專利名稱：調(diào)節(jié)塊根植物淀粉組成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)或植物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及調(diào)節(jié)塊根植物淀粉組成的物 質(zhì)及調(diào)節(jié)方法。
背景技術(shù)：
淀粉(starch)是高等植物、藻類和一些微生物細(xì)胞的貯藏物質(zhì)，是無(wú)色無(wú) 臭的白色粉末，廣泛存在于各種植物中，尤以種子(如米、麥、玉米)和塊根(如 木薯、甘薯、馬鈴薯)含量豐富，可作為工業(yè)上制取淀粉的原料，例如可由玉
米、甘薯、馬鈴薯、野生橡子、葛根等含淀粉的物質(zhì)中提取而得。淀粉除食用 外，工業(yè)上用于制糊精、麥芽糖、葡萄糖，也用于調(diào)制印花漿、紡織品的上漿、 紙張的上膠、藥物片劑的壓制等。
淀粉是由許多葡萄糖分子縮合而成的多糖，有直鏈和支鏈兩種。直鏈淀粉 由a-l， 4糖苷鍵連接的葡萄糖分子組成，呈線狀鏈；支鏈淀粉在分支處有a-l， 6糖苷鍵連接，其直鏈部分也是(x-l， 4連接。 一般的淀粉為直鏈及支鏈淀粉的 混合物，直鏈淀粉和支鏈淀粉在淀粉中所占的比例隨植物的種類而異，在多數(shù) 含有淀粉的植物中，通常含有20 30%直鏈淀粉、70 80%支鏈淀粉。在哺乳 動(dòng)物的消化道中，淀粉經(jīng)淀粉酶、麥芽糖酶等作用，水解為葡萄糖，被吸收利 用。
目前，以植物塊根(如木薯塊根)為原料的淀粉加工業(yè)占據(jù)比例突出，但 各種產(chǎn)品的加工對(duì)原材料的淀粉品質(zhì)(如直鏈淀粉和直鏈淀粉的含量比例)提 出了多樣化的需求。依靠傳統(tǒng)育種來(lái)改變淀粉品質(zhì)，耗時(shí)長(zhǎng)，需要大量人力物 力，難以滿足淀粉加工業(yè)的急切需求。
本領(lǐng)域人員已經(jīng)嘗試通過(guò)調(diào)節(jié)淀粉合成的主要基因來(lái)調(diào)節(jié)植物中淀粉的 組成和含量，然而與淀粉合成相關(guān)的基因有多種，如何找到一種合適的靶基因 是值得深入研究的課題；此外，如何找到合適的方法來(lái)調(diào)節(jié)相關(guān)基因也是值得 深入研究的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供塊根植物淀粉組成的物質(zhì)及調(diào)節(jié)方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸是顆粒 結(jié)合型淀粉合成酶I(GBSSI)基因的一部分，其長(zhǎng)度是100-500bp;較佳的是 150-250bp;更佳的約180-210bp。
在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸是
(a) 如SEQIDNO: 1中第(1371 ± 10) (1570± IO)位所示的核苷酸序列；
(b) 與(a)限定的序列基本上互補(bǔ)的序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸是如SEQIDNO: 1中第(1371土5) (1570士5)位所示的序列。
在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸是如SEQIDNO: 1中第1371 1570
位所示的核苷酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于制備降低植物中 直鏈淀粉含量的構(gòu)建物。
在本發(fā)明的第三方面，提供一種構(gòu)建物，所述構(gòu)建物含有式(I)所示的結(jié)構(gòu)
Seq正向-X-Seq反向 《(I)，
式(I)中，
Seq正6為所述的多核苷酸，Seq^為與S叫^基本上互補(bǔ)的多核苷酸； X為位于Seq^和Seq^之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq^和Seq反 向不互補(bǔ)。
在另一優(yōu)選例中，式(I)所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，形成式(II)所示的二 級(jí)結(jié)構(gòu)
Seq正向
8叫反向"^ 式(II)，
式(II)中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述， II表示在Seq正向和S叫反向之間的基本上互補(bǔ)的關(guān)系。
5在另一優(yōu)選例中，所述的間隔序列本身不構(gòu)成互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度是在 50-卯b (較佳的是60-85bp;更佳的是65-75bp)。
在另一優(yōu)選例中，所述的間隔序列具有SEQIDN0:2所示的序列。
在本發(fā)明的第四方面，提供一種載體，所述的載體含有所述的構(gòu)建物。 在另一優(yōu)選例中，所述的載體是雙元載體，含有與所述的構(gòu)建物操作性相 連的啟動(dòng)子。較佳的所述的啟動(dòng)子是CaMV35S啟動(dòng)子(組成型啟動(dòng)子)和/或P54 啟動(dòng)子(木薯維管束特異表達(dá)啟動(dòng)子，可調(diào)控Glutamic acid-rich protein c54基 因表達(dá)，Genbank登錄號(hào)AY217353)。
在另一優(yōu)選例中，所述的載體是pCAMBIA1300載體。
在本發(fā)明的第五方面，提供所述構(gòu)建物的用途，用于導(dǎo)入到植物中，抑制 顆粒結(jié)合型淀粉合成酶I表達(dá)，從而抑制植物中直鏈淀粉的合成。
在另一優(yōu)選例中，所述的植物是塊根植物、塊莖植物或種子植物； 在一優(yōu)選例中，所述的植物選自(但不限于)木薯、甘薯、馬鈴薯、山藥、 芋頭、葛根。
在本發(fā)明的第六方面，提供一種降低植物中直鏈淀粉含量的方法，所述方 法包括將所述的構(gòu)建物或所述的載體轉(zhuǎn)染到植物中。
在另一優(yōu)選例中，所述方法包括
(1) 提供攜帶所述的構(gòu)建物或所述的載體的農(nóng)桿菌
