專利名稱：：維生素B₁₂發(fā)酵過程優(yōu)化與放大的方法與裝置的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種發(fā)酵過程優(yōu)化與放大的方法及其裝置，尤其是涉及一種維生素812發(fā)酵過程優(yōu)化與放大的方法與裝置。
背景技術：
：為了使小型發(fā)酵試驗所獲得的規(guī)律和數(shù)據(jù)能在大生產(chǎn)中再現(xiàn)，就要掌握和運用放大技術。現(xiàn)有技術中一般采用相似原理進行比擬放大。具體地，現(xiàn)有技術中比擬放大的基本方法是首先必須找出表征此系統(tǒng)的各種參數(shù)，將它們組成幾個具有一定物理含義的無因次數(shù)，并建立它們之間的函數(shù)式，然后用實驗的方法在試驗設備里求得此函數(shù)式中所包含的常數(shù)和指數(shù)，則此關系式便可用作與此試驗設備幾何相似的大型設備的設計。所有放大原則的目的都在于從大量的試驗材料中把握和找出影響生產(chǎn)過程的主要矛盾，從而使得大型設備的規(guī)律和數(shù)據(jù)在小型發(fā)酵試驗所獲得的規(guī)律和數(shù)據(jù)能在大生產(chǎn)中再現(xiàn)。目前通用的放大準則包括(1)幾何相似其函數(shù)式如下式(I)哦=Di2/Dn=(VV》1/3式(I)D-------------反應器直徑Di-------------攪拌器直徑V--------------反應器的裝料容積(2)恒定等體積功率放大由Pg/V恒定而確定攪拌轉速。(3)恒定傳氧系數(shù)kLa放大(4)恒定剪切力恒定葉端速度放大剪切力與攪拌槳葉端速度成正比，在恒定體積功率放大時一般維持n3d2不變(n為攪拌槳轉速、d為攪拌槳直徑)(5)恒定的混合時間tM放大等。在應用上述放大原則(或準則)的放大過程中，本領域技術人員可以通過有限的試驗建立類似式(I)的函數(shù)式，這些函數(shù)式屬于現(xiàn)有技術，在此不作詳述。但是上述現(xiàn)有的放大準則的不足之處在于，其都是基于細胞外的參數(shù)檢測為基礎的最佳工藝控制點為依據(jù)的靜態(tài)操作方法，沒有著眼于基于細胞代謝物質流分布變化的有關現(xiàn)象特征參數(shù)。在放大時不可能同時做到幾何相似、流體運動學相似和流體動力學相似，當在小試研究時某一個對生產(chǎn)產(chǎn)生影響的重要因素沒有被觀察到，而這個因素恰恰在放大時成為關鍵因子時，會導致量變引起質變，從而造成整個發(fā)酵過程的失敗。因此，本領域缺乏基于生理代謝特征參數(shù)的放大原則及其方法。目前，采用現(xiàn)有的放大原則對維生素B12發(fā)酵過程優(yōu)化與放大，特別是放大到工業(yè)規(guī)模水平時遇到了問題，體現(xiàn)在維生素B12的發(fā)酵單位都不高于125iig/ml，低于小型發(fā)酵試驗的發(fā)酵單位。現(xiàn)有技術中，維生素B^通常是指含鈷離子的鈷胺素類化合物。它是一種重要的生物活性物質，是哺乳動物的造血因子，可以用來治療惡性貧血癥，同時它也是許多微生物和4動物的生長因子。維生素B12的生物合成嚴格限于微生物中，自然界中VB12的合成途徑存在兩種不同的路線(1)需氧合成途徑，比如脫氮假單孢桿菌(P.denitrificans)等微生物中；(2)厭氧合成途孑5，比如Bacillusmegaterium、P.shermanii、Salmonellatyphimurium等微生物中。長期來，VB12的合成研究與與生產(chǎn)大多停留在厭氧發(fā)酵途徑；經(jīng)過至少25年的努力，借助于遺傳學和分子生物學手段以及與酶學、化學合成、同位素標記、核磁共振波譜學等相結合，P.denitrificans中VB12的需氧合成途徑才在1993年被完整地闡述。如式II所示的反應式顯示了各種微生物維生素B12生物合成途徑的示意圖，以及需氧合成途徑與厭氧合成之間的差異。式II在大部分細菌中，四吡咯的生物合成都是從谷氨酸的C-5骨架開始的，經(jīng)過多步反應，形成5-Aminolaevulicacid(5-氨基乙酉先丙酸)、uroporphyrinogenIII(尿口卜啉原III)，而尿嚇啉原III通過甲基轉移酶在C-2和C-7上進行甲基化，從而合成前咕啉-2(precorrin-2)。如式II顯示，在形成前咕啉_2后，鈷胺素的生物合成開始形成兩個分支途徑在需氧合成途徑中，前咕啉_2在C-20上甲基化，從而形成前咕啉_3A;然而，在厭氧合成途徑中，前咕啉_2被鈷離子螯合，生成鈷一前咕啉_2(cobalt-precorrin-2)。因5而，VB^的需氧和厭氧合成途徑的區(qū)別之一在于鈷離子的螯合時機不同，厭氧合成途徑中鈷離子的螯合起始于前咕啉_2，然而在需氧合成途徑中鈷離子的螯合發(fā)生在前咕啉_2接下來的九個反應階段之后。另外，在VB12好氧合成途徑中，前咕啉_3A的C-20原子被分子氧所氧化，結果以乙酸鹽的形式釋放出C-20，而在VB12厭氧合成途徑中厭氧條件下，可能是通過絡合的鈷離子呈現(xiàn)不同的價位(從+l到+3)以達到氧化作用，結果以乙醛的形式釋放出C-20。雖然VB^的需氧和厭氧合成路線是在前咕啉-2時分開的，但是它們再次在腺苷鈷啉胺酸(adenosyl-cobyricacid)處合成路線又變得相同。在過去的數(shù)十年間，用于生產(chǎn)VB12的微生物主要有Propionibacteriumshermanii、P.freudenreichii、P.denitrificans等厭氧合成代謝途徑，而P.denitrificans是近年興起的用于好氧合成VB^的工業(yè)菌種，由于其生產(chǎn)效率遠大于厭氧合成代謝途徑，所以對其應用研究也是目前人們所關注的熱點。由于VB^的好氧合成途徑和厭氧合成途徑有很多步驟是相同的，加之P.denitrificans是一種兼性厭氧菌，因此，在生產(chǎn)上對P.denitrificans產(chǎn)VB12發(fā)酵過程的溶氧控制可能會產(chǎn)生一定的疑問和誤區(qū)。