專利名稱：：β-瓊膠酶高產(chǎn)發(fā)酵生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種突變弧菌發(fā)酵生產(chǎn)瓊膠酶的工藝條件，主要是確定紫外誘變方法篩選獲得的高產(chǎn)瓊膠酶菌株具有工業(yè)化生產(chǎn)前景的發(fā)酵培養(yǎng)條件。
背景技術(shù)：
：瓊膠(瓊脂)由瓊脂糖(agarose)和瓊脂膠(a-garopectin)組成，瓊脂糖是由(1—3)-O—13D-半乳糖和(1—4)-0-3，6-內(nèi)醚-a-L-半乳糖交替組成的線形鏈狀分子；瓊脂膠由復(fù)雜的長短不一的半乳糖殘基的多糖鏈組成，其中包含有多種取代基如硫酸基、甲基等，對于其結(jié)構(gòu)的具體細(xì)節(jié)還不是很清楚。天然瓊膠主要存在于某些海藻的細(xì)胞壁中，瓊膠酶能夠水解瓊膠多糖，制備一定聚合度、具有多種生理活性功能的瓊膠低聚糖；在這些海藻的單細(xì)胞分離、酶解破壁制備原生質(zhì)體等過程中具有重要的使用價值，是一種海藻遺傳工程的工具酶；同時，瓊膠酶可以降解瓊脂凝膠回收膠體中的DNA、RNA，在分子生物學(xué)研究中多有應(yīng)用；用瓊膠酶水解某些海藻的多糖，可以根據(jù)測定其水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而推測多糖的結(jié)構(gòu)，用于多糖的結(jié)構(gòu)研究中。Sugano根據(jù)瓊膠酶降解瓊脂糖的作用方式不同，而把它們分為兩類a-瓊膠酶(EC3.2.1._)，作用于瓊脂糖的a(1—3)糖苷鍵，產(chǎn)物為瓊膠寡糖，以3，6_內(nèi)醚-a_L_半乳糖作為還原性末端；P-瓊膠酶(EC3.2.1.81)水解D-半乳糖殘基和3，6_內(nèi)醚-a-L-半乳糖殘基之間的13(1—4)糖苷鍵，產(chǎn)生的瓊膠寡糖以D-半乳糖殘基作為還原性末端。瓊膠酶主要通過海洋微生物得到。1902年Groleau第1次從海水中分離到能分解瓊膠的細(xì)菌-瓊膠假單胞菌。從那以后人們已經(jīng)從海水系統(tǒng)中分離到了多種瓊膠分解菌，包括Pseudomonas(假單胞菌屬)、Pseudoalteromonsa(假別單胞菌屬)、Str印t-omyces(鏈霉菌屬)、Alteromonas(另U單胞菌屬)、Microscilla、Vibrio(弧菌屬)、Cytophaga(噬細(xì)胞菌屬)等。如Leon(1992)分離出了一株別單胞菌，Araki(1998)等分離出了一株高產(chǎn)瓊膠酶的弧菌并純化了胞外酶；杜宗軍(2002)等分離出了兩株塔式弧菌；褚艷等(2003)分離出了一株假單胞菌，并進(jìn)行了培養(yǎng)條件優(yōu)化。除微生物，瓊膠酶還可以從一些以海藻為食的海洋動物的腸道中分離得到，吳永沛等(2002)采用(朋4)2504分段鹽析和葡聚糖柱層析存化技術(shù)，從九孔鮑內(nèi)臟器官中提取存化了瓊膠酶。除此以外，一些非海洋產(chǎn)生瓊膠酶的菌株被發(fā)現(xiàn)，包括從淡水中分離到的Cytophagasp.(噬細(xì)胞菌)和Alteromonassp.(別單胞菌)，從土壤中分離到的Bacillussp.(枯草桿菌)、Cytophagasp.(噬細(xì)胞菌)以及Str印to-mycescoelicolor(鏈霉菌)，Hofsten(1975)從廢水中分離到了一株能降解瓊脂的革蘭氏陰性菌(未鑒定)。而且還有報導(dǎo)，在植物的根圍中也存在著能產(chǎn)生瓊膠酶的菌株。迄今為止，已有幾十種不同的瓊膠酶得到了分離純化，并對部分瓊膠酶基因進(jìn)行了克隆表達(dá)，但實現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的卻只有從大西洋假單孢菌(Pseudomonasatlantica)中分離的13-瓊膠酶并且價格昂貴，隨著新的瓊膠降解菌的不斷發(fā)現(xiàn)和高活性、高表達(dá)的瓊膠酶研究不斷深入，利用瓊膠酶降解得到大量低分子質(zhì)量的具有活性功能的瓊寡糖，將3具有更廣闊的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的對從海水中分離得到的具有較強(qiáng)瓊膠酶產(chǎn)酶能力的弧菌屬細(xì)菌VB-3進(jìn)行紫外誘變選育，分離篩選產(chǎn)酶活性高、性狀穩(wěn)定、易培養(yǎng)的瓊膠酶產(chǎn)生菌種，解決發(fā)酵生產(chǎn)瓊膠酶的關(guān)鍵菌種問題。