(2) 將植物細(xì)胞、組織或器官與步驟(l)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述構(gòu)建 物轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞、組織或器官；和
(3) 選擇出轉(zhuǎn)入所述構(gòu)建物的植物細(xì)胞、組織或器官，再生成植株。
本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而 易見(jiàn)的。


圖1顯示了本發(fā)明人構(gòu)建的重組載體pC-35S-GBSSI-RNAi和 pC-P54-GBSSI-RNAi的部分圖譜結(jié)構(gòu)。圖2顯示了RT-PCR分析轉(zhuǎn)基因木薯中GBSSI基因的表達(dá)。以木薯cl5基因?yàn)?內(nèi)參，轉(zhuǎn)基因品系中GBSSI的表達(dá)受到不同程度的抑制。其中，泳道M: Marker; 泳道WT:野生型木薯GBSSI的表達(dá)情況；泳道l-8:轉(zhuǎn)基因不同株系木薯GBSSI 的表達(dá)情況。這些株系分別稱為TG-1， TG-2， TG-3， TG-4， TG-5， TG-6， TG-7 和TG-8。
圖3顯示了野生型與轉(zhuǎn)基因木薯TG-7株系碘染的差異顯示轉(zhuǎn)基因木薯的 淀粉組成發(fā)生改變，直鏈淀粉含量明顯下降。其中，直鏈淀粉遇碘呈現(xiàn)深藍(lán)色， 支鏈淀粉呈現(xiàn)棕紅色。
圖4顯示了碘染淀粉粒表明淀粉粒的組成明顯發(fā)生變化。其中，左邊為野 生型木薯組織的碘染結(jié)果，呈現(xiàn)藍(lán)黑色；右邊為GBSSI-RNAi轉(zhuǎn)基因木薯TG-7 株系組織的碘染結(jié)果，呈現(xiàn)紅棕色。放大倍數(shù)400倍光鏡。
圖5顯示了作圖法選擇淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛的研究，找到了一種可良好地調(diào)節(jié)塊根植物淀粉組成的 新方法。通過(guò)在植物中形成小分子RNA來(lái)干擾顆粒結(jié)合型淀粉合成酶 I(Granule-Bound Starch Synthase I， GBSSI)，可有效地調(diào)節(jié)直連淀粉或支鏈淀粉 的生物合成水平，且獲得的轉(zhuǎn)基因植物遺傳性狀穩(wěn)定。
如本文所用，"分離的"是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(lái)(如果是天然的 物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多 肽是沒(méi)有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其 他物質(zhì)中分開(kāi)，則為分離純化的。
如本文所用，所述的"操作性連接"或"操作性相連"或"可操作地連 接"可互換使用，指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。 例如啟動(dòng)子區(qū)被置于相對(duì)于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列 的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被"操作性連接"到該核酸序列上。
如本文所用，所述的"植物"是指含有GBSSI基因的植物，通常是塊根植 物或植物種子，所述的植物包括但不限于薯類植物、塊莖類植物、種子類植 物。例如所述植物可選自木薯(M腿7 o",/e幽)、甘薯(// o,eatototo)、 馬鈴薯(So/a肌m ^&rowm)、山藥(D/o咖削^ .)。更特別的，所述的植物是 木薯(Mam7jo《escw/e幽)。
如本文所用，"互補(bǔ)"的序列通常是指將5' -3'方向的序列轉(zhuǎn)換為其3 -5 方向的序列(如5 ATCG3 —GCTA)，然后再取其互補(bǔ)序列(如GCTA—5 CGAT 3)。"基本上互補(bǔ)"是指兩段核苷酸的序列是足夠互補(bǔ)的，可以以一種可預(yù) 見(jiàn)的方式發(fā)生相互作用，如形成二級(jí)結(jié)構(gòu)(如莖環(huán)結(jié)構(gòu))。通常，兩條"基本上 互補(bǔ)"的核苷酸序列互相之間至少有70%的核苷酸是互補(bǔ)的；優(yōu)選的，至少 有80%的核苷酸是互補(bǔ)的；更優(yōu)選的，至少有90%的核苷酸是互補(bǔ)的；進(jìn)一 步優(yōu)選的，至少有95%的核苷酸是互補(bǔ)的；如96%、 98%、 99%或100%。
如本文所用，"莖環(huán)"結(jié)構(gòu)是指一種核酸構(gòu)建物，其可形成一種包括雙鏈 區(qū)域(莖部，含有本發(fā)明的多核苷酸)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，所述的雙鏈區(qū)域由該構(gòu)建物 的兩個(gè)區(qū)域(位于同一條多聚核甘酸鏈上)形成，兩個(gè)區(qū)域分列雙鏈部分的兩 側(cè)；其還包括至少一個(gè)"環(huán)"結(jié)構(gòu)，包括非互補(bǔ)的核苷酸分子，即單鏈區(qū)域。 即使該構(gòu)建物的兩個(gè)區(qū)域不是完全互補(bǔ)的，核苷酸的雙鏈部分也可保持雙鏈狀 態(tài)。例如，插入、缺失、取代等可導(dǎo)致一個(gè)小區(qū)域的不互補(bǔ)或該小區(qū)域自身形 成莖環(huán)結(jié)構(gòu)或其它形式的二級(jí)結(jié)構(gòu)，然而，該兩個(gè)區(qū)域仍可基本上互補(bǔ)，并在 可預(yù)見(jiàn)的方式中發(fā)生相互作用，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙鏈區(qū)域。莖環(huán)結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域 技術(shù)人員所熟知的，通常在獲得了一條具有一級(jí)結(jié)構(gòu)的核苷酸序列的核酸后， 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定該核酸是否能形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)。