綜上所述，本領域缺乏具有維生素B12發(fā)酵過程優(yōu)化與放大的方法，及其維生素B12發(fā)酵用的工業(yè)規(guī)模的生物反應器。因此，本領域迫切需要開發(fā)維生素B12發(fā)酵過程優(yōu)化與放大的方法，及其維生素B12發(fā)酵用的工業(yè)規(guī)模的生物反應器。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的第一目的在于獲得一種可用于維生素B12發(fā)酵過程優(yōu)化與放大的方法。本發(fā)明的第二目的在于獲得一種可用于維生素B12發(fā)酵用的工業(yè)規(guī)模的生物反應器。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種對使用生物反應器裝置的發(fā)酵過程進行優(yōu)化放大的方法，所述方法包括步驟(a)測定所述生物反應器裝置的所述發(fā)酵過程中的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合；其中所述生理代謝參數(shù)選自供氧量、溶氧、攝氧率、pH、二氧化碳釋放率、呼吸商、活細胞量或細胞形態(tài)、測定的代謝產(chǎn)物或基質消耗、或其組合；(b)將步驟(a)測定的所述生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性與預定值的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合進行比較；選出與所述預定值最為接近的生物反應器裝置；確定優(yōu)化的放大生物反應器裝置；其中所述生理代謝參數(shù)如步驟(a)所述。在一優(yōu)選例中，所述測定的代謝產(chǎn)物或基質消耗為實驗室手工測定的代謝產(chǎn)物或基質消耗。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述生物反應器裝置選自維生素B12發(fā)酵裝置。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述的生物反應器裝置是容量為20L—2000m3的發(fā)酵罐。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述步驟(a)中，該方法通過檢測生物反應器的多個工藝控制參數(shù)以獲得所述發(fā)酵過程中的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合，其中所述多個工藝控制參數(shù)為攪拌轉速，通氣流量，罐壓，消泡，pH，溶解氧濃度，發(fā)酵液真實體積及重量，補料量包括基質、前體、油、酸堿物，尾氣C02和02。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述步驟(b)中，測定的所述生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性與預定值的差異不高于1015%之間。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述步驟(b)中所述的預定值是小罐發(fā)酵條件下的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合；其中，所述生物反應器裝置相對于小罐體積的放大倍數(shù)不低于202000倍之間。在一優(yōu)選例中，所述小罐如5、10、20、30、50、100升或是1—IOM3。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，在步驟(b)的比較過程中，還包括如下步驟(i)將步驟(a)測定的所述生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性與預定值的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合進行比較；(ii)調節(jié)所述生物反應器裝置的生理代謝特征參數(shù)特征、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合，使得所述生物反應器裝置的生理代謝特征參數(shù)特征相對于所述預定值的差異不高于1015%之間，選定與所述預定值最為接近的生物反應器裝置；(iii)確定優(yōu)化的放大生物反應器裝置。在本發(fā)明的第二方面提供一種可進行過程優(yōu)化和數(shù)據(jù)放大的自控生物反應器裝置，所述自控生物反應器裝置包括帶有攪拌器的生物反應器罐體，以及對所述生物反應器的工藝控制參數(shù)進行檢測及控制的儀器儀表，所述罐體上設置-傳感裝置單元，所述傳感裝置單元包括設置在所述罐體上的溶解氧傳感器、活細胞量傳感器；_與所述傳感裝置單元連接的生理代謝特征參數(shù)計算裝置，所述生理代謝特征參數(shù)計算裝置將所述傳感裝置單元獲得的工藝控制參數(shù)轉化為作為數(shù)據(jù)放大基礎的生理代謝特征參數(shù)。在一優(yōu)選例中，所述工藝控制參數(shù)是指溫度，攪拌轉速，通氣流量，罐壓，消泡，pH，溶解氧濃度，發(fā)酵液真實體積及重量，補料量包括基質、前體、油、酸堿物，尾氣C02和02。具體地，所述攪拌器采用轉速為01000rpm之間的高速攪拌器。具體地，所述生物反應器上設有氧氣流量在0100升/分之間的供氧設備。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述罐體的體積容量在20L—2000n^之間。優(yōu)選120m32000m3，更優(yōu)選150m32000m3。