專利名稱：Vcx基因的應用的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種基因，尤其涉及一種vcx基因的應用。
背景技術(shù)：
肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，是我國位居第二的癌癥"殺手"，常見于中年 男性。因其惡性度高、病情進展快，病人早期一般沒有什么不適， 一旦出現(xiàn)癥狀就診，
往往己屬中晚期。故治療難度大、療效差， 一般發(fā)病后生存時間僅為6個月，人稱"癌 中之王"。因此，提高肝癌早期診斷水平、選擇科學合理的治療方法和采取有效的預 防復發(fā)轉(zhuǎn)移措施將是改變這種局面的三個關鍵環(huán)節(jié)。
目前診斷原發(fā)性肝癌最重要的腫瘤標志物是甲胎球蛋白(AFP)，但在我國原發(fā)性 肝癌患者中，血清AFP水平高于正常值者只占60X 70X;其中只有約32%的患者 血清AFP水平能達到診斷標準(>400yg/L)，其余均為低濃度陽性。此外，部分肝 炎、肝硬變等非肝癌患者的血清AFP水平也可異常升高。這些都影響了 AFP這一指標 的診斷特異性。因此，有待開發(fā)新的特異性腫瘤標記物，以提高原發(fā)性肝癌的診斷水 平。
此外，由于我國肝癌患者多合并嚴重的肝硬化，且易肝內(nèi)播散和遠處轉(zhuǎn)移，使手 術(shù)切除受到很大限制，而且放化療在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常細胞和免疫系統(tǒng)也 有破壞和抑制作用。因此，治療肝癌除了傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療方式外，還需要腫 瘤治療疫苗的輔助治療。
CT (Cancer-testis，腫瘤一睪丸)抗原，又稱腫瘤共享抗原， 一般在正常組織 中不表達，但在人生殖細胞系正常表達，在多種不同類型的腫瘤中也均有表達，包括 黑色素瘤，膀胱癌，肺癌，肝癌等，這些具有免疫原性的蛋白正在被積極發(fā)展為腫瘤 治療疫苗的靶點。目前為止已有多達80多個CT抗原家族被鑒定。CT抗原在腫瘤形成 中的作用也正在受到進一步評估，精子發(fā)生過程中的部分基因表達程序在腫瘤發(fā)生時 重新開放，可能有助于惡性腫瘤的表型特征一永生化，侵襲性，免疫逃逸，基因組低 甲基化和轉(zhuǎn)移能力。
CT抗原根據(jù)編碼它們基因的染色體定位可分為X染色體連鎖CT抗原(X-CT)和
3常染色體(non-X CT)即非X染色體連鎖抗原。在正常睪丸中X染色體連鎖的CT抗 原通常在精原細胞中表達，而精原細胞是在睪丸中保持不斷增殖的一類生殖干細胞。 由于生殖干細胞、發(fā)生于胚胎滋養(yǎng)層的細胞和腫瘤細胞有著許多共有的特征，在已知 癌基因和抑癌基因無突變的情況下，原本已沉默的生殖細胞系特異性表達基因在腫瘤 干細胞中被激活后可以調(diào)節(jié)腫瘤的惡性表型。值得強調(diào)的是，據(jù)估計X染色體上約有 1(m的基因?qū)儆赬染色體連鎖CT基因。因此，選取X染色體連鎖的CT基因為對象研 究其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制。
人VCX基因(Genbank No.國—013452.2)是CT抗原家族的成員之一。關于VCX 基因與肝癌發(fā)生的關系尚不清楚，有待進一步研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種VCX基因的應用，該VCX基因可作為肝 癌診斷的標記分子，提高了肝癌診斷的準確性。
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種VCX基因在制備治療肝癌的藥物中的應 用，使腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移得到有效控制。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)
在本發(fā)明的一個方面，提供了-種vcx基因在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應用。
所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或 基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品。
在本發(fā)明中，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增VCX基因的引物。