如本文所用，所述的"含有"，"具有"或"包括"包括了 "包含"、"主 要由 構(gòu)成"、"基本上由 構(gòu)成"、和"由 構(gòu)成"；"主要由 構(gòu)成"、"基本上由 構(gòu)成"和"由 構(gòu)成"屬于"含有"、"具有"或 "包括"的下位概念。
本發(fā)明人針對(duì)多種淀粉合成涉及的主要基因進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)抑制 GBSSI的表達(dá)可良好地調(diào)節(jié)植物中淀粉的組成，可非常有效地降低淀粉中直鏈 淀粉的含量，提高淀粉中支鏈淀粉的含量。所述的GBSSI基因的序列可與SEQ
8說(shuō) IDNO: 1所示的序列基本上相同，SEQIDNO:l中，第75-1卯1位為開(kāi)放閱讀 框(ORF)序列。
并且，本發(fā)明人在反復(fù)比較的基礎(chǔ)上確定了一種對(duì)于干擾植物中GBSSI 表達(dá)異常有效的多核苷酸，其通過(guò)在導(dǎo)入植物后被植物細(xì)胞剪切或加工形成 小分子RNA而有效地干擾GBSSI的表達(dá)。目前已知的小分子干擾方式有以下幾 種miRNA調(diào)控的基因沉默，正義RNA引起的共抑制(Cosuppression)，反義 RNA抑制，病毒介導(dǎo)的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing, VIGS)，發(fā)卡 式RNA(hairpinRNA， hpRNA)介導(dǎo)的基因沉默。植物中正義RNA，反義RNA 介導(dǎo)的基因沉默的效率比較低，成功轉(zhuǎn)基因的報(bào)道很少見(jiàn)，microRNA對(duì)于植 物的調(diào)控機(jī)理研究所知更少，目前停留在基礎(chǔ)研究階段，利用miRNA進(jìn)行轉(zhuǎn) 基因的應(yīng)用研究甚少。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用于干擾GBSSI表達(dá)時(shí)，采用 hpRNA技術(shù)與基于miRNA等原理的干擾方式相比，具有顯著的優(yōu)勢(shì)，干擾效 果非常好。
因此，本發(fā)明提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸是顆粒結(jié)合型淀 粉合成酶I (GBSSI)編碼基因的一部分，其長(zhǎng)度是100-500bp;較佳的是 150-250bp;更佳的約180-210bp。所述的多核苷酸可用于制備降低植物中直鏈 淀粉含量的構(gòu)建物。優(yōu)選地，所述的多核苷酸具有(a)如SEQIDNO:l中第 (1371±10) (1570±10)所示的核苷酸序列；或(b)與(a)限定的序列基本上互 補(bǔ)的序列；基于該多核苷酸設(shè)計(jì)的構(gòu)建物在導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)后形成的小分子 RNA可特別有效地抑制植物細(xì)胞內(nèi)GBSSI的表達(dá)。
所述的"(1371±10) (1570±10)所示的核苷酸序列"指定了一系列的序列， 即"1371 1570位所示的核苷酸序列或其鄰近序列"，所述序列可起始于SEQ ID NO: 1中第1361位至第1381位中的任一位的堿基，終止于SEQ ID NO: 1 中第1560至第1580位任一位的堿基。
根據(jù)本發(fā)明所提供的多核苷酸序列，可設(shè)計(jì)出在被導(dǎo)入植物中后可被植物 加工成干擾GBSSI表達(dá)的多核苷酸構(gòu)建物，從而通過(guò)影響GBSSI表達(dá)調(diào)節(jié)植物 中淀粉的組成。因此，本發(fā)明提供了一種分離的或人工構(gòu)建的多核苷酸構(gòu)建 物，所述的多核苷酸構(gòu)建物可被植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄且在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)成所述的小分 子RNA。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述的多核苷酸構(gòu)建物含有式(I)所 示的結(jié)構(gòu)Seq正向-X-Seq反向 《(I)，
式(I)中，S叫^為本發(fā)明所述的多核苷酸，Seq^為與Seq^基本上互補(bǔ)的 多核苷酸；X為位于S叫^和S叫^之間的間隔序列，并且所述間隔序列與Seq正 向和Seq^不互補(bǔ)，并且間隔序列本身也不構(gòu)成互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)。
式(I)所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞后，形成式(II)所示的二級(jí)結(jié)構(gòu)("莖環(huán)" 結(jié)構(gòu))-
Seq正向一^n Seq反向"^ 式(11)，
II表示在SeqsA和S叫s^之間的基本上互補(bǔ)的關(guān)系。
通常，所述的多核苷酸構(gòu)建物位于表達(dá)載體上。因此，本發(fā)明還包括一種 載體，它含有所述的多核苷酸構(gòu)建物。所述的表達(dá)載體通常還含有啟動(dòng)子、復(fù) 制起點(diǎn)和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需 的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù) 等。所述的表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個(gè)或多個(gè)選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇 轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如卡拉霉素、氨芐青霉素抗性。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的載體是雙元載體，含有與所述的構(gòu)建物操 作性相連的雙啟動(dòng)子。較佳的所述的雙啟動(dòng)子是CaMV35S啟動(dòng)子(組成型啟動(dòng) 子)和P54啟動(dòng)子(維管束特異表達(dá)啟動(dòng)子)。較佳的，所述的載體是 pCAMBIA1300載體。
