或發(fā)現(xiàn)存在相關(guān)的基因數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，說明大量的與肌肉品質(zhì)相關(guān)的基因有待進(jìn)一步鑒定。豬2pl4-17染色體區(qū)段存在大量與肌肉品質(zhì)相關(guān)的QTL，而CS/iW基因是位于此區(qū)域的一個(gè)重要的功能候選基閃。(cysteineandglycine-richprotein3，CSRP3)基因，乂稱為MuscleLIMprotein(MLP)或cardiacUMprotein(CLP)，是編碼LIM結(jié)構(gòu)域蛋白CSRP基因家族成員之一。研究表明小鼠CS/J/y基因僅在橫紋肌中表達(dá)，且其表達(dá)與肌分化過程相一致，是一個(gè)肌發(fā)生的正調(diào)節(jié)因子(Arber,S.等，MuscleLIMprotein,anovelessentialregulatorofmyogenesis,promotesmyogenicdifferentiation,Ce//，1994,79:221-31)。CS/IPJ基図敲除小鼠表現(xiàn)出增生性心肌炎及心臟功能紊亂的形態(tài)及臨床特征(Arber,S.等，MLP-deficientmiceexhibitadisruptionofcardiaccytoarchitecturaloiganization，dilatedcardiomyopathy,andheartfailure,Ce//，1997,88:393-403:Geier，C等,MutationsinthehumanmuscleLIMproteingeneinfamilieswWihypertrophiccardiomy叩athy，C/rcw/加'ow,2003,107:13卯-1395)。免疫組化分析表明MLP蛋白在大鼠慢肌中組成性的表達(dá)，而在快肌中低表達(dá)，而且MLP在快型骨骼肌蛋白轉(zhuǎn)換為慢型骨骷肌蛋白過程中上調(diào)表達(dá)(>Villmann，R等,MuscleLIMproteinisupregulatedinfastskeletalmuscleduringtransitiontowardslowerphenotypes,AmJPhysiolCellPhysiol,2001，280:C273-9);另有研究表明，C5KPJ基因編碼產(chǎn)物MLP可以通過一種物理的方式與肌肉組織基本的螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生作用，這種作用具有高度的特異性，即MLP不與非肌源性bHLH蛋白(如E12和E47)或成肌增強(qiáng)因子-2(MEF2)發(fā)生作用(Kong,Y等,MuscleLIMproteinpromotesmyogenesisbyenhancingtheactivityofMyoD,MolCellBiol,1997，17:4750-60)。MLP可能以共激活因子的形式促進(jìn)肌源性bHLH蛋白與特定DNA調(diào)控元件的結(jié)合(Kong,Y等，MuscleLIMproteinpromotesmyogenesisbyenhancingtheactivityofMyoD，MolCellBiol,1997，17:4750-60)。由此可見，CS朋J基因在橫紋肌發(fā)育中具有重要的正調(diào)節(jié)作用，且可能參與肌纖維類型及分布的調(diào)節(jié)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克隆一種與豬肌肉品質(zhì)相關(guān)的分子標(biāo)記CSRP3,為豬標(biāo)記輔助選擇提供一種方法的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)實(shí)現(xiàn)克隆得到一種豬肌肉品質(zhì)相關(guān)基因CS/ZP丄它的cDNA序列如序列表SEQIDNO:1所述。所獲得的cDNA序列全長(zhǎng)為939bp，包含S85bp的完整CDS,編碼194個(gè)氨基酸。依據(jù)獲得的如序列表犯QIDNO:1所述CDNA序列設(shè)計(jì)引物，通過擴(kuò)增和測(cè)序獲得了C忍2W基因的部分核苷酸序列，如序列表SEQ1DNO:2所述。該序列長(zhǎng)度為6231bp，其中第1924bp處有一個(gè)C1924-T1924的堿基突變，導(dǎo)致7b《IPCR-RFLP多態(tài)性。本發(fā)明設(shè)計(jì)了一對(duì)檢測(cè)C1924-T1924堿基突變的引物對(duì)，其DNA序列如下所示正向引物5'GGTACTGTTCGCCAAGGAGA3'，反向引物《5'TCCAGGAAAGTGGGTGAAGA3'。