所述用實時定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對特異擴增VCX基因的引物。 所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包括與VCX蛋白特異性結(jié)合的抗體，包括多 克隆抗體和單克隆抗體。
所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包括與VCX基因的核酸序列雜交的探針。 所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包括與VCX基因的核酸序列雜交的探針。 在本發(fā)明中，可以使用一系列本領域己知的方法來制備針對VCX蛋白特異的抗 體。例如，將提純的人VCX基因產(chǎn)物或它的抗原片段注射入動物體內(nèi)以產(chǎn)生多克隆抗 體。同樣，表達人VCX蛋白或它的抗原片段的細胞也可以用來對動物致免疫而產(chǎn)生抗 體。根據(jù)本發(fā)明制備的抗體也可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤技術(shù)制備(例如，Kohleretal., Nature 256: 495, 1975; Kohler et al. ， Eur.丄I誦畫l. 6: 511， 1976; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292， 1976)。本發(fā)明的抗體 包括可以阻抑VCX功能的抗體，也可以是不影響人VCX功能的抗體。每一類抗體都可 以通過對人VCX基因產(chǎn)物的片段或功能域致免疫而產(chǎn)生，而人VCX基因產(chǎn)物及其片段 可以用重組方法產(chǎn)生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的VCX基因產(chǎn)物結(jié)合的 抗體，可以利用在原核細胞例如中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。與翻 譯后修飾形式如糖基化或磷酸化VCX蛋白或多肽結(jié)合的抗體，可以利用在真核細胞如 酵母或昆蟲細胞中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而得到。
在本發(fā)明中，所述探針可以是DNA、 RNA、 DNA-RNA嵌合體、PNA或其它衍生物。 所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合，任 何長度都可以。所述探針的長度可短至25、 20、 15、 13或10個堿基長度。同樣，所 述探針的長度可長至60、 80、 100、 150、 300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于 不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是 14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25 個堿基對最佳。所述探針自身互補序列最好少于4個堿基對，以免影響雜交效率。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種VCX基因在制備治療肝癌的藥物中的應用。
所述治療肝癌的藥物包括通過RNA干擾抑制VCX基因表達的雙鏈核糖核酸，或 基于VCX抗原蛋白的腫瘤疫苗，或用于抑制VCX蛋白活性的蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明中，所述RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指在進化過程中高度 保守的、由雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性 降解的現(xiàn)象。使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，該技術(shù)已被廣 泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。以細胞為基礎的RNAi 篩選在功能基因?qū)W研究方面具有許多優(yōu)勢，主要表現(xiàn)在大多數(shù)細胞類型都能使用RNAi 方法，并且相對較容易下調(diào)或沉默任何目的基因的表達。
在本發(fā)明中，所述腫瘤疫苗是指用腫瘤組織中的特殊物質(zhì)來激發(fā)患者體內(nèi)的免疫