包含上述的適當(dāng)基因序列以及適當(dāng)啟動(dòng)子或者控制序列的載體，可以用 于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗?。所述的宿主通常是含有GBSSI基因的植物細(xì)胞(較佳的 是木薯細(xì)胞)，或也可以是任何適合于攜帶所述表達(dá)載體并能夠?qū)⑺霰磉_(dá)載 體傳遞給植物細(xì)胞的細(xì)胞；優(yōu)選的，所述的宿主為農(nóng)桿菌。對(duì)于發(fā)生轉(zhuǎn)化的 植物細(xì)胞、組織、或器官可以用本領(lǐng)域己知的常規(guī)方法再生成植株，從而獲 得所需的轉(zhuǎn)基因的植物。
本發(fā)明還涉及一種通過(guò)調(diào)節(jié)植物中淀粉組成(即降低直鏈淀粉的含量，提 高支鏈淀粉的含量)改良植物的方法，該方法包括抑制(干擾)植物中GBSSI 基因的表達(dá)。優(yōu)選地，基于本發(fā)明的多核苷酸來(lái)制備在導(dǎo)入植物細(xì)胞后可特異性干擾GBSSI表達(dá)的多核苷酸構(gòu)建物，將該構(gòu)建物導(dǎo)入到植物細(xì)胞，從而調(diào)節(jié) 植物中淀粉的組成。
作為本發(fā)明的優(yōu)選方式， 一種制備直鏈淀粉含量低的植物的方法包括-
(1) 提供攜帶表達(dá)載體的農(nóng)桿菌，所述的表達(dá)載體含有所述的導(dǎo)入植物細(xì) 胞后可特異性干擾GBSSI表達(dá)的多核苷酸構(gòu)建物；
(2) 將植物細(xì)胞、組織或器官與步驟(l)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述構(gòu)建 物轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞；
(3) 選擇出轉(zhuǎn)入所述構(gòu)建物的植物細(xì)胞、組織或器官，再生成植株。 所述植物細(xì)胞、組織或器官再生成植株后，該轉(zhuǎn)基因植物中相應(yīng)的GBSSI
基因的表達(dá)與野生型植物不同。
在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，改變了木薯中的GBSSI表達(dá)，從而有效地調(diào) 節(jié)了木薯中淀粉組成，得到了直鏈淀粉與支鏈淀粉含量比例變化的木薯轉(zhuǎn)基因 新品種。木薯的淀粉組成是影響其應(yīng)用的重要因素，常規(guī)木薯淀粉直鏈淀粉含 量在22%-32%之間，培育淀粉組成不同的木薯新品種可擴(kuò)展木薯淀粉的應(yīng)用范 圍，特別在新材料開(kāi)發(fā)方面。本發(fā)明人通過(guò)表達(dá)與木薯淀粉合成相關(guān)基因的小 分子RNA干擾了木薯儲(chǔ)藏根中控制直鏈淀粉和支鏈淀粉合成的主要基因 GBSSI的表達(dá)，利用RT-PCR比較了轉(zhuǎn)GBSSI-RNAi木薯中GBSSI基因的表達(dá) 量的變化及貯藏根碘染試驗(yàn)說(shuō)明直鏈淀粉含量確實(shí)與野生型相比發(fā)生了較大 的變化。
定性或定量測(cè)定植物中淀粉的含量以及淀粉組成(即直鏈淀粉與支鏈淀粉 的含量或比例)的方法是本領(lǐng)域人員熟知的。一種經(jīng)典的定性方法是顏色分析方 法，基于的原理是淀粉可與碘形成碘-淀粉復(fù)合物并具有特殊的顏色反應(yīng)，直鏈 淀粉遇碘呈現(xiàn)深藍(lán)色(或藍(lán)黑色)，支鏈淀粉呈現(xiàn)棕紅色。另外，還可采用雙波 長(zhǎng)比色法來(lái)定量地進(jìn)行鑒定，該方法有相對(duì)更高的精密度。此外，在分子水平 上鑒定淀粉中直鏈和支鏈淀粉含量及比例，以及淀粉在工業(yè)生產(chǎn)中的各項(xiàng)指標(biāo) (如黏度，糊化溫度等)的方法也是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
(1)本發(fā)明基于小分子RNA干擾技術(shù)來(lái)干擾GBSSI基因的表達(dá)，從而達(dá) 到調(diào)節(jié)植物中淀粉組成的目的，且獲得的轉(zhuǎn)基因植物遺傳性狀穩(wěn)定，為改變植
11物淀粉品質(zhì)提供了全新的可行的思路。
(2) 可以在短時(shí)間內(nèi)得到不同于野生型淀粉品質(zhì)的新植株，克服了傳統(tǒng)選 育技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)、受偶然因素影響的缺陷。
(3) 當(dāng)用于食品工業(yè)時(shí)，淀粉中直鏈淀粉含量的降低有效地提高淀粉食品 的口感。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō) 明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方 法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。除非另外說(shuō)明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例1、載體構(gòu)建
根據(jù)已公布的GBSSI基因序列(NCBI登錄號(hào)X74160),獲得GBSSI中適 當(dāng)?shù)膮^(qū)域(也即SEQIDNO: 1中第1371-1570位)，通過(guò)一個(gè)人工合成的內(nèi)含子 (SEQIDNO:2)作為間隔序列進(jìn)行正反向連接，插入到CaMV 35S(常規(guī)的組成 型啟動(dòng)子)或P54(木薯維管束特異表達(dá)啟動(dòng)子，Genbank登錄號(hào)AY217353, 采用起始密碼子上游的1080bp序歹U(即-1 -1080位))啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的 pCAMBIA1300雙元載體的￡coRI禾卩義6fll位點(diǎn)中，分別獲得重組載體 pC-35S-GBSSI-RNAi和pC-P54-GBSSI-RNAi(圖1)，用于轉(zhuǎn)化木薯制備轉(zhuǎn)基因 植物。