一種篩選適用于豬肌肉品質(zhì)性狀標(biāo)記輔助選擇的分子標(biāo)記的方法，按照以下步驟用人CS朋J基因cDNA為探針，作同源序列篩選，獲得同源性卯％以上的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST):然后拼接豬EST-重疊群;根據(jù)EST-重費(fèi)群序列設(shè)計(jì)引物，通過擴(kuò)增獲得如序列表SEQIDNO:1所述的cDNA序列；依據(jù)該cDNA序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增通城豬和長(zhǎng)白豬基因組DNA,獲得如序列表SEQIDNO:2所述的DNA序列，其中包含C1924-T1924突變。本發(fā)明的具體實(shí)施方案如《具體實(shí)施方式》所述。序列表SEQIDNO:I是本發(fā)明克隆的與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)的GS/JPJ基因的cDNA序列；序列表SEQIDNO:2是本發(fā)明克隆的與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)的CS/y基因的核苷酸序列；圖1:是本發(fā)明技術(shù)流程圖2:是本發(fā)明中用于r叫IPCR-RFLP分型所用的豬CS/P3基岡DNA序列片段，下劃線為引物。圖3:是本發(fā)明克隆的豬CS/基因第4外顯子的r叫IPCR-RFLP的三種基因型電泳結(jié)果。圖中M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(lOObpladder)具體實(shí)施例方式實(shí)施例lCSJMy基因的核苷酸序列克隆1.CSKP基因的cDNA克隆(1)引物設(shè)計(jì)利用報(bào)道的人GWW基因的mRNA序列(GenBank收錄號(hào)NM—003476.2)為信息探針，利用NCBI中的BLAST工具在GenBank豬EST數(shù)據(jù)庫(kù)中做同源序列篩選，獲得一系列同源性為卯％以上的ESTs(片段長(zhǎng)度大于lOObp),利用DNAStar軟件中的SeqMan程序構(gòu)建豬CS/P3基因EST-重疊群，據(jù)此分別設(shè)計(jì)5'RACE外側(cè)引物P-50、5'RACE內(nèi)側(cè)引物P-51、3'RACE外側(cè)引物P-30和3'RACE內(nèi)側(cè)引物P-3I,引物DNA序列如表1所示表1:用于CSJiy基因cDNA克隆的引物序列設(shè)計(jì)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)RACE擴(kuò)增參照TriZoL試劑盒(美國(guó)G舊CO公司產(chǎn)品)說明書步驟，利用該試劑盒從成年長(zhǎng)白豬肌肉組織中提取總RNA;利用經(jīng)DEPC處理的超純水溶解總RNA，利用DnaseI酶(美國(guó)Promega公司產(chǎn)品)于37°C處理30分鐘、并經(jīng)等體積的酚-仿抽提進(jìn)行RNA的純化；通過DU640核酸-蛋白質(zhì)濃度測(cè)定儀(美國(guó)Beckman公司產(chǎn)品)測(cè)定RNA的濃度，用1.2%的甲醛凝膠電泳檢測(cè)其完整性。利用RACE試劑盒(美國(guó)CLONTECH公司產(chǎn)品)首先進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，cDNA笫一鏈合成之后首先以此產(chǎn)物為擴(kuò)增模版，利用基因特異性外側(cè)引物(GSP-50和GSP-30)及上述RACE試劑盒中的通用引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系按照該試劑盒說明書配置；擴(kuò)增條件為95"C3min;34*(94C30sec，65t;,30sec，72X:,lmin):72t:,5min;15匸，2min'在此基礎(chǔ)上，將第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍，以此稀釋液為模版，利用基因特異性內(nèi)側(cè)引物(GSP-5I和GSP-3I)及RACE試劑盒中的內(nèi)側(cè)通用引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系按照說明書配置，PCR反應(yīng)條件與第一輪擴(kuò)增條件相同。(3)RACE產(chǎn)物純化、克隆與測(cè)序按照PCR產(chǎn)物純化試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品)說明書操作耍求進(jìn)行RACE產(chǎn)物的純化，將純化RACE產(chǎn)物與pGEM-T載體(美國(guó)Promega公司產(chǎn)品)連接，迕接反應(yīng)總體積是5pl，其中包括2.5fil2xbuffer,0.5pl的pGEM-T載體，0.5(il的純化PCR產(chǎn)物，0.5pl的T4DNA連接酶(美國(guó)Promega公司產(chǎn)品)，最后加入1(il滅菌水置161C水浴過夜無菌狀態(tài)下取100~120jJ感受態(tài)細(xì)胞于1.5mlEpendorff管中，將5(il的連接產(chǎn)物加入泡勻，在冰上放置30rnin,熱激卯s.