由于不同的瓊膠酶產(chǎn)生菌株的培養(yǎng)條件各不相同，各種因素如培養(yǎng)基的組成、培養(yǎng)溫度、起始PH值、培養(yǎng)時間都對產(chǎn)酶具有很大的影響。本發(fā)明以提高菌株的產(chǎn)酶活力為目的，確定了誘變選育的P_瓊膠酶高產(chǎn)菌株的最佳培養(yǎng)基組成和最佳產(chǎn)酶條件。本發(fā)明所解決的問題是確定了一種突變選育的瓊膠酶高產(chǎn)菌株的發(fā)酵工藝條件，使其具有工業(yè)化應(yīng)用前景。本發(fā)明采用的技術(shù)路線和工藝步驟包括(1)瓊膠酶高產(chǎn)菌株的誘變和篩選本發(fā)明從近海海水中分離篩選產(chǎn)瓊膠酶的菌株，以瓊膠作為唯一碳源，2216E培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，比較分離菌株產(chǎn)生瓊膠酶的活力，在產(chǎn)生瓊膠酶的菌落周圍形成透明圈，培養(yǎng)基呈釜底形凹陷，該特征作為菌種初篩的依據(jù)。樣品中高產(chǎn)菌株的數(shù)量較少，為防止被漏篩，采用選擇培養(yǎng)基多次富集培養(yǎng)，使高產(chǎn)菌株在數(shù)量上占優(yōu)勢，從而提高篩選的效果。對初篩的高產(chǎn)菌株采用紫外照射的方法進(jìn)行誘變，將照射后的菌液培養(yǎng)后，稀釋涂布于平板上進(jìn)行初篩，挑選生長快、透明圈大的菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基中，進(jìn)行復(fù)篩。挑選經(jīng)UV誘變的菌落發(fā)酵培養(yǎng)后，測定其產(chǎn)瓊膠酶的能力，與出發(fā)菌株相比，產(chǎn)酶能力明顯提高的菌株作為復(fù)選菌株。將復(fù)篩得到的瓊膠酶高產(chǎn)菌株進(jìn)行平板自然分離后，進(jìn)行連續(xù)傳代10次的實驗，分別測定各代菌株的酶活性并檢驗其產(chǎn)物產(chǎn)量的穩(wěn)定性，得到具有遺傳穩(wěn)定性的瓊膠酶高產(chǎn)菌株VB304。(2)突變高產(chǎn)菌株的斜面培養(yǎng)突變選育的高產(chǎn)菌株斜面培養(yǎng)基的組成為蛋白胨0.2-0.6%，酵母膏0.08-1.0%，磷酸高鐵0.01%，瓊膠1.0-3.0%，NaCl1.0_3.0%，其余為水。(3)突變高產(chǎn)菌株的種子培養(yǎng)斜面培養(yǎng)保藏的菌種在以下種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下?lián)u瓶發(fā)酵搖瓶種子培養(yǎng)基的組成瓊膠2.0-3.0%。，酵母膏0.2-0.5%，NH4C10.5_1.5%。，K2HP040.8-1.5%0，NaCl1.0-3.0%，pH7.5-8.5。搖瓶培養(yǎng)條件溫度20-30。C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm;裝量25-50ml/250ml或100-125ml/750ml。菌株經(jīng)搖瓶培養(yǎng)后，所得的培養(yǎng)液經(jīng)4t:，5000r/min離心30分鐘，收集上清液作為粗酶液用于酶活的測定。瓊膠酶活力測定用pH7.0的KH2P04-NaOH緩沖液配制0.5%的瓊膠溶液20mL作為反應(yīng)底物，加入lmL待測酶液，30°C150r/min振蕩反應(yīng)30min，用DNS法測定反應(yīng)液中還原糖的生成量。4l個酶活力單位(U)定義為在上述反應(yīng)條件下，每分鐘產(chǎn)生lPg還原糖(以D-半乳糖計)所需要的酶量。(4)突變高產(chǎn)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化本發(fā)明通過利用單因素實驗確定培養(yǎng)基中的碳源、氮源和無機(jī)鹽突變菌株產(chǎn)酶能力的影響研究，利用正交實驗最終確定培養(yǎng)基的最佳組成和配比。不同溫度條件、不同發(fā)酵起始pH條件、不同通氣量對產(chǎn)酶能力影響的研究以及不同發(fā)酵時間酶活力的大小等試驗，確定突變高產(chǎn)菌株的優(yōu)化發(fā)酵條件。確定的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為瓊膠1.0-3.0%。，酵母膏0.1-0.2%。，NH4C10.5-1.5%。，K2HP040.8-1.5%0，NaCl1.0-2.0%。