所用的內(nèi)含子序列為(SEQIDNO:2): CTTCTTTATTTATTAAATTTATAG-3 。
實(shí)施例2、轉(zhuǎn)基因木薯、甘薯的制備與植株再生
將含有上述pC-35S-GBSSI-RNAi與pC-P54-GBSSI-RNAi的兩種重組雙 元載體的農(nóng)桿菌分別轉(zhuǎn)化木薯脆性愈傷，利用胚胎發(fā)生和器官發(fā)生途徑再生得到轉(zhuǎn)基因植株。具體方法如下
1. 用滅菌牙簽從平板上挑取含重組雙元載體的農(nóng)桿菌單一克隆，將其置于 抗性YEB培養(yǎng)基上，在28'C， 240ipm下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。
2. 取25"菌液，加到50ml新鮮的YEB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12-20小時(shí)至OD謹(jǐn) 為0.5-1.0。
3. 6000rpm， 4。C離心菌液10min，用50ml液體MS培養(yǎng)基(PH 5.3)懸浮沖 洗，再離心一次。將菌液重懸于包含200iiM乙酰丁香酮的液體MS培養(yǎng)基中， OD麵為1.0。
4. 吸取2ml破碎過(guò)濾的懸浮培養(yǎng)液到10ml農(nóng)桿菌菌液中，共培養(yǎng)45min。 移走多余的菌液，將愈傷放到無(wú)菌濾紙上吸干殘留菌液，置于包含100um乙 酰丁香酮的SH固體培養(yǎng)基上，25。C共培養(yǎng)3天。
5. 從濾紙上將轉(zhuǎn)化的愈傷轉(zhuǎn)移到30mlSH培養(yǎng)基中。
6. 反復(fù)吸打清洗數(shù)次，倒掉培養(yǎng)基，反復(fù)清洗數(shù)次。
7. 將愈傷轉(zhuǎn)到含12.5mg/l潮霉素和500mg/l羧芐青霉素的SH培養(yǎng)基中， 137卬m，連續(xù)光照(約50 u mol m-2s")培養(yǎng)3天。
8. 將愈傷繼代到含25mg/l潮霉素和500mg/l羧芐青霉素的SH培養(yǎng)基中， 108rpm，連續(xù)光照(約50詣o1 m-Y')培養(yǎng)，每3天繼代一次。
9. 2周后，抗性愈傷長(zhǎng)出與未加篩選劑的對(duì)照同樣的鮮黃的，脆性的胚性 愈傷。
10. 將篩選了 2-3周的懸浮培養(yǎng)的抗性愈傷轉(zhuǎn)到包含10mg/l潮霉素的體細(xì) 胞胚胎發(fā)生固體培養(yǎng)基(MSN)上，26°C， 16小時(shí)光照培養(yǎng)。
11.2-4周后，抗性胚愈傷形成，將抗性愈傷轉(zhuǎn)移到包含12.5mg/l潮霉素的 胚成熟培養(yǎng)基(CMM)上培養(yǎng)，使其長(zhǎng)出子葉胚。
12. 將成熟胚轉(zhuǎn)移到莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(CEM)上，2-4周后可以從子葉形胚發(fā)育 出新莖條。
13. 將新莖段轉(zhuǎn)移到MS基本培養(yǎng)基(CBM)上，3周后，切下lcm左右的 從側(cè)芽長(zhǎng)出的莖段轉(zhuǎn)移到含8mg/l潮霉素的基本培養(yǎng)基(CBM)上觀察根的生成， 使用未轉(zhuǎn)基因的植株做陰性對(duì)照。
14. 1周后觀察根的生長(zhǎng)情況，能生根的植株用于分子檢測(cè)。
采用如上述同樣的方法，還制備了甘薯轉(zhuǎn)基因植物，并且經(jīng)鑒定獲得了轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性的植株。
實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)
利用RT-PCR從分子水平檢測(cè)轉(zhuǎn)基因木薯中GBSSI基因表達(dá)的情況。用TIANGEN公司的TRIZOL(DP421)試劑，從野生型和轉(zhuǎn)基因的木薯離體苗葉片中提取總RNA，以oligo(dT)為第一鏈引物，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(TIANGENER104-03)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GBSSI， c15基因的各自特異性的引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，得出結(jié)果。
結(jié)果見(jiàn)圖2，表明8個(gè)轉(zhuǎn)基因木薯株系中GBSSI基因的表達(dá)受到較大程度的干擾。
同樣，利用RT-PCR從分子水平可檢測(cè)轉(zhuǎn)基因甘薯中GBSSI基因表達(dá)的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株中GBSSI基因的表達(dá)受到極大干擾。
實(shí)施例4、木薯淀粉組成的變化
一. 碘染色鏡檢
取野生型和轉(zhuǎn)基因木薯TG-7株系的葉片、莖及儲(chǔ)藏根分別進(jìn)行1%碘液染色。具體染色方法如下
葉片以75%乙醇脫色30分鐘，蒸餾水沖洗一次，加入1毫升1%碘液，染色過(guò)夜，除去碘液，蒸餾水沖洗多余碘液，鏡檢。
莖段，儲(chǔ)藏根將材料切成薄片，根據(jù)薄片大小，將適量碘液滴加至薄片
上，顯色后，立即鏡檢。
結(jié)果見(jiàn)圖3，證明轉(zhuǎn)基因木薯中淀粉的組成發(fā)生顯著變化。
二. 雙波長(zhǎng)比色法測(cè)定木薯中淀粉的組成
采用雙波長(zhǎng)比色法測(cè)定木薯中淀粉的組成，根據(jù)雙波長(zhǎng)比色原理，如果溶液中某溶質(zhì)在兩個(gè)波長(zhǎng)下均有吸收，則兩個(gè)波長(zhǎng)的吸收差值與溶質(zhì)濃度成正比。直鏈淀粉與碘作用產(chǎn)生純藍(lán)色，支鏈淀粉與碘作用生成紫紅色或紅棕色。用兩種淀粉的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別與碘反應(yīng)，然后在同一個(gè)坐標(biāo)系里進(jìn)行掃描(400 -960 mm)或做吸收曲線，得到圖5所示結(jié)果。圖中，1為直鏈淀粉的吸收曲線，2為支鏈淀粉的吸收曲線。對(duì)含有直鏈淀粉和支鏈淀粉的未知樣品，與碘顯色