其間不要搖動(dòng)Ependorff管，取出后冰浴3~4tnin，加入400nl無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37"C振蕩培養(yǎng)45min。取100til涂布于已提前4h涂布了IPTG(Is叩opylthio^-D-辟lactoside,異丙基硫代一P-D—半乳糖苷)和X-gal的瓊脂平板上，37"C平放lh后倒置培養(yǎng)；用牙簽挑取單克隆置于1.5mlEppetidorf管中，37C培養(yǎng)68小時(shí)，取菌液作為PCR擴(kuò)增的模版，利用RACE擴(kuò)增的內(nèi)側(cè)引物(GSP5I/GSP31)配合通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，有陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物者即為陽(yáng)性克隆子；陽(yáng)性齒液送由北京奧科生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。豬CSRW基因cDNA克隆的結(jié)果對(duì)于CSKW基因的雙向RACE擴(kuò)增均獲得了特異的擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，5'RACE和3'RACE產(chǎn)物實(shí)際大小分別為539bp和562bp，通過Seqman拼接測(cè)序序列并去掉外源的通用引物發(fā)現(xiàn)豬CSRP3基因cDNA全長(zhǎng)為939bp,包含103bp的5'UTR，585bp的CDS和251bp的3'UTR。通過ORF預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)豬CS7JP3基因編碼194個(gè)氨基酸。2.CSRiy基因的DNA克隆與SNP掃描(1)引物設(shè)計(jì)利用獲得的豬CHW基閃DNA序列比對(duì)人CSRP3基因的基因組DNA，初步推測(cè)豬CSRPJ基因的結(jié)構(gòu)，在第三至最后一個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)引物，引物序列設(shè)計(jì)如表2所示。表2:用于CSiWy基因DNA克隆的引物引物引物序列引物位置退火溫度產(chǎn)物大小PrimerPrimersequences(5，-3，)PrimerlocationAnnealTemperatureProductsize(bp)E3S1gcagctcacgagtcagagatctaExon3601951E3A1gcagcatagactgactttccacatE4S1cagcaacccttccaagttcactExon4602519E4A1gtctttgtcagtgacg卿ggaExon5E5S1cctgttttcgctgtgccatctExon5621902E5A1ctcccagcccaggtatcatcaExon6(2)PCR擴(kuò)增及SNP掃描利用寶生物工程(大連)有限公司的rTaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20W，包括如下組分IXPCRbuffer,75拜ol/L的dNTP,0.3nmol/L引物，0.9-1.5mmol/L的Mg2+,IUT叫DNA聚合酶，50ng豬基因組DNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增程序，退火溫度如表3所示，延伸時(shí)間為1分鐘30秒。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用天根生化科技(北京)有限公司的純化試劑盒回收后，直接送交北京奧科生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序。在上述DNA克隆過程中，對(duì)于每一段序列的PCR擴(kuò)增，同時(shí)利用外來豬長(zhǎng)白豬和中國(guó)地方豬通城豬基因組DNA作為模版,即在擴(kuò)增過程中，對(duì)于每一對(duì)引物，分別擴(kuò)增8個(gè)長(zhǎng)白豬DNA和8個(gè)通城豬DNA,將長(zhǎng)白豬與通城豬DNA來源的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別回收，送北京奧科生物技術(shù)有限公司完成測(cè)序；利用DNAStar軟件的S叫man程序進(jìn)行拼接^H序列比對(duì)，搜尋其中的SNP位點(diǎn)。