發(fā)酵培養(yǎng)條件發(fā)酵溫度范圍20-3(TC，最佳發(fā)酵溫度范圍20_25°C;發(fā)酵起始pH范圍7.0-8.5，最佳發(fā)酵pH范圍7.8-8.2;發(fā)酵培養(yǎng)時間16-40h，最佳培養(yǎng)時間20-24h。(5)按照常規(guī)方法，對發(fā)酵培養(yǎng)液中的瓊膠酶進(jìn)行富集和分離純化。具體實施例方式本發(fā)明的具體內(nèi)容可參照下列實施例，但實施例不以任何形式限制本發(fā)明。實施例1瓊膠酶產(chǎn)生菌株的篩選從海洋中收集的海水分散在含有1.5%瓊脂的培養(yǎng)基平皿中，培養(yǎng)基的組成為蛋白胨5g，酵母膏l(xiāng)g，磷酸高鐵O.lg，瓊脂15g，NaCl20g，加水稀釋為1000ml。25。C培養(yǎng)后，在產(chǎn)生瓊膠酶的菌落周圍形成透明圈，培養(yǎng)基呈釜底形凹陷，該特征作為菌種初篩的依據(jù)。篩選到的菌株經(jīng)顯微鏡觀察，菌體呈彎曲弧狀，極生單根鞭毛；實驗檢查為革蘭氏陰性菌，氧化酶陽性，過氧化氫酶陽性，0/129試驗陽性，利用葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，根據(jù)以上特征初步將其鑒定為弧菌屬(Vibrio)。該菌在平板上生長，能夠大量分泌胞外酶降解瓊膠，在菌落周圍形成凹陷的透明圈。用Lugol氏碘液覆蓋菌落周圍，透明圈內(nèi)的瓊膠因被降解而不能著色，透明圈外的瓊膠與碘結(jié)合呈深黃色。篩選的菌株在50%的甘油中-S(TC保存。實施例2瓊膠酶產(chǎn)生菌株的誘變先打開接種室紫外線燈(30W)預(yù)熱10min，取制備好的菌懸液5ml移入直徑為90mm的無菌培養(yǎng)皿中，放入無菌磁力攪拌棒，置于磁力攪拌器上，距離波長254nm紫外燈下30cm處打開皿蓋邊攪拌邊照射，劑量分別為15min。將照射后的菌液培養(yǎng)4h后，取不同照射時間的菌懸液lml，進(jìn)行10—'、10—2、10—3、10—4、10—5、10—6和10—7梯度稀釋，取10—3、10—5、和10—7濃度的稀釋液各lml涂布于分離平板上，涂布于平板上進(jìn)行初篩，挑選生長快、透明圈大的菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)2d后，進(jìn)行復(fù)篩。挑選經(jīng)UV誘變的菌落發(fā)酵培養(yǎng)，測定其產(chǎn)瓊膠酶的能力，與出發(fā)菌株相比，產(chǎn)酶能力明顯提高的菌株作為復(fù)選菌株，再從中挑選8個產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌落在平板上反復(fù)傳代，進(jìn)行連續(xù)傳代10次的實驗，分別測定各代菌株的酶活性并檢驗其產(chǎn)物產(chǎn)量的穩(wěn)定性，進(jìn)一步發(fā)酵篩選，復(fù)篩后獲1株瓊膠酶產(chǎn)量較高的突變菌株VB304。實施例3突變高產(chǎn)菌株的種子培養(yǎng)和5L發(fā)酵罐培養(yǎng)1.種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基的組成瓊膠2.0%。，酵母膏0.3%，NH4C11.0%。，K2HP040.1%，NaCll.0%，pH8.0。溫度25°C;搖床轉(zhuǎn)速150rpm;裝量30ml/250ml。2.發(fā)酵培養(yǎng)取種子培養(yǎng)的菌種接種于5L發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)，菌種的接種量為8%，發(fā)酵培養(yǎng)基量為2L。發(fā)酵培養(yǎng)基組成為瓊膠2.0%。，酵母膏0.1%，NH4C11.0%。，K2HP040.12%，NaCl1.0%，pH8.0。發(fā)酵溫度25°C;發(fā)酵起始pH值8.0;發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速150rpm;發(fā)酵培養(yǎng)時間24h。3.采用常規(guī)方法，從發(fā)酵液中分離富集瓊膠酶。采用以上描述瓊膠酶的活力測定方法進(jìn)行檢測，在此條件下，突變菌株VB304的發(fā)酵產(chǎn)酶活力為206U/ml。實施例4變高產(chǎn)菌株75L發(fā)酵罐培養(yǎng)采用與實施例3相同的方法，種子培養(yǎng)的裝液量為100ml/750ml，發(fā)酵培養(yǎng)的裝液量為30L/75L。發(fā)酵培養(yǎng)基的組成瓊膠3.0%。