功能，使患者的免疫功能能夠殺傷腫瘤細胞。腫瘤疫苗主要指治療性疫苗，是在病人 得病后再用疫苗的方法進行治療，以控制腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。腫瘤疫苗具有個體性， 因為每一個病人所得的腫瘤類型、分期都不一樣，腫瘤細胞所表達的物質(zhì)也不同，而 腫瘤疫苗又是由病人本身的腫瘤制成，因此針對患者具體的腫瘤制備的腫瘤疫苗具有個體化特征，其副作用小，針對性強。
所述腫瘤疫苗制備時，用手術(shù)方法切取腫瘤患者的腫瘤組織并無菌冷凍保存，以 提取腫瘤抗原。本發(fā)明的VCX抗原蛋白可作為腫瘤抗原被提取。獲得腫瘤抗原是第一 步，接著要獲得樹突狀細胞，即從病人血液的單個核細胞中獲得。采出單個核細胞后 再進行篩選和體外培養(yǎng)，然后用腫瘤抗原VCX在體外刺激樹突狀細胞，使該樹突狀細 胞能夠傳遞免疫信息，最后將訓練好的樹突狀細胞回輸?shù)襟w內(nèi)，使體內(nèi)產(chǎn)生針對腫瘤 抗原VCX的免疫應答。
本發(fā)明治療肝癌的藥物施用方式可以是口服、全身施用(例如，透過皮膚、鼻 吸入或者用栓劑)或腸胃外施用(例如，肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下)。
本發(fā)明的藥物也可被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的 水溶液通過常規(guī)方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物，可通過常規(guī)方法進行制 備。針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。
本發(fā)明實驗證明vcx基因在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，因此vcx基因 可作為診斷肝癌的特異標志基因，使肝癌診斷更加準確、快速。本發(fā)明vcx基因為防
治肝癌提供了新的治療靶點和有效新藥。


圖1是本發(fā)明實施例1通過RT-PCR驗證VCX基因在人肝癌組織和癌旁組織中的 差異表達圖2是本發(fā)明實施例6通過RT-PCR分析X染色體連鎖CT基因在肝癌細胞中的表 達圖3是本發(fā)明實施例7對VCX基因進行siRNA實驗的流程圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。
以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條 件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議 的條件。
實施例1
RT-PCR實驗檢測VCX基因在肝癌組織中的表達情況。1. 組織分離(Tissue isolation)
實驗用組織來源于72例HBV陽性并表達甲胎蛋白的原發(fā)性肝癌的手術(shù)病人(RT-PCR證實AFP在肝癌均為陽性而癌旁為陰性)。手術(shù)切除的肝臟一經(jīng)離體，迅速切取病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中(_80°C)保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷為最終依據(jù)。
2. 總RNA的抽提試劑盒
抽提RNA試劑采用TRIzol reagent (GIBC0/BRL)，該試劑是基于酸性酚一步抽提法生產(chǎn)的。用于抽提RNA所用的器皿和水均要進行無RNA酶處理，以保證實驗中無RNA酶的環(huán)境。
3. RNA的抽提步驟
將碾杵和勻漿器等器皿在200。C干烤4h,去除RNA酶，冷卻；加入液氮中預冷，將組織從液氮中迅速取出，碾成粉末；用刮匙將組織放入預先加入TRIzol試劑的勻槳器中，勻漿數(shù)分鐘；將勻漿后的液體轉(zhuǎn)入無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4°C離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加入氯仿后，4'C離心分層；將上層水相轉(zhuǎn)入一無RNA酶的離心管中，加異丙醇，4'C離心沉淀RNA;用75%乙醇洗滌沉淀2次；用無RNA酶的去離子水溶解沉淀。抽提的RNA質(zhì)量鑒定紫外分光光度計測定260/280比值(比值均在1. 7 2. 0);并在MOPS甲醛變性膠中觀察有無降解。
4. cDNA的合成