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述的傳感單元還包括溫度傳感器，pH傳感器，全罐秤量傳感器，尾氣C02接口，尾氣02接口，測速傳感器，壓力傳感器，消泡傳感器或其組圖l為實施例1中在91113中試發(fā)酵罐上獲得的代謝曲線(TheprocessparamtetersofVB12fermentationin9m3fermentor)圖2為實施例1中低供氧水平下的參數(shù)變化趨勢圖(TheprocessparamtetersofVB12fermentationinlowdissolvedoxygenconcentration)圖3為實施例1中高供氧水平下的參數(shù)變化趨勢圖(TheprocessparamtetersofVB12fermentationinhighdissolvedoxygenconcentration)圖4為實施例1中兩種不同溶氧控制罐批下總糖、氨基氮、菌體干重和VB12的動態(tài)變化過禾呈(Timeprofilesoftotalsugar，NH2_N，cellgrowthandVB12productionintwoDOCcontrollevels)圖5為實施例1中兩種不同供氧能力情況下發(fā)酵過程比生長速率和比產(chǎn)物形成速率的變化情況(Timeprofilesofspecificgrowthrate(u)andspecificproductionrate(qp)ofVB12fermentationintwoDOCcontrollevels)圖6為實施例2的自控生物反應器裝置的示意圖。具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過改進制備工藝，獲得了在以代謝流分析與控制為核心的發(fā)酵過程參數(shù)調整的研究方法基礎上，獲得了一種能夠將實驗室規(guī)模的優(yōu)化條件放大到工業(yè)規(guī)模的方法。在此基礎上完成了本發(fā)明。本發(fā)明是基于如下原理而提出的以工業(yè)生產(chǎn)為目的的生物系統(tǒng)的功能取決于外界環(huán)境剌激與胞內(nèi)功能基因的共同作用。這種外界環(huán)境對細胞功能的影響主要通過以下幾種途徑，其一，外界條件(如溫度、pH)對菌體細胞內(nèi)酶的作用或代謝速率直接產(chǎn)生影響；其二，由于反應器混合傳遞所引起的基質(如氧、各種碳源)供應不足或過量，由此產(chǎn)生的胞內(nèi)代謝的變化；其三，細胞的信號傳導系統(tǒng)對外界環(huán)境條件的響應，引起細胞轉錄表達系統(tǒng)的變化，由此進而引起細胞代謝網(wǎng)絡的變化。這就要求我們要在綜合考慮胞外環(huán)境及菌體生理特性的基礎上進行工業(yè)生物過程的優(yōu)化與放大，而實際工業(yè)生產(chǎn)中多為液態(tài)培養(yǎng)，因而菌體的外部環(huán)境的研究即歸結為生物反應器內(nèi)流體力學研究，由此得到不同條件下的溫度場、濃度場、剪切力場等；細胞的行為則通過菌體生理特性來表達。通過將兩者整合起來研究其相互作用規(guī)律從而為生物反應器的優(yōu)化與放大開辟一條嶄新的科學思路。根據(jù)上述原理，本發(fā)明設計了以下進行流程放大和優(yōu)化的具體路線在發(fā)酵過程放大研究時，提出了首先在以代謝流分析與控制為核心的發(fā)酵實驗裝置上進行研究，由此可得到用于過程研究的狀態(tài)參數(shù)或生理參數(shù)以及他們之間的相關特性，由此可實現(xiàn)生物反應器中基因、細胞、反應器不同尺度的跨尺度研究，即通過多尺度參數(shù)相關分析實現(xiàn)發(fā)酵過程優(yōu)化。在放大時，只要我們在放大的設備上得到完全(或基本)相同的反映代謝流等生理數(shù)據(jù)變化曲線，就可以較好地克服上述放大過程中的問題，因而提出了發(fā)酵過程參數(shù)調整的放大技術。以下對本發(fā)明的各個方面進行詳述(—)進行過程優(yōu)化和數(shù)據(jù)放大的方法本發(fā)明涉及一種對使用生物反應器裝置的發(fā)酵過程進行優(yōu)化放大的方法，所述方法包括步驟(a)測定所述生物反應器裝置的所述發(fā)酵過程中的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合；其中所述生理代謝參數(shù)選自供氧量、溶氧、攝氧率、pH、二氧化碳釋放率、呼吸商、活細胞量或細胞形態(tài)、測定的代謝產(chǎn)物或基質消耗、或其組合；(b)將步驟(a)測定的所述生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性與預定值的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合進行比較；選出與所述預定值最為接近的生物反應器裝置；確定優(yōu)化的放大生物反應器裝置；其中所述生理代謝參數(shù)如步驟(a)所述。在一優(yōu)選例中，所述方法包括獲得第一生物反應器裝置(也即用于獲得預定值的生物反應器裝置)的優(yōu)化生理代謝特征參數(shù)強度或相關特性等，所述生理代謝特征參數(shù)選自溶氧、攝氧率、PH、二氧化碳釋放率、呼吸商、活細胞量或細胞形態(tài)、各種實驗室手工測定的代謝產(chǎn)物或基質消耗等或其它組合；優(yōu)選地，選自攝氧率、呼吸商、pH等或其它組合。獲得第二生物反應器裝置(也即用于優(yōu)化或放大的生物反應器裝置)的生理代謝特征參數(shù)強度或相關特性等，所述生理代謝特征參數(shù)選自溶氧、pH、攝氧率、二氧化碳釋放率、呼吸商、活細胞量或細胞形態(tài)、各種實驗室手工測定的代謝產(chǎn)物或基質消耗等或其組合；優(yōu)選地，選自攝氧率、呼吸商、pH等或其它組合。