CSRPJ基因的DNA克隆與SNP掃描結(jié)果三對(duì)跨內(nèi)含子引物擴(kuò)增獲得了三個(gè)DNA片段，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證其大小分別為1951bp，2519bp，l卯2bp。經(jīng)S叫man軟^f牛拼接上述測(cè)序序列，獲得了6293bp的DNA序列，覆蓋了豬CS/y^基因第三到第六外顯子的全部序列。通過比較分析，發(fā)現(xiàn)了位于1924bp處(第四外顯子)的一個(gè)C-T堿基突變。實(shí)施例2CS/P3基因C1924TZbg/PCR-RFLP基因型與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析1.r叫IPCR-RFLP檢測(cè)方法的建立(1)引物序列CRP3-E4國(guó)S:5'GGTACTGTTCGCCAAGGAGA3'CRP3-E4隱R:5'TCCAGGAAAGTGGGTGAAGA3'(2)PCR擴(kuò)增條《牛PCR反應(yīng)總體積20jil，其中包含約100ng豬基因組DNA，含1XPCRBuffer,1.5mmol/LMgCl2，150trniol每種dNTP，0.3nmol每條引物，1單位7^DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增程序是94匸5min,(94TC30s，6(TC30s,721C25s)循環(huán)35次，72X:延伸5min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。(3)r叫IRFLP基因分型PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體積是10jil，其中10x7bglBuffer1jJ,PCR產(chǎn)物3~5限制性內(nèi)切酶r叫I為3U，用滅菌水補(bǔ)充至IOjd,將樣品混勻后離心，65"C水浴4小時(shí)，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切結(jié)果，記錄基因型，在紫外燈下拍照。利用引物CRP3-E4-S與CRP3-E4-R配對(duì)擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物大小為344bp，序列如圖2所示。分析發(fā)現(xiàn)該片段包含的C1924T可以引起T叫l(wèi)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)(5-T~CGA-3)的丟失與保留，即當(dāng)該位點(diǎn)為C等位基因時(shí)，不能被K^I所酶切，而當(dāng)該位點(diǎn)為T等位基因時(shí)，能夠被TaqI酶所切開。因此，CC純合型個(gè)體不被嗨切，形成一條大小為344bp的片段，而TT純合型個(gè)體酶切產(chǎn)生的片段大小分別為206bp和138bp，CT雜合型則形成三種大小的條帶。因此，通過PCR擴(kuò)增首先獲得344bp的產(chǎn)物，經(jīng)過酶切可以區(qū)分三種不同的基因型個(gè)體，部分電泳檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。2.標(biāo)記性狀關(guān)聯(lián)分析在利用組建的通城豬(通城豬為湖北省通城縣地方豬種，為公開推廣應(yīng)用的一個(gè)地方豬品種)群進(jìn)行性狀關(guān)聯(lián)分析，制備了156個(gè)DNA樣品用于基因型檢測(cè)。所分析的性狀有部分生產(chǎn)性能，部分肉質(zhì)性狀。建立了如下最小二乘模型Yijk=ji+GENOTYPEj+BATCHj+COMBrNAnONk+eijk，其中，Yijk是性狀觀察值，fi為總體均數(shù)，GENOTYPEj為基因型效應(yīng)，BATCHj為性別效應(yīng)，COMBINATIONk為組合的效應(yīng)，6砂為隨機(jī)誤差。在一個(gè)通城豬實(shí)驗(yàn)群體中對(duì)CS^y基因第四外顯子T叫IPCR-RFLP多態(tài)性位點(diǎn)與部分生產(chǎn)肉質(zhì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，這些肉質(zhì)性狀包括肌肉pH值、大理石紋評(píng)分、滴水損失、剪切力、肌肉顏色等。在所檢測(cè)的156個(gè)個(gè)體中，CC型個(gè)體為76個(gè)，CT型個(gè)體為70個(gè)，而TT型個(gè)體僅為10個(gè)，其中CC型個(gè)體剪切力顯著低于CT型個(gè)體(P-0.0153),基因型間性狀觀察值的簡(jiǎn)單均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差分析結(jié)果總結(jié)于表3所示。