取總RNA2^g， 01 igodT 16 1叱，70°C保溫3min，立即冰上變性5mi n 。加入5 X buf f er，DTT和50mg/L的dNTP各2叱及l(fā)叱的逆轉(zhuǎn)錄酶，充分混勻后，42。C2h。模板使用終濃度通常為1 U g/100叱。
5. RT-PCR擴增
VCX (F):上游引物為5' — ACTGGGAGAAGGAAGTGAGATG -3， (SEQ ID NO:l);
VCX (R):下游引物為5' - TAGTCTTCTTCTTCGGGTCACTG -3' (SEQ ID N0:2);
e-actin(F): 5' - CATCCTGCGTCTGGACCT -3， (SEQ ID N0:3);actin(R): 5， - GTACTTGCGCTCAGGAGGAG -3，(SEQ ID N0:4)。
以e-actin作內(nèi)對照，反應混合物中各成分為e-actin(F)、 P -actin (R) 、 VCX(F)、 VCX (R)、 10XBuffer、 MgQ2、 dNTP、 Taq DNA聚合酶、cDNA模板分別為0. 2、0.2、 0.4、 0.4、 1.0、 1.0、 0.2、 0. 1和5叱，最后補充ddH20使反應體系為IO叱。
7PCR的反應條件如下94。C,5分鐘預變性；94°C， 30秒變性；55°C， 30秒退火；72°C， 30秒延伸；35個循環(huán)，電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物。
6. 實驗結(jié)果顯示，VCX基因在肝癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織中VCX 基因的表達水平(見圖l)，差異率達83.3%， VCX特異擴增片斷大小為317bp，內(nèi)參 e-actin的產(chǎn)物片斷大小為490 bp，在圖1中，"N"指癌旁組織，"C"指肝癌組織。
7. 根據(jù)上述實驗結(jié)果，可通過RT-PCR診斷肝癌設計VCX基因的PCR引物，檢 測腫瘤組織中VCX基因RNA的含量，RNA含量高則說明患肝癌的可能性高，反之則低。
實施例2 實時定量PCR實驗
采用相對定量法檢測VCX基因在肝癌樣本中的表達差異(Thermal Cycler DiceTM Real Time System TP800, Takara; SYBR Premix Ex TaqTM , Takara)。實時定量 PCR檢測表明，VCX基因在肝癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織中的表達水平， 經(jīng)t檢驗，P〈0.01。該實驗結(jié)果表明，可通過實時定量PCR診斷肝癌設計VCX基因 的PCR引物，檢測腫瘤組織中VCX基因RNA的含量，RNA含量高則說明患肝癌的可能 性高，反之則低。
實施例3原位雜交
用VCX基因探針，與腫瘤切片進行原位雜交，陽性雜交信號越強，患肝癌的可能 性越高。實驗步驟為將肝臟腫瘤組織取材后OCT包埋、液氮速凍，恒冷箱冰凍切片， 該冰凍切片進一步用于原位雜交。
實施例4免疫檢測
1. 抗原蛋白獲得
(1) 利用基因工程表達可從Genbank數(shù)據(jù)庫中獲得人VCX基因的cDNA序列， 通過PCR擴增獲得編碼框，插入原核生物或真核生物表達載體中，表達VCX蛋白，并 按基因工程表達產(chǎn)物的純化體系純化蛋白質(zhì)。
(2) 通過培養(yǎng)高表達VCX基因的人體來源細胞或組織，再分離純化VCX蛋白。
2. 抗體制備
可采用以下幾種方法制備抗體
(1) 細胞融合法用上述制備的VCX蛋白免疫動物(包括兔子、山羊等)，獲得 脾臟細胞，再與骨髓瘤細胞融合，并按常規(guī)單克隆抗體制備技術(shù)制備單克隆抗體。
(2) 利用噬菌體表面展示庫，克隆免疫動物的脾臟IgG可變區(qū)并表達成基因工程
8單克隆抗體。
(3)利用純化的蛋白質(zhì)免疫動物，制備多抗血清。 3.檢測
(1) 用制備的抗體(多抗或單抗)，用組織化學方法進行肝癌的病理檢測，陽性 信號為肝癌。
(2) 取患者血清，用ELISA方法檢測，陽性反應為肝癌可疑病人。
(3) 將VCX抗體作為蛋白質(zhì)芯片的探針之一，用于多種腫瘤診斷。 實施例5
用去甲基化藥物DAC (終濃度為2000nM)，處理15株肝癌細胞株后，使用基因芯片檢 測處理前后基因表達水平的差異，發(fā)現(xiàn)在8株細胞株中，VCX基因表達差異明顯。其中， 基因芯片實驗主要包括如下四個步驟芯片制備、樣品制備、雜交反應和信號檢測以及 結(jié)果分析。
1. 芯片制備目前制備芯片主要以玻璃片或硅片為載體。通過點樣法將靶基因 作為探針按順序排列在載體上，靶基因可分為基因組DNA、 cDNA (或人工合成DNA)。