調節(jié)所述第二生物反應器裝置的生理代謝特征參數(shù)特征，使其相對于所述第一生物反應器裝置的優(yōu)化生理代謝特征參數(shù)的差異不高于1015%，從而得到過程優(yōu)化和數(shù)據(jù)放大的第二生物反應器裝置。該調節(jié)步驟使得所述第二生物反應器裝置的生理代謝特征參數(shù)特征與所述第一生物反應器裝置具有相同的趨勢即可。具體地，在調節(jié)所述第二生物反應器裝置的生理代謝特征參數(shù)特征時，可以通過調節(jié)所述第二生物反應器裝置中的供氧和耗氧量，從而使得所述第二生物反應器裝置的生理代謝特征參數(shù)特征相對于所述第一生物反應器裝置的優(yōu)化生理代謝特征參數(shù)的差異不高于1015%。更具體地，所述供氧量和耗氧量、OUR的調節(jié)可以根據(jù)本領域傳統(tǒng)的工藝，具體地例如通過攪拌轉速、通氣流量、補碳、氮源或其他基質流量等調節(jié)。在現(xiàn)有技術中，對反應器的優(yōu)化及其放大通常是基于單個或多個工藝控制參數(shù)(例如溫度、pH等)，這些單個或多個工藝控制參數(shù)僅僅基于單一生理調控機制的研究。但是基于單一生理調控機制的研究往往只揭示了生理調控的局部和某一時段的特點，僅靠高度分支化和具體分散的研究是難以對整個發(fā)酵過程優(yōu)化控制和放大起決定性作用。發(fā)明人經(jīng)過大量研究，確定了放大過程中最關鍵的"生理代謝特征參數(shù)"，使得生物學與工程學相結合，并解決局部與整體、時變動態(tài)與最終結果、菌種改造與過程優(yōu)化的關系。具體地，所述攝氧率(OUR)通過測定尾氣氧濃度、通氣流量、發(fā)酵液體積而得到；具體地，例如通過采用下式mol/Lh式中Fin:進氣流量，(mol)CWin\C。2in\Cc。2in:分別為進氣中惰性氣體、氧及二氧化碳的濃度％(V)C。2。ut\C(9C情in'C02ln02i1-(C。2out+CCo2。ut.分別為排氣中氧及二氧化碳的濃度％(V)V:發(fā)酵液體，(L)^273D15,:^7:(T7T10式中Pin:進氣的絕對壓強，Patin:進氣的溫度，°Ch:進氣的相對濕度，％上述計算過程還可以由計算機的分析軟件包進行；例如由發(fā)酵過程實時數(shù)據(jù)分析軟件包BIOSTAR計算得到。如本發(fā)明所述，所述"生物反應器"包括但不限于發(fā)酵罐、動物細胞反應器、或植物細胞反應器。所述方法中的"第一生物反應器裝置"通常是指本領域常用的實驗室規(guī)模或小試規(guī)模的生物反應器裝置。具體地，所述"第一生物反應器裝置"的容量在20500升之間。所述第一生物反應器裝置的"預定值"生理代謝特征參數(shù)可以通過本領域傳統(tǒng)的優(yōu)化方法得到，只要不對本發(fā)明的發(fā)明目的產(chǎn)生限制即可。例如。采用正交法獲得最優(yōu)化的一個或多個生理代謝特征參數(shù)。所述方法中的"第二生物反應器裝置"是指工業(yè)化規(guī)模的生物反應器裝置。具體地，所述"第二生物反應器裝置"的容量在lm3以上。在本發(fā)明的一個具體實施方式中，所述第二生物反應器裝置相對于所述第一生物反應器裝置的放大倍數(shù)不低于202000倍之間。具體地，所述第二生物反應器裝置的容積為202000m3。(二)可進行過程優(yōu)化和數(shù)據(jù)放大的自控生物反應器裝置本發(fā)明還提供一種可進行過程優(yōu)化和數(shù)據(jù)放大的自控生物反應器裝置，所述自控生物反應器裝置包括帶有攪拌器(104)的生物反應器罐體(IOO)，以及對所述生物反應器的工藝控制參數(shù)進行檢測及控制的儀器儀表，所述罐體(100)上設置—傳感裝置單元(101)，所述傳感裝置單元(10)包括設置在所述罐體(100)上的溶解氧傳感器(3)、活細胞量傳感器(10);—與所述傳感裝置單元(101)連接的生理代謝特征參數(shù)計算裝置(20)，所述生理代謝特征參數(shù)計算裝置(20)將所述傳感裝置單元(101)獲得的工藝控制參數(shù)轉化為作為數(shù)據(jù)放大基礎的生理代謝特征參數(shù)。具體地，所述罐體(100)的體積容量在202000M3之間，優(yōu)選1002000M3，更優(yōu)選1002000M3。具體地，所述的傳感單元(101)還包括溫度傳感器(1)，pH傳感器(2)，全罐秤量傳感器(4)，尾氣(A接口(5)，尾氣02接口(6)，測速傳感器(7)，壓力傳感器(8)，消泡傳感器(9)或其組合。更具體地，所述儀器儀表測定的工藝控制參數(shù)是指溫度，攪拌轉速，通氣流量，罐壓，消泡，pH，溶解氧濃度，發(fā)酵液真實體積及重量，補料量包括基質、前體、油、酸堿物，尾氣C02和02。具體地，所述活細胞量傳感器采用四電極系統(tǒng)。所述四電極系統(tǒng)具體地例如根據(jù)放在交變電場中的活細胞，由于細胞內(nèi)的原生質體起著電解質作用，在交變電場的極化作用所形成的電容與生物量呈對應關系。改變交變電場的頻率就會產(chǎn)生不同的極化效果，由此確定最佳的測量條件，測量的電容值通過統(tǒng)一信號傳輸?shù)接嬎銠C數(shù)據(jù)處理，作為多參數(shù)相關分析的生物量的依據(jù)。本發(fā)明的所述傳感單元中的各種傳感器可以采用本領域傳統(tǒng)的各種傳感器，只要其不對本發(fā)明的發(fā)明目的產(chǎn)生限制即可。本發(fā)明的所述儀器儀表的安裝位置可以按照本領域的傳統(tǒng)工藝進行，只要不對本發(fā)明的發(fā)明目的產(chǎn)生限制即可。在本發(fā)明的裝置的一個具體實施方式中，采用以下技術方案—種用于過程優(yōu)化與數(shù)據(jù)放大的自控發(fā)酵裝置，該裝置由帶電機和攪拌器的發(fā)酵罐體、具有多參數(shù)檢測及控制的儀器儀表和傳感裝置的傳感系統(tǒng)、帶安裝支架和工藝管道系統(tǒng)以及帶有工控機及執(zhí)行元器件的電氣控制柜組成，其特征在于其中所述的傳感系統(tǒng)包括溫度傳感器(1)，PH傳感器(2)，溶解氧傳感器(3)，全罐秤量傳感器(4)，尾氣C02接口(5)，尾氣02接口(6)，測速傳感器(7)，壓力傳感器(8)，消泡傳感器(9)，通氣流量傳感器(26)，活細胞量傳感器(10);所述的參數(shù)是指溫度，攪拌轉速，通氣流量，罐壓，消泡，pH，溶解氧濃度，發(fā)酵液真實體積及重量，補料量包括基質、前體、油、酸堿物，尾氣C02和02。