表3.豬CSRP3基因SNPC1924T不同基因型與性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><221〉3'UTR<222>(689)..(939)<223><220><221〉5'UTR<222>(l)..(卿<223〉<220〉<221>CDS<222>(104)..(688)<223〉<400>1ggtgacagtccccatatatttaaggaggacgtgagccccctgactcagctgagccgacaa60agactgcacaggcagacttgaccttgatcagagagtcttc肪gatgccaaactgg115MetProAsnTrp1ggcggaggagcga幼tgcggagcctgcgacaagaccgtctaccacgca163GlyGlyGlyAlaLysCysGlyAlaCysAspLysThrValTyrHisAla5101520g肪g肪8tccagtgc肪tggaaggsgcttccacsagacctgtttccbc211GluGlulieGinCysAsnGlyArgSerPheHisLysThrCysPheHis253035tgcatggcctgcaggaaggetetagacageaccacggtagcagetcac259CysMetAlaCysArgLysAlaLeuAspSerThrThrValAlaAlaHis404550gagteagagatetsctgt卿gtctgctatgggcgcaggtacggcccc307GluSerGlulieTyrCysLysValCysTyrGlyArgArgTyrGlyPro556065幼gggg8tcggctatggscsaggtgccggctgcetcageacggacbcs355LysGlylieGlyTyrGlyGinGlyAlaGlyCysUuSerThrAspThr707580ggcgagcacctgggcetccagttccaacagtecccaaagccagcacgc403GlyGluHisLeuGlyLeuGinPheGinGinSerProLysProAlaArg859095100teagccaccaccage幼cccttecaagttcactgcaaagttcggagag451SerAlaThrThrSerAsnProSerLysPheThrAlaLysPheGlyGlu105110115tcggagaagtgcccccgatgtgga卿teagtctatgetgetgag卿499SerGluLysCysProArgCysGlyLysSerValTyrAlaAlaGluLys120125130gtgatgggaggtggcaagccttggcac卿acctgttttcgctgtgcc547ValMetGlyGlyGlyLysProTrpHisLysThrCysPheArgCysAla135140145atetgtggg肪gagtetagastecaca幼cgtcsetgscaaagacggei595lieCysGlyLysSerLeuGluSerThrAsnValThrAspLysAspGly150155160gaactttattgcaaagtttgctacgccaaaaattttggccctacaggt643GluLeuTyrCysLysValCysTyrAlaLysAsnPheGlyProThrGly165170175180attgggtttgggggccttacacacerggtggaaaagaaagagtga688lieGlyPheGlyGlyLeuThrHisXaaValGluLysLysGlu185190gaagtgcaccacctctcagatctctcattggccta卿cattagctgagtaatcctgcct748gaaggaaacccctccccacacaccctcttgatggaagtatttcgcttcagaagtgatccc808artctttacctgaagttagaag8g8tctttggaagaaaattattaaaagtcagtaac肪a868tgctctactBttgatgatacctgggctggg3g3agcc3肪aata83agctttagtggt肪928aaaaaaaaaaa939<210〉2<211>194<212>PRT<213>豬(Susscrofa)<220><221〉misc_feature〈222〉(189)..(189)<223>The，Xaa，atlocation189standsforArg，orGin.