，酵母膏0.08%，NH4C11.1%。，K2HP041.0%。，NaCl2.0%，pH8.0。在此條件下，突變菌株VB304的發(fā)酵產(chǎn)酶活力為188U/ml。實施例5不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)酶能力的影響分別以瓊脂、葡萄糖、淀粉、蔗糖為唯一碳源，按照2%。的比例加入到合成培養(yǎng)基中，測定發(fā)酵培養(yǎng)液中的酶活力大小。表1為不同碳源培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)液中酶活力的大小。表l.不同碳源對酶活的影響碳源發(fā)酵產(chǎn)酶活力(u/邁i)瓊脂206葡萄糖86.7淀粉80.9蔗糖36.0菌體可在其他碳源培養(yǎng)基中生長，但產(chǎn)酶能力降低。以瓊脂為唯一碳源可獲得高產(chǎn)酶活力。實施例6不同氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶能力的影響6本發(fā)明分別選用濃度為2.0%。的銨鹽及硝酸鹽等無機(jī)氮源，蛋白胨、酵母膏、豆粉等有機(jī)氮源加入到合成培養(yǎng)基中，測定發(fā)酵培養(yǎng)液中的酶活力大小。結(jié)果如表2所示。表2.不同氮源對酶活的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>單獨(dú)采用硫酸銨為無機(jī)氮源發(fā)酵過程中pH有變化；加入酵母膏或蛋白胨則可以加快菌株的生長，提高產(chǎn)酶的活力。因考慮到發(fā)酵過程中pH的變化規(guī)律，試驗中采用酵母膏與氯化銨混合配比的方法作為發(fā)酵氮源?；旌吓浔鹊磳Πl(fā)酵影響結(jié)果見表3。表3.混合氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響氮源發(fā)酵產(chǎn)酶活力(U/ml)起始pH終止pH<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>[oo73]由此，添加酵母膏與氯化銨混合配比為i:i的氮源，可以提高產(chǎn)酶活力，調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中pH基本不發(fā)生變化。實施例7NaCl對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響選擇不同濃度的NaCl添加到合成培養(yǎng)基中，測定不同NaCl濃度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見表4。表4.NaCl對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>該突變菌株在NaCl濃度范圍0.5-3.OX內(nèi)都具有較高的產(chǎn)酶活力，顯示其對NaCl的耐受較好，但濃度增大，對菌體的產(chǎn)酶活力有抑制。NaCl的最佳濃度范圍為1.0-2.0%。實施例8不同無機(jī)鹽對突變菌株產(chǎn)酶的影響本發(fā)明在合成培養(yǎng)基中分別添加濃度為1.0%。的K2HP04、CaCl2、KCl、MgS04等常用的無機(jī)鹽，測定不同無機(jī)鹽對突變菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。結(jié)果見表5。表5.不同無機(jī)鹽對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響無機(jī)鹽發(fā)酵產(chǎn)酶活力(U/ml)K2HP04206CaCL65.9MgS0482.4KC1144.2因此，發(fā)酵中添加K2HP04為主要的無機(jī)鹽成分。實施例9不同培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響本發(fā)明分別在20、25、30、35、40。C條件下培養(yǎng)24h，測定發(fā)酵液中的酶活力大/」結(jié)果見表6。表6.不同培養(yǎng)溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響發(fā)酵溫度('c)2025303540發(fā)酵產(chǎn)酶活力(U/ml)193.5216.2188.6153.6124.0此突變菌株在20-3(rC，發(fā)酵產(chǎn)酶活力較高，25。