其中所述的帶有工控機及執(zhí)行元器件的電氣控制柜包括高精度蠕動泵(11);基質補料電子秤(12);前體或油電子秤(13);酸堿物電子秤(14);循環(huán)泵(25);電磁閥(15);數(shù)/模轉換器(18);模/數(shù)轉換器(17);下位機(19);上位機(20);稀土電機(23)。其中所述的帶安裝支架的工藝管道系統(tǒng)包括料瓶(22);全罐秤量支座；取樣用特殊支架；罐體總成；快速裝拆機座；電動機；管架；油水分離器；減壓閥；過濾器；流量計；空氣過濾器；壓力表；冷卻器；管道視鏡；熱水器；無死體積取樣閥；消泡傳感器接口；尾氣C02接口；尾氣02接口；溫度傳感器；pH傳感接口；D0傳感器接口。上述帶安裝支架的工藝管道系統(tǒng)、電氣控制柜的各個組件及其組成方式均可以按照本領域傳統(tǒng)的工藝進行，只要不對本發(fā)明的發(fā)明目的進行限制即可。所述工控機及執(zhí)行元器件的電氣控制柜構成本發(fā)明所述的生理代謝特征參數(shù)計算裝置(20);其中各種組件均可以采用本領域傳統(tǒng)的組件，只要不對本發(fā)明的發(fā)明目的即可。具體地，所述的帶有工控機及執(zhí)行元器控制柜中的計算機軟件是根據(jù)現(xiàn)場數(shù)據(jù)采集和操作的需求以及工藝優(yōu)化的要求，進行在線參數(shù)采集、離線參數(shù)計算、參數(shù)數(shù)據(jù)記錄以及部分參數(shù)的在線控制，通過局域網(wǎng)同步向上位機傳送所有參數(shù)的數(shù)據(jù)，選用組態(tài)語言和C語言對上位機和下位機分別進行編程設計，并且在數(shù)據(jù)記錄時使用了簡單冗余技術。更具體地，所述計算機軟件采用華東理工大學國家生化工程技術研究中心(上海)的上位機軟件包BI0STAR。本發(fā)明的其他方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。除非另外說明，否則所有的份數(shù)為重量份，所有的百分比為重量百分比。除非另有定義或說明，本文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域技術熟練人員所熟悉的意義相同。此外任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明方法中。發(fā)明的有益效果是(1)即通過發(fā)酵過程表征細胞宏觀代謝流變化的參數(shù)與其它代謝過程中的各種參數(shù)進行基于參數(shù)相關分析的優(yōu)化研究，對P.denitrificans發(fā)酵產(chǎn)VB12的過程中氧的供應與消耗等進行了深入研究，發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵過程供氧不足有可能是限制VB12耗氧能力即合成能力提高的關鍵影響因素之一。并以此為依據(jù)，首先在9m3中試規(guī)模發(fā)酵罐上通過調控DO與OUR的相互關系，使VB12的合成代謝得以正常進行，最終以發(fā)酵過程耗氧特性一致的原理，通過在工業(yè)規(guī)模發(fā)酵罐上調整和改進發(fā)酵工藝，實現(xiàn)了工業(yè)規(guī)模120m3發(fā)酵罐上VB12生產(chǎn)產(chǎn)量的大幅度提高。實施例1:B12發(fā)酵過程優(yōu)化與放大l材料和方法1.l菌種和培養(yǎng)基1.1.1菌株脫氮假單孢桿菌(Pseudomonasdenitrificans)，由石家莊制藥集團華榮制藥有限公司提供。1.1.2培養(yǎng)基—級種子培養(yǎng)基糖蜜、玉米漿、KH2P04、(NH4)2S04、(NH4)2HP04、MnS04等。二級種子培養(yǎng)基糖蜜、玉米漿、KH2P04、(NH4)2S04、(NH4)2HP04、MgS04等。發(fā)酵培養(yǎng)基糖蜜、蔗糖、甜菜堿、(NH》2S04、MgS04、CoCl2、DMBI、ZnS04等。1.2發(fā)酵罐中試發(fā)酵罐容積為9m攪拌器為軸向；工業(yè)規(guī)模發(fā)酵罐容積為120m3，攪拌器主流為軸向混合。1.3分析方法1.3.1生物量測量采用測量菌體干重法(Drycellweight,DCW)。吸取25ml發(fā)酵液，離心后用蒸餾水洗菌體，再次離心后，將菌體105t:烘至恒重后稱量。1.3.2總糖的測定采用斐林試劑法。1.3.3氨基氮的測定甲醛滴定法。1.3.4尾氣分析使用SMENSGXH_9022C02、02分析系統(tǒng)，最后的數(shù)據(jù)處理和相關分析通過華東理工大學國家生化工程技術研究中心(上海)的上位機軟件包BIOSTAR完成。1.3.5溶解氧測定MettlerToledo(市售儀器)在線溶氧檢測系統(tǒng)。1.3.6pH測定:MettlerToledo(市售儀器)在線pH檢測系統(tǒng)。1.3.7VB^測定將被測樣品中不同形式的VB^轉化為氰鈷胺，流動相250mM磷酸水溶液乙腈=30:70，色譜柱C85FI13513260*4.6mm;檢測波長:361nm;進樣量20ul;流速1.7ml/min。2.結果與分析2.1搖瓶中不同供氧水平對發(fā)酵產(chǎn)VB12的影響12由于利用P.denitrificans合成VB12是一個耗氧的代謝過程，在VB12的好氧合成途徑中，還涉及到0原子的加入。但是，目前對P.denitrificans發(fā)酵過程中供氧狀況不同對VB^合成所產(chǎn)生的影響還未有文獻報道。