<400〉2MetProAsnTrpGlyGlyGlyAlaLysCysGlyAlaCysA印LysThr151015ValTyrHisAlaGluGlulieGinCysAsnGlyArgSerPheHisLys202530ThrCysPheHisCysMetAlaCysArgLysAlaLeuAspSerThrThr354045ValAlaAlaHisGluSerGlulieTyrCysLysValCysTyrGlyArg505560ArgTyrGlyProLysGlylieGlyTyrGlyGinGlyAlaGlyCysLeu65707580SerThrA印ThrGlyGluHisLeuGlyLeuGinPheGinGinSerPro859095LysProAlaArgSerAlaThrThrSerAsnProSerLysPheThrAla100105110LysPheGlyGluSerGluLysCysProArgCysGlyLysSerValTyr115120125AlaAlaGluLysValMetGlyGlyGlyLysProTrpHisLysThrCys130135140PheArgCysAlalieCysGlyLysSerLeuGluSerThrAsnValThr145150155160AspLysAspGlyGluLeuTyrCysLysValCysTyrAlaLysAsnPhe165170175GlyProThrGlylieGlyPheGlyGlyLeuThrHisXaaValGluLys180185l卯LysGlu<210>3<211>6231<212〉DNA<213>豬(Susscrofa)<220><221〉gene<222〉(1)..(6231)<223><220〉<221〉mutation<222〉(1924)■(1924)<223><220>〈221>exon<222>(5943).■(6231)<223>〈220〉<221>exon〈222〉(4317)..(4410)<223><220><221>exon<222>(1843).(1975)<223><220〉<221>exon<222>(1)..(134)〈223〉<400〉3gcagetcacgagteagagatetactgtaaggtctgctatgggcgcagg48AlaAlaHisGluSerGlulieTyrCysLysValCysTyrGlyArgArg151015tacggccccaaggggateggctatggacaaggtgccggctgcetcage96TyrGlyProLysGlylieGlyTyrGlyGinGlyAlaGlyCysLeuSer202530acggacacaggcgagcacctgggcetcc明ttccaacagtgagttact144ThrA印ThrGlyGluHisLeuGlyLeuGinPheGinGin3540gccctgcttctcccagctggtagagccccagctatcaggacagttcattctgttcccatg204geaaegtttectga犯gtaggagaatggeetctattgttgacttgccaacaatagg肪ta264ctcagtctgcccaagtcatctctctg犯gactctctttaaa/ttatctgeetttctaaagg324gcaattacttgctcttggtttgcatgtcaaagaatgtaca384gatgttctattgtttgacctttgeaaaactgcatggagtctctcttcttcccctttgagc444atttctgtgtaagtcacata肪t3CggC3gggacgcaatggccattctctatgtgcsttt504ccctgaaatatttcttcccttgggctggaaigatgactaatgtttgeateag鄉(xiāng)gggagt564gggtgggg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技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種作為豬標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與豬肌肉品質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記CSRP3及其應(yīng)用。所述的分子標(biāo)記由CSRP3基因克隆得到，它的cDNA序列如序列表SEQIDNO1所述。在序列表SEQIDNO2的第1924bp處有一個(gè)有一個(gè)C1924-T1924的堿基替換，該替換導(dǎo)致TaqIPCR-RFLP酶切多態(tài)性。本發(fā)明還公開了擴(kuò)增CSRP3基因完整cDNA序列和部分DNA序列所用的引物以及用于多態(tài)性檢測(cè)的方法，為豬的標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)新的分子標(biāo)記。文檔編號(hào)C12N15/11GK101319252SQ200810048449公開日2008年12月10日申請(qǐng)日期2008年7月21日優(yōu)先權(quán)日2008年7月21日發(fā)明者梅余,榜劉,徐學(xué)文,朱猛進(jìn),奎李,斌樊申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)