14后，只要在選定的波長(zhǎng)入X1，人2， X3， M，處作4次比色，利用直鏈淀粉和支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線即可分別求出樣品中兩類淀粉的含量。
操作步驟
1. 選擇直鏈、支鏈淀粉測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng)
直鏈淀粉取lmg/ml直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液lml，放入50ml容量瓶中，加蒸餾水30ml，以0.1mol/LHCl溶液調(diào)至pH 3.5左右，加入碘試劑0.5ml，并以蒸餾水定容。靜置20min，以蒸餾水為空白，用雙光束分光光度計(jì)進(jìn)行可見(jiàn)光全波段掃描或用普通比色法繪出直鏈淀粉吸收曲線。
支鏈淀粉取lmg/ml支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液lml，放入50ml容量瓶中，以下操作同直鏈淀粉。在同一坐標(biāo)內(nèi)獲得支鏈淀粉可見(jiàn)光波段吸收曲線。
根據(jù)原理部分介紹的方法，確定直鏈淀粉和支鏈淀粉的測(cè)定波長(zhǎng)、參比波長(zhǎng)X2 、 XI 、 X4和X3。
2. 制作雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線
吸取lmg/ml直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液0.3 、 0.5 、 0.7 、 0.9 、 1.1 、 1.3ml分別放入6只不同的50ml容量瓶中，加入蒸餾水30ml，以O(shè).lmol/LHC1溶液調(diào)至pH3.5左右，加入碘試劑0.5 ml，并用蒸餾水定容。靜置20min，以蒸餾水為空白，用lcm比色杯在X1 、X2兩波長(zhǎng)下分別測(cè)定A XI，AX2即得A A直二AX2—AX1以AA直為縱坐標(biāo)，直鏈淀粉含量(mg)為橫坐標(biāo)，制備雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 制作雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線
吸取lmg/ml支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 、 2.5 、 3.0 、 3.5 、 4.0 、 4.5 、5.0ml分別放入6只不同的50ml容量瓶中。以下操作同直鏈淀粉。以蒸餾水為空白，用lcm比色杯在X3， 兩波長(zhǎng)下分別測(cè)定其A入3， AX4即得AA支二AX4-AX3。以AA支為縱坐標(biāo)，支鏈淀粉含量(mg )為橫坐標(biāo)，制備雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4. 樣品中直鏈淀粉、支鏈淀粉及總淀粉的測(cè)定
15樣品粉碎過(guò)60目篩，用乙醚脫脂，稱取脫脂樣品O.lg左右(精確至1mg)，置于50ml容量瓶中。力f] 0.5mol/LKOH溶液10ml，在沸水浴中加熱10min，取出，以蒸餾水定容至50ml若有泡沫采用乙醇消除)，靜置。吸取樣品液2.5ml兩份(即樣品測(cè)定液和空白液)，均加蒸餾水30ml，以0.1mol/LHCI溶液調(diào)至pH3.5左右，樣品中加入碘試劑0.5ml，空白液不加碘試劑，然后均定容至50ml 。靜置20min，以樣品空白液為對(duì)照，用lcm比色杯，分別測(cè)定X2， XI，人4，的吸收值A(chǔ)入2， AX1， AX4， A X 3.得到A A直=AX2-AX1 △ A支=AX4-A^3.分別查兩類淀粉的雙波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可計(jì)算出脫脂樣品中直鏈淀粉和支鏈淀粉含量。二者之和等于總淀粉含量。
結(jié)果處理，采用如下公式
XI X50 X膨'
直鏈淀粉(％)=-
2.5 X m X lOOOw
X2 X50 X,
支鏈淀粉(％) =^-
2.5 X m X IOO(V
式中，
XI:查雙波長(zhǎng)直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品液中直鏈淀粉含量(mg);X2:査雙波長(zhǎng)支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品液中支鏈淀粉含量(mg);m:樣品質(zhì)量(g);
總淀粉(％)=直鏈淀粉(％)+支鏈淀粉(％)。
試劑配制如下
碘試劑稱取碘化鉀2.0g，溶于少量蒸餾水，再加碘0.2g，待溶解后用蒸餾水稀釋定容至lOOml。
直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液稱取直鏈淀粉純品O.lOOOg，放在100ml容量瓶中，加入0.5mol/LKOH 10ml，在熱水中待溶解后，取出加蒸餾水定容至100ml,即為lmg/ml直鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。
支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)液用O.lOOOg支鏈淀粉按同樣方法制備成lmg/ml支鏈淀粉標(biāo)準(zhǔn)溶液。
經(jīng)測(cè)定，轉(zhuǎn)基因木薯TG-7株系中直鏈淀粉的含量占淀粉總含量的1%，支
鏈淀粉的含量占淀粉總含量的99%。
用同樣的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因甘薯的淀粉含量，經(jīng)測(cè)定，轉(zhuǎn)基因甘薯株系中直鏈淀粉的含量占淀粉總含量的2.5%，支鏈淀粉的含量占淀粉總含量的97.5%。
實(shí)施例5、轉(zhuǎn)基因木薯淀粉粒碘染觀察
對(duì)野生型和轉(zhuǎn)基因木薯TG-7株系的淀粉粒進(jìn)行碘染觀察，方法如下
1:提取木薯塊根中提取淀粉組織搗碎機(jī)研磨，100Wm濾膜過(guò)濾，離心