因此本試驗在搖瓶發(fā)酵過程中，通過在相同搖瓶中放入相同量的發(fā)酵液和同樣的接種量情況下，不同發(fā)酵階段的轉速變化來考察搖瓶中不同供氧水平對VB^合成的影響。具體的試驗設計和結果見表1:表1搖瓶發(fā)酵過程中轉速變化對VB12合成的影響(Theeffectofdifferentrevolutionsperminuteinshake—flaskfermentationonVB12biosynthesis)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表1可以看出，當搖瓶發(fā)酵過程的轉速一直為200rpm時，放瓶時的VB12單位最低；搖瓶發(fā)酵過程的轉速一直維持在260rpm時，放瓶時的VB12單位在六種處理中最高，比對照提高24%。搖瓶發(fā)酵過程的第60-100h是P.denitrificans開始大量合成VB12的階段，由表1可以看出，該發(fā)酵階段的供氧狀況對最終放瓶單位影響最為關鍵，該階段轉速為200rpm的三個處理的放瓶VB12單位相對較低，都低于該階段轉速為260rpm的三個處理。從以上試驗結果可以得出結論，搖瓶發(fā)酵過程中供氧狀況良好更有利于VB12的生物合成。2.2在9m3中試規(guī)模發(fā)酵罐上不同供氧與耗氧情況對脫氮假單孢桿菌的代謝影響在對搖瓶研究中獲知了供氧對脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程中代謝的重要性，于是先在安裝了發(fā)酵過程數(shù)據(jù)分析軟件包BI0STAR的中試規(guī)模9m3發(fā)酵罐上進行了實驗，獲得了如圖l所示的代表性代謝曲線從獲得的曲線上可以發(fā)現(xiàn)，在脫氮假單胞桿菌發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵過程的進行，菌量(X)的不斷增加，耗氧率(OUR)與二氧化碳釋放速率(CER)不斷增加，DO也不斷下降，20h左右DO機已降到較低水平(20%左右)，然后0UR、CER均達到了較高水平，隨著發(fā)酵的不斷進行，在80h左右0UR、CER又略有增加，而DO又有所下降(8%左右)，而到了發(fā)酵后階段，實際上菌量的增加已不是太大(X的增加比較平緩)，然而0UR、CER仍維持較高水平，此時VB。的增長卻保持了較高的速率，確實說明VB。的合成過程是一個較強的耗氧過程，在此操作調控下最終的VB12發(fā)酵單位達到了195iig/ml。2.3基于耗氧特征一致的工業(yè)規(guī)模放大研究隨后在120!113工業(yè)規(guī)模發(fā)酵罐上進行了放大實驗，獲得了下述不同操作條件下的代謝情況。調節(jié)120m3工業(yè)規(guī)模發(fā)酵罐的生理代謝特征參數(shù)特征、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合(具體地調節(jié)供氧水平)。參照預定值的生理代謝特征參數(shù)特征，選定與所述預定值最為接近的生物反應器裝置。2.3.1兩種不同供氧水平下發(fā)酵前期0UR、CER、D0、pH的變化圖2和圖3為120!113罐上兩種不同供氧水平下(通氣量F如圖)，發(fā)酵前期在線采集的OUR、CER、D0、pH的變化趨勢圖。由圖2和圖3可以看出，P.denitrificans菌體的延滯期非常短暫，菌體生長后pH呈上升趨勢，pH上升至最高峰后，開始逐漸下降，然后又有個回升的過程，之后又開始下降。在低供氧條件下如圖2顯示，由于pH不斷下降，不得不通過補加氨水來維持發(fā)酵液適宜的pH，所以出現(xiàn)了鋸齒形的pH走勢，而相比之下在供氧較好的情況下(圖3)，在20h后pH非常穩(wěn)定，并不象低供氧水平下的罐批那樣需要流加氨水來調節(jié)pH，可能是因為氧的供應較好，糖代謝完全，積累的有機酸較少，使得PH較平穩(wěn)。而從DO的變化趨勢來看，隨著菌體的生長DO逐漸下降，CER、OUR也同步逐漸增加，圖2中當DO在第17h降至0時，OUR和CER仍然呈現(xiàn)上升趨勢，到第24.5h時OUR和CER到達最高峰，分別達到46mol/(hm3)和44mol/(hm3)。第24.5h之后OUR和CER明顯開始下降，這很可能是由于菌體的生長代謝受到氧的供應的限制而造成的，該罐批下VB12的放罐單位為125yg/ml。而在圖3中，前期的DO走勢相同，但到15h時D0降低程度較圖2高些(約5%)，過程中曾通過增加通氣量使OUR與CER都到了一個新的高度，且OUR和CER并沒有出現(xiàn)明顯的下降趨勢，這說明菌體一直維持著較旺盛的代謝能力，從而更加利于VB12的生物合成，該罐批下VB^的放罐單位為190g/ml。2.3.2放大效果的測定一兩種不同供氧水平下發(fā)酵過程的總糖、氨基氮、菌體干重和VB12等參數(shù)變化情況與上述試驗結果相對應，本試驗測定了兩種不同溶氧控制的罐批下發(fā)酵過程總糖、氨基氮、菌體干重和VB12的變化情況，結果見下圖4:在發(fā)酵過程中，當總糖濃度降低到4g/100ml左右時，開始進行補加糖，控制發(fā)酵液中總糖濃度在3-4g/100ml。由圖4.A可以看出，發(fā)酵前期糖耗基本相似，低供氧罐批的略好一些，這有可能是該批發(fā)酵的菌種質量較好所導致的，但在20h后，供氧較好的罐批其糖耗速率明顯較低供氧罐批要好；發(fā)酵過程氨基氮變化趨勢是較低供氧罐批在第36h之前氨基氮含量較供氧較好的罐批低，但之后，較低供氧罐批的氨基氮高于高溶氧控制的罐批，尤其是120h之后，低溶氧控制罐批的氨基氮回升幅度非常大。氨基氮含量的變化同樣說明了二種供氧情況下罐批的菌體代謝變化，在第36h之后，低溶氧控制罐批的菌體代謝能力由于溶氧限制而下降明顯，更是造成120h之后菌體自溶的加劇。由圖4.B可以看出，在第30h之前，較低供氧罐批的菌體干重略高于供氧較好的罐批，這和在此階段的糖耗、氨基氮含量等均有良好的相關性。