2. 樣品制備待測樣品中總RNA的抽提步驟如下分別取用去甲基化藥物DAC 處理的15株肝癌細胞株和15株未經(jīng)去甲基化處理的肝癌細胞株，再用TRIZol法抽 提總RNA。
提取的總RNA可進一步用于樣品cDNA探針制備，其過程包括熒光探針的制備1 (cDNA第一鏈標記)、純化和定量。定量后的探針吸回至1.5 ml離心管中，加熱抽 干，保存于-2(TC，待雜交。
3. 芯片雜交
取出經(jīng)定量的Cy3和Cy5標記的探針，各用9 15u 1 ddH20充分溶解混合于 1.5ml離心管內(nèi)，然后配制雜交液，Cy3/Cy5熒光標記探針的雜交液由20X SSPE緩 沖液、50X Denhandts緩沖液和溶解有探針的ddH20組成，接著，取雜交液滴加在 芯片上，并蓋上蓋玻片。最后，將該雜交芯片放入加有PBS的雜交盒，置于42'C雜 交箱中雜交12 20小時。
4. 洗滌、掃描和數(shù)據(jù)分析芯片雜交反應結(jié)束后，需進行芯片洗滌。再通過特 定的掃描儀比如激光共聚焦掃描儀進行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強度的數(shù) 字信號，隨后進行數(shù)據(jù)分析和處理。由于樣本差異、熒光標記效率和檢出率的不平衡，需對原始提取信號進行均衡和修正才能進一步分析實驗數(shù)據(jù)。經(jīng)分析，由基因芯片檢 測肝癌及癌旁組織中VCX基因的表達差異，結(jié)果顯示VCX基因在肝癌組織中表達顯著 上調(diào)。
實施例6 肝癌細胞株模型的選擇
利用RT-PCR分析了約40個X染色體連鎖CT基因在17株肝癌細胞中的表達情況 (見圖2)，發(fā)現(xiàn)它們在其中兩細胞株(PLC, Focus)中均有表達，因此選擇這兩株細胞 系作為篩選模型。
肝癌細胞株Focus、 PLC由本實驗室保種，復蘇后在含10%胎牛血清、200單位/ 毫升青霉素、200皮克/毫升鏈霉素的DMEM(GIBCO)培液中，5%C02、 37。C條件下培養(yǎng)， 以用于siRNA轉(zhuǎn)染。
實施例7基于肝癌細胞株PLC、Focus對X染色體連鎖CT基因進行siRNA篩選
1.特異性針對候選基因si脂A的產(chǎn)生 為確保候選基因能夠在篩選體系中被高效剔除或沉默，針對每個候選基因的mRNA 序列(Refseq， NCBI GenBank)設計2 3 siRNA特異性片斷。針對X染色體連鎖的 CT基因共設計了 177條siRNAs。 siRNA的設計根據(jù)己發(fā)表的通用設計原則(Elbashir et. al 2001' Schwarz et. al 2003， Khvorova et. al 2003， Reynolds et. al 2004， Hsieh et.al 2004， Ui-Tei et. al 2004)，通過在線工具完成設計，該在線工具為siRNA Selection Program of Whitehead Institute(BingbingYuan et.al 2004， http:〃j腦.wi.mit. edu/bioc/siRNAext/)禾口 BLOCK-iT RNAi Designer of INVITR0GEN(winner of the 2004 Frost & Sullivan Excellence in Research Award, https://rnaidesigner.invitrogen.com/sirna/)。 為了進一步提高siRNA片斷的有 效性，綜合兩個在線設計工具的優(yōu)點來設計用于篩選的siRNA片斷。最后，通過同源 性比對(NCBI BLAST)來過濾siRNA序列，以提高siRNA片斷的特異性并減少RNAi 干擾的脫靶效應。SiRNA寡核苷酸由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司化學合成，由DEPC 處理過的RNase-free的雙蒸水溶解，溶度為20 y M。兩條siRNA片斷作為陰性對照， 序列如下
S:5'CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT3' (SEQ ID NO:5)， -AS:5'UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT3， (SEQ ID NO:6); S:5'UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT 3' (SEQ ID NO:7)，AS:5' ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT 3' (SEQ ID NO:8)。
2. siRNA轉(zhuǎn)染和細胞增殖分析