收集沉淀，4(TC烘兩天即可。
2:取適量淀粉加入足量1%碘液顯色，立即鏡檢。
結(jié)果如圖4所示，證實(shí)轉(zhuǎn)基因木薯株系儲(chǔ)藏根中的淀粉粒直鏈淀粉含量明顯下降。
實(shí)施例6、 SEQ ID NO: 1中1371 1570位鄰近片段的干擾能力通過(guò)常規(guī)PCR方法，本發(fā)明人還獲得了對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1中第1367-1567位序列的核酸片段，如前述實(shí)施例l的方法，通過(guò)人工合成的內(nèi)含子(序列如SEQ ID NO: 2)進(jìn)行正反向連接，將該核酸構(gòu)建物克隆入pCAMBIA1300雙元載體中P54/35S啟動(dòng)子后面使之與啟動(dòng)子可操作性連接，并將重組載體轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌中，轉(zhuǎn)化木薯植物的愈傷組織。獲得的轉(zhuǎn)基因植物在成熟后，如實(shí)施例4的方法檢測(cè)其中直鏈淀粉和直鏈淀粉的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直鏈淀粉的含量占淀粉總含量的2%以下，支鏈淀粉的含量占淀粉總含量的98%以上。
通過(guò)常規(guī)PCR方法，本發(fā)明人還獲得了對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1中第1375-1573位序列的核酸片段，如前述實(shí)施例1的方法，通過(guò)人工合成的內(nèi)含子(序列如SEQ ID NO: 2)進(jìn)行正反向連接，將該核酸構(gòu)建物克隆入pCAMBIA1300雙元載體中P54/35S啟動(dòng)子后面使之與啟動(dòng)子可操作性連接，并將重組載體轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌中，轉(zhuǎn)化木薯植物的愈傷組織。獲得的轉(zhuǎn)基因植物在成熟后，如實(shí)施例4的方法檢測(cè)其中直鏈淀粉和直鏈淀粉的組成，結(jié)果發(fā)現(xiàn)
17直鏈淀粉的含量占淀粉總含量的2%以下。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。序列表
<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120〉調(diào)節(jié)塊根植物淀粉組成的方法
<130〉 083966
<160〉 2
<170〉 Patentln version 3.3
<210〉 1
<211〉 2168
<212〉 DNA
<213〉 木薯(船/ /力ot escWe/ f2 Crantz)
<400〉 1
atcaaatctccactccaccac^ccaxcagcggaacctattttgcgcctaagcttctaca60
ccggag卿gcaccatggcaactgt犯tagctgcacatttcgtttccaggagctcacact120
tgagcatccatgcattagagactaeiggctaataatttgtctcacactggEiccctggaccc180
aaactatcactcccaatggtttaaggtccctcaacactatggataaactcC3犯tgaag3240
agctgtga^aaaggtctctgccaccggcaatggtaggcctgctgccaaaa300
ttatttgtggtcatggaatgaatttaatctttgttggagctgaagttggtccctggagca360
aaactggtggacttggtgatgttcttggaggactcccccctgccatggccgcaagagggc420
accgcgtcatgacagtgtctccccgctatgggatgcttgggatacctctg480
tatcggtggeigattaaaattgg柳t柳attgaaactgtccgcttcttccactcctaca540
aa^gaggagttgatcgggtcttcgtggatcatccaatgttccttg3gaaggtatggggca600
aaactggatcggCCC肌g3gcaggtttggattaccaggacaacc犯ctgc660
gatttagcttgttatgccttgctgctctggaggcaccgagagttctg3ac720
gcaa^atttctcaggaccct3CggELgEL3g認(rèn)gttgccttcattgccaacgactggcaca780
ctgctctgcttccatgttatcta^a^gcceitttaccaacctatggggatttacei犯cEicg840
ccaaggttgccttttgcatccacaacattgceitatcagggaagatttgccttctcagact900
tcccacgacttaatctgccegataaattcei犯agctcttttgactttatcgatgggteitg960
agaagcccgtg肌gggaaggggatg犯ggccgggatattggaatcagaca1020
gggttttgactgtgagcccatactatgcccaagaagtcatctxtggagttg犯卿ggcg1080
tcgagctggataacttcattcgtaaaactggcattgctggtattataaatggcatggacg1140
tccaggagtggaatcctgttacattgaicatccactacgatgccacaactg1200
ttatggacgcaaaacctttgttg犯ggaagcccttcaagc柳ElgtCgg3ttgcctgttg1260
ataggaa^gttcctttgataggcttcattggtagattagaagagcag卿ggttcagata1320
tttttgttgcagctatttcccaattggttg犯cac犯tgtgcagatagtaatccttggaa1380
ctggcaaaaeLgaaatttg￡igaagcagattgagcatctggaggttttgt3Ccctgacaagg1440
caagaggagttgcaaaattcaatgtgccgttggcgceLcatgatcacagctggtgctgact1500