但是第30h之后，供氧較好的罐批的菌體干重則一直大于較低供氧罐批，不同的供氧控制策略下的不同罐批下的最大菌體干重分別為35.44g/L和31.26g/L。這再次說明，由于種子質量較好等一些因素，使得較低供氧罐批的菌體生長代謝能力在發(fā)酵前期要優(yōu)于供氧較好的罐批。但是隨著菌體量越來越大，這需要越來越多的氧來滿足菌體的生長代謝，較低供氧罐批在未進行工藝調整的情14況下其供氧能力不能滿足菌體對于氧的需求，使得溶氧降低至0，更是使得溶氧成為菌體生長代謝的限制性因素。另外，從菌體合成VB12來看，第36h時，較低供氧罐批的VB12單位還略高于供氧較好的罐批，分別為20.13iig/ml和18.65iig/ml。但60h之后，供氧較好的罐批的VB12單位卻高于較低供氧罐批，尤其是在第108h之后，供氧較好的罐批的VB12單位的增長幅度更是明顯高于較低供氧罐批，最終的VB12放罐單位供氧較好的罐批比較低供氧罐批的發(fā)酵單位提高了50%，最終發(fā)酵單位達到了190iig/ml。綜合以上兩種不同供氧水平罐批的總糖、氨基氮、菌體干重和VB^等的參數(shù)變化過程，可以得出一個很明顯的結論，P.denitrificans在發(fā)酵過程中，在菌體好氧最為劇烈的發(fā)酵前期，如果不能滿足菌體對氧的需求，會因為氧的供應的限制而嚴重影響菌體的生長代謝，從而導致菌體提前自溶，更是會影響VB12的合成。據(jù)此我們對發(fā)酵過程的攪拌轉速和空氣流量作一定的調整，以改善發(fā)酵過程的供氧、混合及傳質狀況，通過確保發(fā)酵過程的供氧和耗氧，尤其是供氧狀況改善之后有利于發(fā)酵過程菌體的生長和VB12的合成。2.3.3兩種不同供氧水平下發(fā)酵過程比生長速率和比產(chǎn)物形成速率的變化情況在上述兩種不同供氧水平的罐批下，其發(fā)酵過程中P和qp的變化見圖5:由圖5.A可以看出，較低供氧的罐批在第12h時比生長速率就達到最大值，為8.89X10—2h—、而供氧較好罐批在第16h時達到最大值，為9.13X10—2h—、在菌體旺盛生長的階段，供氧較好罐批的比生長速率一直高于較低供氧罐批的比生長速率。第48h之后，二者的菌體比生長速率在1X10—2h—1以下，而第96h之后比生長速率更是接近于0。由圖5.B可以看出，在整個發(fā)酵過程中，供氧較好罐批的qp—直高于較低供氧罐批的qp。結果再次說明，在P.denitrificans發(fā)酵產(chǎn)VB12的過程中，氧的供應的限制會嚴重影響菌體的生長和VB12的合成，而改善發(fā)酵過程中的供氧水平更加有利于發(fā)酵過程菌體的生長和VB12的合成。3.結論目前有很多關于P.denitrifican合成VB12的報道，但主要只是集中在對VB^合成途徑的研究，以及采用隨機誘變和基因工程手段來提高產(chǎn)VB12的水平。而在P.denitrifican產(chǎn)VB^的有關總體實時代謝工藝調控的報道卻較少，大多也都局限于培養(yǎng)基的優(yōu)化等。本文集中探討了發(fā)酵過程宏觀代謝調控中的細胞耗氧特征對P.denitrifican發(fā)酵產(chǎn)VB12的影響。首先通過P.denitrifican的搖瓶試驗考察了供氧狀況對VB^合成的影B向，結果表明供氧狀況良好更有利于VB12的合成；在此基礎上，通過發(fā)酵過程參數(shù)趨勢曲線變化的相關性分析，首先在9m3中試罐上，發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵過程中氧的供給與確保OUR的趨勢是保證VB12合成能力提高的關鍵性因素，因此通過對工藝進行調整和改進，提高了發(fā)酵過程的供氧水平，使得VB12的產(chǎn)量有了大幅提高；最后在工業(yè)規(guī)模120m3發(fā)酵罐上按照同樣原理放大，通過調整工藝操作時的供氧與OUR相關參數(shù)(如圖3進行調節(jié))，使VB12的發(fā)酵單位由工藝改進前的125iig/ml提高到190iig/ml，提高了50%。實施例2:如圖6所示，本發(fā)明的自控生物反應器裝置包括帶有攪拌器(104)的生物反應器罐體(IOO)，該裝置由帶電機和攪拌器(104)的發(fā)酵罐體、具有多參數(shù)檢測及控制的儀器儀表和傳感裝置的傳感系統(tǒng)、帶安裝支架和工藝管道系統(tǒng)以及帶有工控機及執(zhí)行元器件的電氣控制柜組成，其中所述的傳感系統(tǒng)包括溫度傳感器(1)，pH傳感器(2)，溶解氧傳感器(3)，全罐秤量傳感器(4)，尾氣(A接口(5)，尾氣02接口(6)，測速傳感器(7)，壓力傳感器(8)，消泡傳感器(9)，通氣流量傳感器(26)，活細胞量傳感器(10);所述的參數(shù)是指溫度，攪拌轉速，通氣流量，罐壓，消泡，pH，溶解氧濃度，發(fā)酵液真實體積及重量，補料量包括基質、前體、油、酸堿物，尾氣C02和02。傳感裝置單元(101)包括設置在所述罐體(100)上的溶解氧傳感器(3)、活細胞量傳感器(10)。所述的帶安裝支架的工藝管道系統(tǒng)包括料瓶(22)等。所述的帶有工控機及執(zhí)行元器件的電氣控制柜包括；其中所述的帶有工控機及執(zhí)行元器件的電氣控制柜包括高精度蠕動泵(11);基質補料電子秤(12);前體或油電子秤(13);酸堿物電子秤(14);循環(huán)泵(25);電磁閥(15);數(shù)/模轉換器(18);模/數(shù)轉換器(17);下位機(19);上位機(20);稀土電機(23)、通氣流量傳感器(26)。所述的帶有工控機及執(zhí)行元器控制柜中的計算機軟件是根據(jù)現(xiàn)場數(shù)據(jù)采集和操作的需求以及工藝優(yōu)化的要求，進行在線參數(shù)采集、離線參數(shù)計算、參數(shù)數(shù)據(jù)記錄以及部分參數(shù)的在線控制，通過局域網(wǎng)同步向上位機傳送所有參數(shù)的數(shù)據(jù)，選用組態(tài)語言和c語言對上位機和下位機分別進行編程設計，并且在數(shù)據(jù)記錄時使用了簡單冗余技術。