如圖3所示，在96孔板中接種合適密度的肝癌細胞。轉(zhuǎn)染前換成無血清的DMEM 培液，并且細胞密度不高于40%。轉(zhuǎn)染試劑選用Lipofectamine 2000 (Invotrogen)， 用0pti-MEM I低血清培養(yǎng)基(Invotrogen)配置siRNA oligomer-Lipofectamine 2000復合物(轉(zhuǎn)染條件已優(yōu)化)，室溫放置30分鐘后加入細胞中，混勻，37。C培養(yǎng)4 6小時后換成含10%胎牛血清的DMEM培液。每條siRNA片斷轉(zhuǎn)染三復孔細胞，轉(zhuǎn)染實 驗獨立重復兩次。
轉(zhuǎn)染后細胞經(jīng)過3天培養(yǎng)，采用CCK-8 (cell counting kit_8，細胞計數(shù)試劑 盒，Dojindo)法分析細胞增殖狀態(tài)。加10 Hi CCK-8溶液/孔于96孔板后，37 °C， 5% C02培養(yǎng)2小時，通過溶液比色度分析來反映每孔活性細胞數(shù)；酶標儀 (Bio-Tek，MQX200)在波長段450nm測定溶液的比色度，重復兩次讀數(shù)。
3. 數(shù)據(jù)分析
鑒于細胞RNAi干擾實驗的變異和大規(guī)模實驗時的操作誤差，采用必要的統(tǒng)計學 方法分析數(shù)據(jù)可提高篩選體系的可信度，降低篩選體系得出的假陽性率，因此在數(shù)據(jù) 分析時引入Z值(篩選系數(shù))和P值(T檢驗可信度)。Z值是一個簡明的無自由度限 制的統(tǒng)計學參數(shù)，用于評估和調(diào)整任何篩選體系。Z=1-(3SS+3 5C)/| ii s-y c I (Journal of Biomolecular Screening, 1999) ， S s:實驗組siRNA標準差；S c: 對照組siRNA標準差；p s:實驗組siRNA均數(shù)；u c:對照組siRNA均數(shù)；實驗組siRNA 和對照siRNA標準化數(shù)據(jù)進行單側(cè)t檢驗，求出P值。
將數(shù)據(jù)處理后，按上述方式算出統(tǒng)計學參數(shù)Z值和P值，認為P<0. 05, Z>1的siRNA 導致的表型有意義，并由此劃定陽性siRNA片斷。
針對VCX基因(GenbankNo.剛—013452. 2)設計兩條siRNA，其中之一是針對耙 序列GGTGGAAGAACCACTGAGT(576-594)設計的siRNA，名稱為SI—147，其序列如下 S: 5' GGUGGAAGAACCACUGAG麗dT3， (SEQ ID NO: 9) ， AS: 5' ACUCAGUGGUUCUUCCACC dTdT 3， (SEQ ID NO: 10); VCX基因的另一 siRNA片斷是針對耙序列GGAGAGCGAGATGGAAGAA (747-765)設計的siRNA，名稱為SI—148，其序列如下S:5' GGAGAGCGAGAUGGAAGAAdTdT 3， (SEQ ID NO:11)， AS:5'UUCUUCCAUCUCGCUCUCCdTdT 3， (SEQ ID NO:12)。
4. 驗證VCX基因的陽性siRNA片斷對肝癌細胞生長效應的影響將VCX基因的陽性siRNA片斷單獨進行轉(zhuǎn)染實驗后，用CCK-8法計量活細胞生長 數(shù)，以天為間隔，連續(xù)測量五天，做出細胞的生長曲線。
結(jié)果顯示，針對VCX基因的siRNA，能使Focus、 PLC肝癌細胞的存活率明顯低 于對照組的細胞，說明人VCX基因的表達下調(diào)能在一定程度上抑制肝癌細胞生長。
實施例8VCX抗原蛋白作為腫瘤疫苗的應用
1.原發(fā)性肝癌組織標本在術(shù)中取材，術(shù)后均經(jīng)病理診斷確證。采用美國 PEL-FREEZA-SSP UNITRAY試劑盒對肝癌組織DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂 糖凝膠中電泳，根據(jù)電泳結(jié)果對細胞株HLA-A位點分型。
2. 總RNA的提取和cDNA的合成利用Trizol試劑(Gibco BRL公司)提取肝癌組 織總RNA，溶于適量焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的超純水中并定量。取5 y g RNA標本， 用逆轉(zhuǎn)錄酶Superscript II合成cDNA。
3. 抗原基因cDNA的PCR擴增總反應體積為50yl。其中含2ulcDNA、 25pmol CT抗原基因VCX的引物。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