C時產(chǎn)酶的活力最高。溫度升高，酶活力逐漸下降。實施例10不同培養(yǎng)時間對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響在已經(jīng)確定的優(yōu)化合成培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件下，取不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液測定酶活力的大小，確定發(fā)酵時間。不同發(fā)酵時間測定的酶活力大小結(jié)果見表7。表7.發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響發(fā)酵時間(h)101620243040發(fā)酵產(chǎn)酶活力(U/ml)93.5117.3188.6216.6164.0138.1發(fā)酵10h后菌體生長累集的酶活力不斷升高，發(fā)酵時間24h時酶活力增加到最大值。保藏日期2008.10.9保藏單位全稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心8簡稱CGMCC保藏編號269權(quán)利要求一種β-瓊膠酶產(chǎn)生菌——弧菌的誘變選育高產(chǎn)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)工藝，其特征在于包括以下步驟A.瓊膠酶高產(chǎn)菌株的誘變和篩選；B.對A步驟篩選出的高產(chǎn)菌株進(jìn)行斜面培養(yǎng)和菌種保存；C.對B步驟獲得的高產(chǎn)菌株進(jìn)行搖瓶種子培養(yǎng)；D.以C步驟培養(yǎng)的種子接種進(jìn)行高產(chǎn)菌株的發(fā)酵培養(yǎng).2.按照權(quán)利要求1所述工藝步驟B中，斜面培養(yǎng)基的組成為蛋白胨0.2-0.6%，酵母膏0.08-0.1%，磷酸高鐵0.01%，瓊膠1.0-3.0%，NaCl1.0_3.0%，其余為水。3.按照權(quán)利要求1所述工藝步驟C中，搖瓶種子培養(yǎng)基的組成為瓊膠2.0-3.0%。，酵母膏0.2-0.5%，NH4C10.5-1.5%。，K2HP040.8—1.5%。，NaCl1.0—3.0%，pH7.5—8.5。4.按照權(quán)利要求1所述工藝步驟C和權(quán)利要求3中的培養(yǎng)基組成，種子培養(yǎng)的條件為溫度20-30。C，搖床轉(zhuǎn)速150rpm;裝量25_50ml/250ml或100-125ml/750ml。5.按照權(quán)利要求1所述工藝步驟D中，發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為瓊膠1.0-3.0%。，酵母膏0.1-0.2%0，NH4C10.5-1.5%0，K2HP040.8-1.5%0，NaCl1.0-2.0%。6.按照權(quán)利要求1所述工藝步驟D中，發(fā)酵培養(yǎng)的條件為發(fā)酵溫度范圍20-3(TC，最佳發(fā)酵溫度范圍20-25°C;發(fā)酵起始pH范圍7.0-8.5，最佳發(fā)酵pH范圍7.8_8.2;發(fā)酵培養(yǎng)時間16-40h，最佳培養(yǎng)時間20-24h。全文摘要本發(fā)明涉及一種β-瓊膠酶產(chǎn)生菌——弧菌的突變選育菌株發(fā)酵生產(chǎn)瓊膠酶的工藝條件，提供了誘變選育高產(chǎn)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)工藝和優(yōu)化培養(yǎng)條件。本發(fā)明確定了該菌株的斜面培養(yǎng)基組成、種子培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件以及發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，發(fā)酵產(chǎn)酶的能力達(dá)到180U/ml以上，采用常規(guī)分離純化方法可制備高活性β-瓊膠酶，提供了一種具有工業(yè)化轉(zhuǎn)化前景的瓊膠酶生產(chǎn)工藝。文檔編號C12R1/63GK101717760SQ200810167519公開日2010年6月2日申請日期2008年10月9日優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日發(fā)明者張春穎申請人:四川開陽科技有限公司