ttatgctggttcc犯gtagatttgagccctgtggtctcattcagttgcatgctatgcgat1560
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eicac3ggattcc肌atgggggCCttgC3tgttgaatgtgac犯a^t tgattcagcagatg1680
tagctgcgatagttaaaactgtggcaagagctcttggcacttatgctaccgctgcattaa1740
gagaaatgatcctgaattgcatggccc犯gacttgtcatggaagggaccagcc柳atgt1800
gctcctggacctggcagcg33CCtggC3Ctg33gggg3gg1860
agatcgctcctcttgctaaggagaacgttcccacgccttg1920
19tcttgacggt gtag333tat attccagtag gctagtctgc atgatttctt tgtgaagggt acgtattaca gcctttgcct asaaaaaa
tgacstttat ggatatacgt t貼cgcgcag 3taaatatcc 1980 tgggatcaaa ggcacccttt gtttttctat tccaacggcc 2040 gaatggtgtc tgaatcagtg ttaaagagaa tttacaacta 2100 ggcgttatgt gcgtaaataa aggttcstct tctgaca犯a 2160
2168
<210〉 <211〉 <212〉 <213>
2
71 DNA
人工序列
<220> <221〉 <223〉
misc—feature 寡核苷酸
<柳> 2
gtactatagt attttggtac cttttacaat cggttttttt accttttctt ctttatttat 60 taaatt"tat3 g 71
20
權(quán)利要求
1.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是(a)如SEQ ID NO1中第(1371±10)～(1570±10)位所示的核苷酸序列；(b)與(a)限定的序列基本上互補(bǔ)的序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸是如 SEQIDNO: 1中第(1371 ±5) (1570±5)位所示的序列。
3. 權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸的用途，其特征在于，用于制備降低植 物中直鏈淀粉含量的構(gòu)建物。
4. 一種構(gòu)建物，其特征在于，所述構(gòu)建物含有式(I)所示的結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 2</formula>Seq正^為權(quán)利要求l或2所述的多核苷酸，S叫^為與Seqn^基本上互補(bǔ)的多核 苷酸；X為位于S叫^和SeqM之間的間隔序列，并且所述間隔序列與S叫正A和S叫反 向不互補(bǔ)。
5. 如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建物，其特征在于，式(I)所示的結(jié)構(gòu)在轉(zhuǎn)入植物 細(xì)胞后，形成式(II)所示的二級(jí)結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 2</formula>式(II)中，Seq正向、Seq反向和X的定義如上述， II表示在Seq，和Seq^之間的基本上互補(bǔ)的關(guān)系。
6. 如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建物，其特征在于，所述的間隔序列本身不構(gòu)成 互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)，其長(zhǎng)度是在50-90bp;在一優(yōu)選例中，所述的間隔序列具有SEQIDNO:2所示的序列。
7. —種載體，其特征在于，所述的載體含有權(quán)利要求4-6任一所述的構(gòu)建物。
8. 權(quán)利要求4-6任一所述構(gòu)建物的用途，其特征在于，用于導(dǎo)入到植物中， 抑制顆粒結(jié)合型淀粉合成酶I表達(dá)，從而抑制植物中直鏈淀粉的合成。
9. 一種降低植物中直鏈淀粉含量的方法，其特征在于，所述方法包括將 權(quán)利要求4-6任一所述的構(gòu)建物或權(quán)利要求7所述的載體轉(zhuǎn)染到植物中。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括(1) 提供攜帶權(quán)利要求4-6任一所述的構(gòu)建物或權(quán)利要求7所述的載體的農(nóng) 桿菌；(2) 將植物細(xì)胞、組織或器官與步驟(l)中的農(nóng)桿菌接觸，從而使所述構(gòu)建 物轉(zhuǎn)入到植物細(xì)胞、組織或器官；和(3) 選擇出轉(zhuǎn)入所述構(gòu)建物的植物細(xì)胞、組織或器官，再生成植株。
全文摘要
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)塊根植物淀粉組成的方法及物質(zhì)。本發(fā)明公開(kāi)了在被導(dǎo)入植物后可被加工成特異性干擾顆粒結(jié)合型淀粉合成酶I(GBSSI)表達(dá)的多核苷酸構(gòu)建物，基于小分子RNA干擾技術(shù)來(lái)干擾GBSSI基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)節(jié)植物中淀粉組成的目的，為改變植物淀粉品質(zhì)提供了全新的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/11GK101665786SQ20081004254
公開(kāi)日2010年3月10日 申請(qǐng)日期2008年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月5日
發(fā)明者鵬 張, 趙姍姍 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院