4. PCR產(chǎn)物的純化、克隆和測序參照《分子克隆》(第3版)的方法。
5. DC(樹突狀細胞)的體外分離和培養(yǎng)患者外周靜脈血經(jīng)淋巴細胞分層液Ficoll 梯度離心后分離界面單個核細胞。細胞經(jīng)洗滌2次后，用無血清培養(yǎng)基AIM—V培養(yǎng) 液(Gibco BRL公司)懸浮，調(diào)整細胞濃度到3X106個/ml，接種入6孔培養(yǎng)板。在 37°C、 5%C02孵箱中培養(yǎng)過夜后，輕輕吹打懸浮細胞并回收凍存，用以制備效應細 胞。在貼壁細胞培養(yǎng)液中加入含lOOOU/ml粒單集落刺激因子和500U/ml白細胞介素 的AIM-V。培養(yǎng)至第7天時，收獲懸浮的DC。
6. 多肽合成VCX抗原多肽由多肽合成儀合成。T2細胞或HLA-A2的EBV (Epstein Barr Virus,非洲淋巴細胞瘤病毒)轉(zhuǎn)染的人B淋巴細胞與終濃度為20ug/ml的VCX 抗原多肽共孵育4小時，洗滌后作為靶細胞。
7. 通過以下方式鑒定本發(fā)明治療肝癌的腫瘤CT抗原疫苗，通過DC遞呈VCX抗原 肽活化效應T細胞，產(chǎn)生特異性針對VCX抗原表位的免疫應答
(1) DC膜標志的鑒定:用熒光標記抗體，HLA-DR(購自Pharmingen公司)檢測， 通過流式細胞儀檢測細胞表型。
(2) DC細胞的處理DC經(jīng)離心后重懸浮在2mlAIM-V中，并加入VCX抗原肽至 該多肽終濃度為40ug/ml。 37°C、 5%〔02培養(yǎng)18小時，經(jīng)3000rad放射線照射后，洗滌待用。
(3) 效應細胞的制備非貼壁細胞復蘇后，與照射后的DC細胞以20: 1混合共 孵育6-7天，再按照相同比例加入DC， 6-7天后，再次重復刺激一次，作為效應T細 胞。于0、 7、 10、 14、 19天，分別留取培養(yǎng)上清，用于細胞因子檢測。
(4) 細胞因子檢測采用細胞因子檢測試劑盒(購自美國Endogen公司)檢測 培養(yǎng)上清中分泌的細胞因子。
8.實驗結(jié)果表明，經(jīng)本發(fā)明VCX抗原肽刺激的DC所活化的效應T細胞，能產(chǎn)生 特異性針對VCX抗原表位的免疫應答，從而特異性殺傷結(jié)合有該相同VCX抗原肽的耙 細胞，說明本發(fā)明VCX抗原蛋白可以作為潛在的肝癌治療性疫苗。 實施例9 以VCX基因表達產(chǎn)物為靶分子設計的基因治療 以VCX基因表達產(chǎn)物為靶分子，設計一種攜帶某基因的表達載體，導入該載體， 其產(chǎn)物對VCX基因的表達有抑制作用，或?qū)CX蛋白活性有抑制作用。
13<110〉上海人類基因組研究中心
〈120〉 VCX基因的應用
〈130〉 NP-08-12196
〈160〉 12
<170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211〉 22
<212> 腿
〈213> 人工序列
〈220>
<221> misc一feature
〈222〉 (1)..(22)
〈223〉 引物
〈400〉 1
actggg卿a ggaagtg卿tg 22
<210> 2
〈211〉 23
〈212〉 DNA 〈213〉人工序列
〈220〉
<221〉 misc—feature
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<223> 引物
〈400〉 2
tagtcttctt cttcgggtca ctg 23
〈210〉 3
〈211〉 18
〈212〉 廳 〈213>人工序列
〈220〉
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〈222> (1)..(18)
<223〉 引物〈400〉 3
catcctgcgt ctggacct 18
<210> 4
<211> 20
〈212〉 腿 〈213〉人工序列
<220〉
〈221〉 misc一feature
〈222〉 (1)..(20)
〈223〉 引物
<400> 4
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〈210〉 〈211〉 〈212〉 <213>
〈220〉 <221> 〈222〉 〈223〉
5
21 RNA
人工序列
misc一RNA (l).. (21) si醒
〈400〉 5
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〈210〉 〈211〉 〈212〉 〈213〉
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6