在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。權利要求一種對使用生物反應器裝置的發(fā)酵過程進行優(yōu)化放大的方法，其特征在于，所述方法包括步驟(a)測定所述生物反應器裝置的所述發(fā)酵過程中的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合；其中所述生理代謝參數(shù)選自供氧量、溶氧、攝氧率、pH、二氧化碳釋放率、呼吸商、活細胞量或細胞形態(tài)、測定的代謝產(chǎn)物或基質消耗、或其組合；(b)將步驟(a)測定的所述生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性與預定值的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合進行比較；選出與所述預定值最為接近的生物反應器裝置；確定優(yōu)化的放大生物反應器裝置；其中所述生理代謝參數(shù)如步驟(a)所述。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物反應器裝置選自維生素B12發(fā)酵裝置。3.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述的生物反應器裝置是容量為20L—2000m3的發(fā)酵罐。4.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟(a)中，該方法通過檢測生物反應器的多個工藝控制參數(shù)以獲得所述發(fā)酵過程中的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合，其中所述多個工藝控制參數(shù)為攪拌轉速，通氣流量，罐壓，消泡，pH，溶解氧濃度，發(fā)酵液真實體積及重量，補料量包括基質、前體、油、酸堿物，尾氣C02和02。5.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)中，測定的所述生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性與預定值的差異不高于1015%之間。6.如權利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)中所述的預定值是小罐發(fā)酵條件下的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合；其中，所述生物反應器裝置相對于小罐體積的放大倍數(shù)不低于202000倍之間。7.如權利要求l所述的方法，其特征在于，在步驟(b)的比較過程中，還包括如下步驟(i)將步驟(a)測定的所述生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性與預定值的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合進行比較；(ii)調節(jié)所述生物反應器裝置的生理代謝特征參數(shù)特征、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合，使得所述生物反應器裝置的生理代謝特征參數(shù)特征相對于所述預定值的差異不高于1015%之間，選定與所述預定值最為接近的生物反應器裝置；(iii)確定優(yōu)化的放大生物反應器裝置。8.—種可進行過程優(yōu)化和數(shù)據(jù)放大的自控生物反應器裝置，所述自控生物反應器裝置包括帶有攪拌器(104)的生物反應器罐體(100)，以及對所述生物反應器的工藝控制參數(shù)進行檢測及控制的儀器儀表，其特征在于，所述罐體(100)上設置-傳感裝置單元(101)，所述傳感裝置單元(101)包括設置在所述罐體(100)上的溶解氧傳感器(3)、活細胞量傳感器(10);-與所述傳感裝置單元(101)連接的生理代謝特征參數(shù)計算裝置(20)，所述生理代謝特征參數(shù)計算裝置(20)將所述傳感裝置單元(101)獲得的工藝控制參數(shù)轉化為作為數(shù)據(jù)放大基礎的生理代謝特征參數(shù)。9.如權利要求8所述的裝置，其特征在于，所述罐體(100)的體積容量在20L—2000m3之間。10.如權利要求8所述的裝置，其特征在于，所述的傳感單元(101)還包括溫度傳感器(l)，pH傳感器(2)，全罐秤量傳感器(4)，尾氣C02接口(5)，尾氣02接口(6)，測速傳感器(7)，壓力傳感器(8)，消泡傳感器(9)或其組合。全文摘要本發(fā)明提供一種對使用生物反應器裝置的發(fā)酵過程進行優(yōu)化放大的方法，所述方法包括步驟(a)測定所述生物反應器裝置的所述發(fā)酵過程中的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合；其中所述生理代謝參數(shù)選自溶氧、攝氧率、pH、二氧化碳釋放率、呼吸商、活細胞量或細胞形態(tài)、測定的代謝產(chǎn)物或基質消耗、或其組合；(b)將步驟(a)測定的所述生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性與預定值的生理代謝參數(shù)、生理代謝參數(shù)相關特性或其組合進行比較；選出與所述預定值最為接近的生物反應器裝置；確定優(yōu)化的放大生物反應器裝置；其中所述生理代謝參數(shù)如步驟(a)所述。文檔編號C12P19/42GK101775424SQ20081004276公開日2010年7月14日申請日期2008年9月11日優(yōu)先權日2008年9月11日發(fā)明者儲炬,劉東洪,莊英萍,張嗣良,李昆太,杭海峰,王永紅,黃明志申請人:華東理工大學