21
腿
人工序列
misc—RNA (l).. (21) si腿
〈400〉 6
ucgaaguauu ccgcguacgt t 21
<210> 7 〈211〉 21
15〈212〉 廳
〈213〉 人工序列
〈220〉
〈221〉 misc一RNA
〈222〉 (1)..(21)
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〈400〉 7
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〈210〉 8
〈211〉 21
〈212〉 RNA <213>人工序列
〈220>
<221> misc_RNA
〈222〉 (1)..(21)
<223〉 siRNA
<400> 8
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〈210〉 9
<211> 21
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〈220〉
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<222> (1)..(21)
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〈210〉 10
<211> 21
<212> RNA 〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc腿〈222〉 (1)..(21)
〈223〉 siRNA
<400〉 10
acucaguggu ucuuccacct t 21
〈210〉 11
<211〉 21
〈212〉 RNA 〈213〉人工序列
<220〉
<221〉 misc—RNA
〈222〉 (1)..(21)
〈223〉 siRNA
<400〉 11
gg卿gcgag augga卿at t 21
〈210〉 12
〈211〉 21
〈212〉 脂A 〈213〉人工序列
〈220〉
〈221〉 misc—RNA
<222> (1)..(21)
<223> siRNA
〈400〉 12
uucuuccauc ucgcucucct t 21
1權(quán)利要求
1.一種VCX基因的應用，其特征在于，所述VCX基因在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、 實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品。
3. 如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少 包括一對特異擴增VCX基因的引物。
4. 如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述用實時定量PCR診斷肝癌的產(chǎn) 品至少包括一對特異擴增VCX基因的引物。
5. 如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述用免疫檢測診斷肝癌的產(chǎn)品包 括與VCX蛋白特異性結(jié)合的抗體。
6. 如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述用原位雜交診斷肝癌的產(chǎn)品包 括與VCX基因的核酸序列雜交的探針。
7. 如權(quán)利要求2所述的應用，其特征在于，所述用基因芯片診斷肝癌的產(chǎn)品包 括與VCX基因的核酸序列雜交的探針。
8. —種VCX基因的應用，其特征在于，所述VCX基因在制備治療肝癌的藥物中 的應用。
9. 如權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述治療肝癌的藥物包括通過RNA 干擾抑制VCX基因表達的雙鏈核糖核酸，或基于VCX抗原蛋白的腫瘤疫苗，或用于抑 制VCX蛋白活性的蛋白質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種VCX基因的應用，用于制備診斷肝癌的產(chǎn)品和制備治療肝癌的藥物。本發(fā)明的VCX基因，可作為診斷肝癌的特異標志基因，使肝癌診斷更加準確、快速，且為防治肝癌提供了新的治療靶點和有效新藥。
文檔編號C12Q1/68GK101492720SQ200810043059
公開日2009年7月29日 申請日期2008年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年1月22日
發(fā)明者慶 鄧, 韓澤廣, 健 黃 申請人:上海人類基因組研究中心